油果是我国民间的一种以糯米为原料的传统油炸膨化小吃，口感酥脆，外黄内白，内部呈均匀的蜂窝结构。油果的传统加工方式为长时间自然发酵糯米，发酵时间长，发酵过程中会产生刺鼻的臭味，而通过酵母菌发酵糯米粉能够缩短糯米油果的生产周期，改善油果的食用品质。淀粉作为谷物的主要成分，其结构的变化直接影响着产品的品质，研究淀粉结构的变化对改善以淀粉为基质的谷物类食品的品质有着重要意义[1]。近年来国内外有很多关于谷物发酵对淀粉结构影响方面的报道，高粱中的淀粉经自然发酵后持水性和溶解性增加，但透明度降低，糊化温度降低，糊化焓增加，淀粉的回升值与最终黏度随发酵时间的延长先减小后增大[2]；乳酸菌发酵使大米粉中的淀粉的保水力、溶解度、凝胶的体积膨胀率均有所增加，颗粒表面遭到侵蚀，小颗粒数目增多，峰值黏度下降，糊化焓升高，结晶度有所降低[3]；利用筛选出的自然菌种发酵小米，研究发现，发酵未改变淀粉的偏光十字，其淀粉颗粒表面遭到侵蚀，孔洞增多，官能团峰位未变但是强度减弱，短期抗老化性能提升[4]；酿酒酵母发酵使玉米淀粉颗粒表面产生孔洞，结晶度先升高后降低，短程双螺旋有序结构未受影响，糊化温度和糊化焓均先升高后降低[5]；酵母菌发酵糙米粉能够使其蛋白质、总灰分、不溶性纤维、可溶性纤维等成分的百分含量升高，降低其溶胀度、水溶性、崩解值、回升值[6]。然而，发酵对糯米粉中淀粉结构的影响尚未见报道。
本文从链长分布、表观结构、短程有序结构、晶体结构、球晶结构、粒径大小、表观结构来分析研究糯米粉经酵母菌发酵过程中淀粉结构的变化，从而对糯米油果的生产和糯米发酵的精深加工提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
糯米：蚌埠兄弟粮油有限公司；酵母：安琪酵母股份有限公司；其他化学试剂：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Sirion200扫描电子显微镜，日本日立高新技术公司；Rigaku TTR-Ⅲ X射线衍射仪，理学电机公司；IS50FT-IR光谱仪，美国尼高力仪器公司；Mastersizer3000激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；ICS-5000高效阴离子(DionexTM CarboPacTM PA200柱(1 mm×250 mm×5.5 μm))，美国赛默飞世尔科技公司。
1.3 试验方法
1.3.1 糯米粉发酵及淀粉制备
取500 g糯米粉，接种3%(质量分数)的酵母菌菌液，加一定量的水，揉成面团状，置于醒发箱中37 ℃发酵0～48 h。淀粉的提取方法参照LI等[7]的方法，用稀碱浸泡分离纯化发酵不同时间的糯米淀粉。
1.3.2 发酵对淀粉链长分布的影响
采用Dionex ICS-5000 HPAEC的仪器，配备电化学检测器来测定不同发酵时间的糯米淀粉的链长分布。称取5 mg纯化干燥的淀粉，加5 mL双蒸水，沸水浴60 min，间断混匀；然后取2.5 mL糊化的样品，加入125 μL CH3COONa，25 μL NaN3和5 μL异淀粉酶，38 ℃放置24 h。加入375 μL NaBH4，室温放置24 h。取600 μL于离心管中，室温干燥，然后溶于600 μL流动相中，离心(12 000 r/min,10 min)，取上清上样。流动相为：A相：双蒸水; B相：100 mmol/L NaOH; C相：100 mmol/L NaOH-500 mmol/L NaAC;流速：0.5 mL/min[8]。
1.3.3 发酵对淀粉短程有序结构的影响
淀粉置于玛瑙研钵中加入无水KBr(1∶100, g∶g)研磨成粉末状，再用压片机将其压成薄的圆片状。红外光谱扫描模式设为ATR模式，扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1[9]。
1.3.4 发酵对淀粉结晶结构的影响
淀粉的结晶结构由TTR-Ⅲ X射线衍射仪测定。在40 kV和80 mA下运行，衍射角(2θ)扫描范围为5°～50°，步长为0.02°。遵循LOPEZ-RUBIO等[10]的方法利用PeakFit软件(版本4.12, Systat Software Inc., SanJose, CA, USA)计算出结晶度(即结晶区的峰面积和非结晶区的面积的比值)[11]。
1.3.5 发酵对淀粉球晶结构的影响
将淀粉配制成10 g/L的淀粉悬浮液，混合均匀，然后吸取少量滴在载玻片上，置于激光共聚焦显微镜下观察[12]。
1.3.6 发酵对糯米淀粉粒径大小的影响
淀粉的粒径用激光散射仪进行分析，首先用纯水作为分散介质，大烧杯作为容器，将淀粉颗粒用小药
匙缓慢加入到大烧杯至检测器检测到6%左右，然后进行粒度检测，监测范围为0.02～2 000 μm，记录对应的直径D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)[13]。
1.3.7 发酵对糯米淀粉表观结构的影响
将淀粉均匀地涂抹在透明的双面胶带上，然后使用离子溅射镀膜仪在其表面进行镀金，再置于扫描电镜下观察，找具有代表性的区域观察淀粉表面结构，放大倍数为2 000倍。
2 结果与分析
2.1 发酵对淀粉链长分布的影响
基于链长的聚合度(DP)，支链淀粉的分支分为 4种类型，即A链(DP≤12)、B1链(DP 13～24)、B2链(DP 25～36) 和B3链(DP≥37) [14]。图1显示，链长分布结果发现，随着发酵时间的延长，发酵12、24、48 h的A链的比例较未发酵的分别降低了0.97%、10.02%、 8.51%，而B1链的比例较未发酵的分别上升了3.19%、5.25%、6.32%，B2链的比例较未发酵的分别升高了1.49%、2.56%、1.30%，B3链的比例与未发酵的相比分别增加了0.72%、5.65%、4.33%。由此可得，发酵前期支链淀粉A链(DP≤12)的比例降低，而使支链淀粉B链(DP>12)的比例升高，发酵后期支链淀粉B2链和B3链的水解，使得长支链淀粉的比例降低。这可能是由于发酵过程中，酵母菌产生的酶和酸等先作用于支链淀粉外侧的非还原性末端，使其短支链淀粉水解，从而长支链淀粉的相对含量增加[15]，而在发酵后期，发酵产生的酸和酶等又使得支链淀粉的长支链发生水解，从而长支链淀粉的含量又略有下降[16]。
A-0 h;B-12 h;C-24 h;D-48 h
图1 不同发酵时间糯米淀粉的链长分布
Fig.1 Distribution of chain length of waxy rice starch during different fermentation time
2.2 发酵对糯米淀粉结晶度的影响
X-衍射可以反映淀粉的晶体特性，如图2所示，原淀粉与发酵糯米淀粉都是由弥散衍射峰组成，在2θ=15°、17°、18°、23°附近出现特征衍射峰，是典型的谷物类A型晶体，说明发酵并未改变淀粉的结晶结构。通过计算，发酵后淀粉的结晶度(无定形区与结晶区的比值)先增大，12 h最高达到28.55%，这主要是由于发酵前期，酵母菌产生的酶及酸等破坏了淀粉颗粒的无定形区，而后随发酵时间的延长结晶度逐渐减小，与发酵12 h相比分别降低了4.72%、6.97%， 这是由于发酵后期酶和酸渗透到颗粒内部，侵蚀淀粉颗粒的结晶区，从而使得结晶区的相对面积减少，结晶度降低[5]。
图2 不同发酵时间糯米淀粉的X-衍射图谱
Fig.2 X-diffraction pattern of waxy rice starch
during different fermentation time
2.3 发酵对淀粉短程有序结构的影响
观察图3的ATR-FTIR红外光谱不难发现，在400 cm-1～4 000 cm-1它们的峰位置保持不变，说明在发酵过程中糯米淀粉无新的官能团产生，经过去卷积处理后，在1 047 cm-1和1 022 cm-1处分别对应结晶区和无定形区结构，(比值强度1 047 cm-1/1 022 cm-1) 强度，用来解释淀粉的双螺旋有序结构的含量。
图3 不同发酵时间糯米淀粉的FTIR图谱
Fig.3 FTIR map of waxy rice starch during
different fermentation time
通过计算发现，与未发酵的相比在12 h其比值，上升了0.025 7，在发酵24和48 h后(比值1 047 cm-1/1 022 cm-1)降低，较发酵12 h分别降低了0.015、0.024 5。这与X-衍射的结果变化一致，说明了发酵使淀粉的有序结构遭到了一定的破坏。发酵前期，淀粉的非晶区域遭到水解，使得淀粉朝着有序结构改变，而发酵后期，结晶结构遭到破坏，使得淀粉有序结构面积减少，比值降低[7]。
2.4 发酵对淀粉球晶结构的影响
淀粉颗粒内部存在结晶区和无定形区，在结晶区区域中淀粉分子排列高度有序，而在无定形区域淀粉分子排列呈无序状态，这也导致了这两种结构密度及折射率存在差异，偏振光通过时会产生明显的偏光十字[17]。
由图4可以看出在偏振光下，发酵不同时间的淀粉都具有明显的偏光十字，证明发酵使其球晶结构无显著性变化，说明淀粉的结晶区被破坏得较弱，可能是由于发酵产生的酸和酶等主要作用于淀粉的无定形区，对其结晶区的影响较小[18]。
A-0 h；B-12 h；C-24 h；D-48 h
图4 不同发酵时间的淀粉的偏光十字
Fig.4 Different fermentation time of waxy rice
starch granules on the morphology
2.5 发酵对糯米淀粉粒径大小的影响
由图5可知，原糯米淀粉有3个粒径分布峰，在经过发酵处理后粒径大小在100 μm处的分布峰消失，同时，随着发酵时间的延长，粒径大小在1、10 μm的淀粉比例逐渐增多，在1 μm处发酵24和48 h差别不明显。这是由于淀粉的无定形区遭到水解，大颗粒淀粉变成小颗粒淀粉，粒径减小；在发酵后期，颗粒淀粉水解粒径主要集中在10 μm。这与李丽[19]在研究自然发酵对黄米淀粉的粒径大小中发现发酵对淀粉的粒径并未产生影响的结果相反，这主要是由于它们的发酵体系不同，自然发酵和酵母菌发酵优势菌种不同，菌的产酶产酸能力也不同。
图5 不同发酵时间糯米淀粉的粒径分布
Fig.5 Size distribution of waxy rice starch at
different fermentation times
2.6 发酵对糯米淀粉表观结构的影响
未发酵与发酵不同时间的糯米淀粉的表观结构如图6所示，未发酵糯米淀粉颗粒呈不规则的多面体结构，菱角表面光滑。经发酵过的淀粉与原淀粉有明显的差别，其表面有明显的的孔洞，并且随着发酵时间的延长淀粉颗粒表面的孔洞增多，LU等[20]在研究自然发酵对米粉的影响中有相似的结果，这主要是因为发酵过程中产生的酸和酶等对淀粉的水解作用，淀粉颗粒内部的直链淀粉被溶出[15]。
A-0 h；B-12 h；C-24 h；D-48 h
图6 不同发酵时间淀粉的颗粒形态
Fig.6 Different fermentation time of waxy rice
starch granules on the morphology
3 结论
通过对糯米粉发酵过程中的淀粉进行提取，与未发酵的糯米淀粉作比较，探讨酵母菌发酵对糯米粉中淀粉结构的变化规律。研究发现,发酵能够促进支链淀粉中短链的分解；发酵并未形成新的官能团，但使淀粉的短程有序结构发生变化，发酵12 h前朝着有序的方向改变，发酵12 h后朝着无序的方向发展；它的晶型并未改变，但是结晶度发生了变化，其结晶度先升高后降低；粒径分析发现，发酵使淀粉颗粒粒径逐渐减小；淀粉的球晶结构变化不是特别显著，但淀粉的表面遭到侵蚀产生诸多孔洞。本研究从不同角度研究糯米粉发酵对淀粉结构的影响。综合上述结果，酵母菌发酵使糯米淀粉的结构发生了明显的变化，本文阐明了糯米粉发酵对淀粉的改性作用机理，有助于促进糯米粉相关发酵产品的研发，提高糯米粉的应用价值与经济效益。
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