采用益生菌发酵技术研发具有保健功能的发酵果蔬汁,不仅丰富了果蔬制品的种类,增加了果蔬制品的保健作用,更改善了果蔬制品的风味,使果蔬加工产业有了快速的发展[1]。

甘蔗(Saccharum officinarum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、胡萝卜(Daucus carota)均是我国物美价廉的果蔬,且三者均含有多种可溶性糖、氨基酸、人体必需的微量元素及多种对人体有益的有机酸等物质[2-3]。甘蔗含有具抗氧化作用的多酚类物质及较高的糖类物质可以为发酵提供碳源；番茄含有具抗氧化和增强免疫力的番茄红素，番茄汁也是嗜酸乳杆菌的促生长因子[4-9]。经前期研究发现,这3种复合果蔬经过益生菌发酵之后,能够产生较好的挥发性成分,而挥发性成分是评价果蔬汁感官质量的重要指标之一[10]。

束文秀等[11]采用静态-顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用分析方法,测定胡柚汁经此2种乳酸菌发酵后挥发性成分和相对含量变化。本试验在前期益生菌发酵复合果蔬汁工艺优化的基础上,采用顶空固相微萃取-气质联用法分析复合果蔬汁益生菌发酵前后挥发性成分,并对顶空固相微萃取-气质联用法进行优化。为进一步提高和监控发酵果蔬汁制品提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蔗、番茄及胡萝卜,购于家乐福；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),购于丹尼斯克(中国)有限公司。

1.2 仪器与设备

JD100-3B电子分析天平,上海精科天美科学仪器有限公司；SW-CJ-1F超净工作台,苏州净化设备有限公司；手动SPME进样器，美国Supelco公司；Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene(PDMS/DVB)萃取头，美国Supelco公司；Agilent Technologies 6890-5973N气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵果蔬汁的制备

原料预处理：将甘蔗清洗、沥干，用甘蔗机榨汁备用；将胡萝卜、番茄去蒂，清洗、沥干、切块，用榨汁机榨汁，酶解后备用。

工艺流程：

按V(甘蔗汁)∶V(番茄浆)V∶(胡萝卜浆)=5∶1∶2装入500 mL玻璃瓶→酶解→80目滤布过滤→调配至pH 6.7→按V(嗜酸乳杆菌)∶V(嗜热链球菌)∶V(植物乳杆菌)=3∶2∶1,接种量为3%→38 ℃ 恒温发酵→益生菌发酵复合果蔬汁。

操作要点：试验用具都需事先消毒,接种需在无菌条件下。

1.3.2 固相微萃取条件的优化

1.3.2.1 萃取温度的选择

其他萃取条件不变,将萃取温度分别设定为40、45、50、55、60 ℃,启动仪器采集数据,每个样品重复3次,取平均值。

1.3.2.2 萃取时间的选择

其他萃取条件不变,将萃取时间分别设定为20、30、40、50、60 min，启动仪器采集数据,每个样品重复3次,取平均值。

1.3.2.3 NaCl的加入量

其他萃取条件不变,NaCl的加入量分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，启动仪器采集数据,每个样品重复3次,取平均值。

1.3.3 GC-MS参数条件

色谱条件：DB-5ms柱石英毛细管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；萃取头热解析温度为250 ℃,时间为3 min,不分流模式。进样口温度250 ℃；起始温度50 ℃,保持1 min；然后以2 ℃/min的速度升温到180 ℃,保持4 min；再以2 ℃/min的升温速度升温到180 ℃,保持4 min。载气为He,流量1 mL/min。

质谱条件：全扫模式,扫描质量范围为33～450 m/z。电离方式为EI+,电子能量70 eV,灯丝发射电流350 pA,检测器电压350 V,离子源温度230 ℃,接口温度250 ℃[12-13]。每个样品重复3次,取平均值。

1.3.4 挥发成分的定性定量

香气成分采用Wiley7n.1质谱数据库检索并结合参考文献[14-16]进行定性分析。用峰面积归一化法进行各种香气成分相对含量的计算,即各种香气物质的峰面积占总挥发性成分总出峰面积的百分数。每个样品重复3次,取平均值。

1.3.5 数据处理

采用OriginPro 8.5和IBM SPSS 21.0处理试验数据,表中不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 固相微萃取条件的优化

2.1.1 萃取温度选择

由图1可知,随萃取温度的升高,总峰面积及总峰数先呈递增趋势,温度达45 ℃为最高点后逐渐降低。可能是萃取温度对萃取效果影响较大,温度升高,加快挥发物质的分子运动速率,有利于萃取头对目标物的吸附[17]；当温度过高,某些不稳定物质容易分解,影响研究结果[18]。所以选择萃取温度45 ℃。

2.1.2 萃取时间选择

由图2可知萃取20～40 min时总峰面积及总峰数呈增长趋势,40～60 min时总峰面积及总峰数变化不明显。这可能是因为萃取时间较短时,样品中挥发性物质不能被萃取头充分吸附[19]；萃取时间过长,可能导致样品中某些不稳定化合物发生氧化分解等副反应[20]。故萃取时间应设定为40 min。

2.1.3 NaCl加入量

由图3可知,NaCl加入量在0.0～1.0 mg/L时总峰面积及总峰数呈增长趋势,NaCl加入量在1.0～3.0 mg/L时总峰面积及总峰数呈递减趋势。可能是因为适量加入NaCl产生盐析效应降低挥发性成分在水中的溶解度,有助于挥发性成分逸出,增加其在顶空瓶上空的浓度,增加萃取效率；过量加入NaCl,使基质黏度增加,影响挥发性成分逸出,减少其在顶空瓶上空的浓度,降低萃取效率[21]。故本研究选择NaCl加入量1.0 mg/L。

2.1.4 解吸时间选择

由图4可知,解析时间在2～4 min时总峰面积及总峰数呈增长趋势,解析时间在4～5 min时总峰面积及总峰数呈平缓趋势。可能是因为解析时间不足时,萃取头上尚残存部分挥发性化合物；解析时间过长时,部分物质可能发生热分解或聚合反应,降低检测效率[22-23]。故本研究将解析时间设定为4 min。

2.2 较优条件下益生菌发酵复合果蔬汁饮料挥发性成分GC-MS分析结果

2.2.1 各类挥发性化合物的对比分析

根据图5发酵前后总离子流图及表1分类对比分析各类挥发性化合物。

2.2.2 醇类化合物

复合果蔬汁发酵前检查出10种醇类物质，总含量12.782%；益生菌发酵后含12种，总含量为18.777%。发酵后比发酵前醇含量明显增加，其中，已醇5.326%增加至7.326%、苯丙醇1.933%增加至2.439%、反-2-已烯醇1.089%增加至1.434%、1-戊烯-3-醇1.540%增加至2.528%，均具有果香气味，对益生菌发酵复合果蔬汁饮料风味贡献较大[24]。发酵之后减少了一种香气成分异戊醇，其具有令人不愉快的杂醇气息和辛辣味道[24]；发酵后比发酵前增加了3种醇类物质：α-戊基肉桂醇具有甜的果香、辛香[24]；α-丙基苯乙醇具有水果、清香香气[24]；苯乙醇具有香甜的玫瑰样花香[25]等。

2.2.3 有机酸类化合物

复合果蔬汁发酵前检查出7种有机酸类化合物，总含量为0.622%；发酵后含15种，总含量为13.657%。发酵之后酸类化合物急剧增长是因为乳酸菌发酵产生的代谢物。酸类化合物含量多的且可能香气成分贡献较大的有：乳酸(3.209%)具有温和的令人愉快的酸味；丁酸(2.234%)果香香气[24]；戊酸(1.523%) 水果香气[24]；庚酸(0.215%～1.121%) 甜的、蜡香、水果的香气[24]；甲酸(0.007%～1.234%)尖刺的酸、辣、醋香、果香香气[24]等。

2.2.4 酯类化合物

复合果蔬汁发酵前检测出酯类化合物5种，总含量为1.25%；发酵之后含12种，总含量为15.426%。这表明发酵过程中代谢产物及果蔬汁本身酸类化合物与醇类化合物发生某种酯化反应生成大量酯类化合物。酯类化合物含量较多的且可能香气成分贡献较大的主要有：戊酸丁酯(0.102%～3.242%)具有甜的、水果、蜜饯、冰淇淋香气；辛酸乙酯(2.429%)具有类似白兰地的香味及甜味[26]；异丁酸乙酯(2.201%)具有甜的、水果、黄油、朗姆酒香气；辛酸异戊酯(1.898%)具有甜的、水果、脂肪、青香香气；γ-戊内酯(1.507%) 具有水果椰子香气等。

续表1

注：“-”代表未检出。

2.2.5 烃类化合物

复合果蔬汁发酵前检测出烃类化合物10种，总含量为3.263%；发酵之后含10种，总含量为8.048%。发酵之后烃类化合物急剧增长是因为益生菌发酵产生的代谢物。据文献报道烃类化合物通常对风味贡献较大的多为不饱和烃类[27]，所以发酵之后香气成分贡献较大的主要有：3,6-辛三烯(0.086%～0.554%)及罗勒烯(0.142%～1.402%)具有甜的、青香、热带水果、木香、萜烯香[24]气；α-松油烯(0.159% ～0.269%)具有果香和木香气味；d-柠檬烯(0.847%～1.654%)具有甜香、柑橘香、柠檬香；金合欢烯(0.307%～1.523%)具有萜香、青香、草香、药草香气味[24]；月桂烯(0.446%～1.071%)具有果香、木香、热地水果香、木香气味[24]。

2.2.6 醛类化合物

复合果蔬汁发酵前检测出醛类化合物6种，总含量为0.812%；发酵之后含7种，总含量为3.61%。相对而言，醛类化合物气味阈值通常比其同系醇类较低，含量也很低，但对整体的香气都具有较大的贡献[28-29]。这7种醛类化合物分别是[24]：己醛(0.040%～0.668%)具有青香、叶香、果香、木香；2-壬烯醛(0.065%～0.434%) 具有脂肪气息、青香、蜡香、黄瓜香、甜瓜香；反-2-已烯醛(0.245%～0.465%)具有青香、果香、木香、辛香、脂肪香；肉豆蔻醛(0.194%～0.556%)具有脂肪香、蜡香、牛奶香、果香；2-乙基丁醛(0.134%)具有甜香、果香、青香，并带有可可香韵；正戊醛(0.120%～0.486%)有微辛辣气息，具果香、面包香；2,4-庚二烯醛(0.122%～0.334%) 具有青香、醛香。

2.2.7 酚类化合物

复合果蔬汁发酵前只检测出1种酚类化合物，总含量为0.21%；发酵之后含6种，总含量为2.91%。由于益生菌的作用发酵使果蔬汁多酚含量增加，酚类物质主要提高了饮料的陈香、果香、木香香韵。如丁香酚(0.784%)具有强烈的丁香辛香香气[24]；异丁香酚(0.562%)具有甜辛香、木香及子丁香味道[24]；2-甲氧基-4-甲基苯酚(0.218%)具有辛香、药香香气[24]；4-乙基愈创木酚(0.213%～0.586%)天然存在于番茄中，发酵之后香味更加浓郁，具有辛香、药香、木香及类似丁香香气[24]；麦芽酚(0.287%)具有甜香、果香、焦糖香气[24]；乙基麦芽酚(0.473%)具有甜白糖、焦糖、果酱香气[24]。

2.2.8 其他

复合果蔬汁益生菌发酵前后检测出乙基香兰素(2.326%)具有香甜、巧克力气味[30]；异丁基噻唑(1.231%)具有青香、蔬菜香、草香、番茄香，是原料的主体香[24]。

3 结论

本研究对采用顶空固相微萃取-气质联用法分析了甘蔗-番茄-胡萝卜复合果蔬汁益生菌发酵前后挥发性成分方法做了优化并进行检测。结果显示,复合果蔬汁益生菌发酵前后香气成分发生很大变化,共鉴定出67种挥发性成分。发酵后新产生27种挥发性成分,消失了3种挥发性成分,相对含量也由发酵前的18.938%增加为67.904%。其中醇类化合物、酸类化合物、酯类化合物、烃类化合物、醛类化合物、酚类化合物均有显著增加,还测定出其他香气成分包括乙基香兰素及异丁基噻唑。益生菌发酵改变了复合果蔬汁原本的香气种类及含量,致使发酵后的复合果蔬风味发生了很大变化,比发酵前甘蔗-番茄-胡萝卜复合果蔬汁更为醇香、浓郁、独特,为产品增加感官附加值,可促进消费。此试验为发酵果蔬风味物质的研究提供了理论基础,并在产品品控方面发挥一定作用。但本研究还存在局限性,对不同果蔬及发酵果蔬香气成分仍需进一步深入研究。

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Headspace solid phase microextraction-gas chromatography/mass spectrometryanalysis of the volatile components in probiotics fermented fruit andvegetable juice

HE Jiamin1, YU Lan2, YU Xin1,2*， LIU Xueyun1, JIANG Fang2,WANG Ping1， GUO Jing1

1(Institute of Light Industry and Food, Zhongkai Institute of Agricultural Engineering, Guangzhou 510225,China) 2(Wuhan Tiantianhao Biological Products Co., Ltd,Wuhan 430090,China)

ABSTRACT The volatile components of probiotic-fermented fruit and vegetable juice were analyzed by headspace solid phase microextraction and GC/MS. Significant differences were found after fermentation. In total 67 identified volatile components, 27 were produced and 3 eliminated by fermentation. The relative content of volatile components increased from 18.94% to 67.90%. Among them, alcohols, acids, esters, hydrocarbons, aldehydes and phenols were increased, ethyl vanillin and isobutylthiazole were identified. These results provided a reference for improving the quality of fermented fruit and vegetable products.

Key words fruit and vegetable fermentation; probiotics; volatile components

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.019712

第一作者：硕士研究生(于新教授为通讯作者，E-mail：231482 5413@qq.com)。

基金项目：农业部功能食品重点实验室开放基金(201806)

收稿日期：2018-12-22，改回日期：2019-05-17