我国传统酿造食醋主要以糯米、高粱或甘薯等淀粉含量较高的粮谷类为原料，采用多菌种天然开放式发酵工艺酿造而成，具有独特的风味。陈酿具有柔和醋液酸感，增加产品风味品质的作用，是传统食醋生产过程中必要的一道工序。在天然陈酿过程中，醋液里会不断产生一类膏状沉淀物，被称为醋膏、醋脚、醋泥等。也有企业将醋液在高温下进行浓缩，从而加速醋膏形成与提高醋膏出率。在中医药领域，醋膏则主要是指利用食醋炮制中药材后形成的膏剂。
与食醋受微生物污染后可能产生的黏性沉淀不同，醋膏不仅具有良好的醋香风味、入口融化的口感，而且对人体具有一定的保健功效。日本学者对传统黑醋kurozu的醋膏进行了较为全面的评价，发现其具有抗肿瘤[1-2]，降血糖[3]，降血脂[4-5]，抗过敏[6-7]，抗结肠炎[8]，抗血栓[9]，抗骨质疏松[10]，等活性。醋膏在我国民间具有长期的服用历史，但是对其药理研究尚不深入。2015年刘兰涛等[11]发现山西老陈醋醋泥冻干粉对高脂饮食小鼠具有显著的降血脂和抗氧化作用，这种有益作用可能归功于其含有的多糖、类黑精、多肽、膳食纤维、总多酚、总黄酮和川芎嗪等活性物质。
本研究对谷物醋醋膏的多糖含量及其单糖组成、多肽含量及其氨基酸组成进行分析，并将其与醋液中乙醇沉淀出来的大分子物质进行比较，从而明确醋膏中多糖和多肽类生物大分子的组成，以及明确其与醋液中多糖和多肽之间的区别，探讨构效关系，以期为促进醋膏资源的开发利用奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
谷物醋样品取自国内某传统食醋酿造企业，已在储罐中陈酿2个月，总酸为6.7 g/100 mL。将谷物醋10 000 r/min离心10 min后取上清作为醋液，离心后的沉淀与谷物醋储罐中的沉淀合并为湿醋膏。
氨基酸混合标准溶液等购买自美国Sigma公司；岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖等11种单糖标准品、邻苯二甲酸氢钾等购买自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
高速冷冻离心机(CR21)，株式会社日立制作所；酶标仪(SpectraMax M2e)，上海美谱达仪器有限公司；pH台式仪(Orion 410P-01A)，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；高效液相色谱仪(Agilent 1260)，美国安捷伦公司；离子色谱仪(ICS-5000)，美国戴安公司。
1.3 实验方法
1.3.1 醋液醇提物的制备
在醋液中缓慢加入3倍体积的无水乙醇(乙醇体积分数75%[12])，4 ℃平衡2 h后经过离心分离沉淀，50 ℃烘干后计算得率。
1.3.2 水分的分析
参照《食品中水分的测定GB 5009.3—2010》测定湿醋膏和醋液醇沉物的水分含量[13]。
1.3.3 多糖含量及其组成分析
采用苯酚硫酸法测定醋膏及醋液醇沉物中的粗多糖含量[14]。采用修改后的离子色谱法分析醋膏及醋液醇沉物中的单糖组成[15]。在醋膏及醋液醇沉物加入5 mL 2 mol/L HCl溶液，96 ℃水浴提取5～6 h，再加入一定体积的5 mol/L NaOH溶液中和并定容至10 mL，12 000 r/min离心10 min。将上清稀释一定倍数，用0.45 μm微孔滤膜过滤后进样分析。以岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖共11种单糖为标准品。采用CarboPac PA20分离，用脉冲安培法检测，流速为0.5 mL/min。流动相A为水，B为250 mmol/L NaOH，C为1 mol/L NaAc，程序如下：0～21 min，97.4% A，2.6% B；21～30 min，97.4%～92.4% A，2.6% B，5%～20% C；30～50 min，20% A，80% B。
1.3.4 多糖中硫酸基含量的测定
采用氯化钡明胶比浊法[16]测定醋膏与醋液多糖中的硫酸基含量。
1.3.5 多肽含量及其水解氨基酸组成分析
参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》测定醋膏及醋液醇沉物中的粗多肽含量[17]。用柱前衍生化反向高效液相色谱法(RP-HPLC)对醋膏及醋液醇沉物中多肽的氨基酸组成进行分析[18]。取一定量醋膏、醋液醇沉物，加8 mL 6 mol/L HCl，充氮气后封管，120 ℃水解22 h，于25 mL容量瓶中加入一定体积10 mol/L的NaOH溶液进行中和定容，双层滤纸过滤，10 000 r/min离心10 min，取400 μL上清液进行HPLC测定。色谱柱采用Agilent Hypersil ODS柱(5 μm，4.0 mm×250 mm)，柱温为40 ℃，检测波长338 nm/262 nm。流动相A(pH 7.2)：27.6 mmol/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃(体积比500∶0.11∶2.5)，流动相B(pH 7.2)：80.9 mmol/L醋酸钠-乙醇-乙腈(体积比1∶2∶2)，洗脱程序为：0 ～17 min，8%～50% B；17～20 min，50%～100% B；20～24 min，100%～0% B。
用必需氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系数(RC)及氨基酸比值系数分(SRC)，对醋膏和醋液醇沉物的水解氨基酸组成特性进行评价[19]。具体计算如式(1)、式(2)、式(3)：
(1)
(2)
SRC=100-CV×100
(3)
式中：CV为RC的变异系数，CV=各种必需氨基酸RC的标准偏差/各种必需氨基酸RC的平均值。
1.4 数据统计分析
本研究中每个样品重复测定3次，并利用Excel软件计算平均值及标准差。
2 结果与分析
2.1 醋膏、醋液醇沉物的得率
从食醋样品中离心分离获得醋膏的湿重为(1.0±0.1)g/100 mL，干燥后醋膏干重为(0.4±0.0)g/100 mL，水分含量为63.0 g/100 g。经过离心后获得的醋液进行乙醇沉淀，获得的醇沉物湿重为(6.9±0.2)g/100 mL，干燥后的重量为(4.0±0.1)g/100 mL，水分含量为41.8 g/100 g。
2.2 多糖、多肽含量的测定
醋膏和醋液醇沉物中的粗多糖含量分别为(14.0±0.5)g/100 g和(42.5±0.8)g/100 g。经换算，每100 mL食醋的醋膏中含有0.05 g粗多糖，醋液醇沉物中含有1.70 g粗多糖。
醋膏和醋液醇沉物中的粗多肽含量分别为(53.4±0.7)g/100 g和(30.5±0.0)g/100 g，经换算，每100 mL食醋的醋膏中含有0.2 g多肽，醋液醇沉物中含有1.2 g 粗多肽。
醋膏和醋液醇沉物中多肽和多糖的相对含量总和分别为67.4 g/100 g和73.0 g/100 g(图1)，说明多肽和多糖均是醋膏中的主要成分。醋膏中多肽与多糖的比值(3.8)显著高于醋液醇沉物中多肽与多糖的比值(0.7)(P<0.05)(图1)，提示食醋中多肽类物质在醋膏自然形成过程中相对于多糖类物质更容易沉淀析出。
图1 醋膏及醋液醇沉物中多糖、多肽含量
Fig.1 Contents of crude polysaccharides and polypeptides in
vinegar sediment and vinegar ethanol precipitate
2.3 单糖组成分析
醋膏及醋液醇沉物粗多糖中的单糖组成分析结果如图2所示。醋膏及醋液醇沉物的粗多糖均由6种单糖组成，但是单糖组成比例具有差异。醋膏粗多糖中单糖的相对峰面积大小为葡萄糖(33.3%)>氨基葡萄糖(27.4%)>木糖(17.1%)>半乳糖(9.9%)>阿拉伯糖(9.4%)>甘露糖(2.9%)，而醋液醇沉物多糖中的单糖相对峰面积大小为木糖(31.3%)>葡萄糖(24.8%)>阿拉伯糖(19.8%)>半乳糖(12.6%)>甘露糖(8.4%)>氨基葡萄糖(3.2%)。与醋液醇沉物相比，醋膏多糖中氨基葡萄糖相对含量明显更高。
a-醋膏; b-醋液醇沉物
图2 醋膏及醋液醇沉物的单糖组成
Fig.2 Monosaccharide compositions of vinegar
sediment and vinegar ethanol precipitate
2.4 多糖硫酸基含量分析
醋膏和醋液多糖中硫酸基含量分别为(2.64±0.17)%和(0.30±0.02)%。多糖的生物活性与其物理化学性质密切相关，如分子大小、单糖类型和比率以及糖苷结构特性等。近年来多糖的化学分子修饰尤其是硫酸化修饰引起了研究者的极大兴趣，许多研究证明硫酸多糖具有显著的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗凝血等活性，对机体免疫系统有一定调控作用[20]。
2.5 水解氨基酸组成分析
醋膏和醋液醇沉物的粗多肽中均检出17种氨基酸，总量分别为30.1 g/100 g和10.8 g/100 g(表1)。醋膏和醋液醇沉物的粗多肽中必需氨基酸有7种，非必需氨基酸有10种，必需氨基酸分别占氨基酸总量的27.4%和19.5%。醋膏的谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、甘氨酸相对含量最高，占氨基酸总量的50.9%。醋液醇沉物中多肽的谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸的相对含量丰富，三者占氨基酸总量的51.4%。
从风味贡献进行分类，氨基酸主要可分为鲜味，甜味和苦味三类[21]。醋膏多肽水解氨基酸中甜味氨基酸(脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、苦味氨基酸(精氨酸、组氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、鲜味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)占氨基酸总量分别为31.4%、34.2%和33.5%，与醋液醇沉物的水解氨基酸相似(31.8%、29.1%和38.2%)(表1)。
亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸属于支链氨基酸，可作为机体的能量来源，能通过被肝、心肌、骨骼肌、脑等摄取供能[22-23]。同时，缬氨酸是生糖氨基酸，亮氨酸是生酮氨基酸，异亮氨酸是生糖兼生酮氨基酸，它们在体内可通过三羧酸循环相互转化，使糖、蛋白质、脂肪代谢三者相互联系[24]。醋膏多肽的水解氨基酸中支链氨基酸占总氨基酸含量的15.9%，高于醋液醇沉物中的多肽(7.7%)(表1)。
表1 醋膏与醋液多肽的氨基酸组成 单位：g/100 g
Table 1 Amino acid compositions of vinegar sediment and vinegar ethanol extract
氨基酸醋膏醋液醇沉物Glu7.22±0.142.73±0.07Pro2.87±0.030.57±0.02Asp2.87±0.041.42±0.07Gly2.37±0.081.43±0.03Ala2.06±0.010.87±0.02Arg1.43±0.020.67±0.03Ser1.28±0.050.22±0.03His0.81±0.030.52±0.05Tyr0.69±0.050.20±0.03Cys0.27±0.020.10±0.02*Leu1.86±0.020.26±0.03*Val1.70±0.090.39±0.02*Lys1.26±0.060.66±0.03*Ile1.22±0.020.20±0.02*Phe1.19±0.060.22±0.04*Thr0.89±0.010.35±0.02*Met0.13±0.010.04±0.00氨基酸总量(TAA)30.1210.86必需氨基酸(EAA)8.242.12非必需氨基酸(NEAA)21.878.74EAA/TAA/%27.3719.51EAA/NEAA/%37.6924.24支链氨基酸(BCAA)4.780.84BCAA/TAA/%15.867.74
注：*,必需氨基酸；表中数据为100 g干物质中氨基酸的质量;EAA/TAA,必需氨基酸占氨基酸总量的比例；EAA/NEAA，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值；BCAA/TAA，支链氨基酸占总氨基酸的比例。
FAO/WHO根据氨基酸组成平衡理论，提出了必需氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系数(RC)及比值系数分(SRC)的分析指标(表2)。RAA表示一定量食物中某必需氨基酸的含量相当于模式氨基酸的多少倍。RC表示与模式氨基酸相当量的一份食物氨基酸的比值，数值RC最低的氨基酸为该食物的第一限制氨基酸，数值RC大于或者小于1都表示偏离氨基酸模式，RC>1表示该氨基酸相对过剩，RC<1表示该氨基酸相对不足。根据分析结果，醋膏的第一限制氨基酸为甲硫氨酸(表2)。SRC主要是评价各种必需氨基酸的氨基酸分之间的接近程度，样品的SRC越接近100，营养价值越高。本实验中，醋膏多肽水解氨基酸的SRC比醋液醇沉物更接近于100，说明其营养价值相对更高。
表2 醋膏和醋液的氨基酸比值、氨基酸比值系数、
氨基酸比值系数分
Table 2 RAAs, RCAAs and SRCs of vinegar
sediment and vinegar ethanol extract
必需氨基酸醋膏醋液醇沉物氨基酸比值氨基酸比值系数氨基酸比值氨基酸比值系数Thr0.410.870.291.29Cys+Met0.210.450.130.56Val0.631.330.251.12Ile0.561.190.160.71Leu0.491.040.120.54Phe+Tyr0.581.230.231.02Lys0.420.900.401.75氨基酸比值系数分(SRC)70.1556.10
3 结论
醋膏主要由多糖、多肽等物质组成。其中，醋膏粗多糖含量为14.0%，主要由氨基葡萄糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖甘露糖等单糖组成，以氨基葡萄糖为主，其多糖中硫酸基含量占比为2.64%。醋膏多肽占醋膏干重的53.4%，含有17种氨基酸，主要由谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、甘氨酸组成，7种必需氨基酸占氨基酸总量的27.4%。根据FAO/WHO氨基酸评分模式，醋膏的多肽营养价值高于醋液醇沉物。目前的研究并没有明确醋膏多糖多肽的结构和功效，后续需对醋膏多糖多肽进行分离纯化，而本研究为了解醋膏成分和后续的分离纯化实验提供了参考数据。
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