不同热处理温度对蓝莓果汁在冷藏过程中多酚和黄酮含量的影响

蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)蓝浆果亚属(Cyanococcus)小浆果植物的果实。2017年中国蓝莓种植面积已经达到46 000 hm2，果实产量达到11.5万t，约占世界总产量的第6位。蓝莓富含多酚、黄酮、花色苷和原花青素等功效成分，大量摄入能预防癌症、心脏病、中风、肥胖及其相关并发症的发生，营养价值普遍高于柑橘、葡萄等大宗水果[1-2]；联合国粮农组织将其列为五大健康食品之一，被称为“世界第3代水果之王”。2018年研究发现，长期食用富含蓝莓膳食(24 g/d，相当于一杯鲜蓝莓果汁，90 d)可有效改善老年人的行动和认知能力[7]。

目前，蓝莓仍以鲜食为主，约占总产量的75%。蓝莓属小浆果，果实采后易变软腐烂，如对采后蓝莓及时进行深加工，则便于其保藏和食用[8]。蓝莓粗加工仍多以冷藏或冻藏为主，均可导致营养成分严重流失，限制其深加工利用[9-10]。同时由于蓝莓种植的季节性限制，寻找保留、保护和稳定蓝莓活性成分的潜在方法(或深加工技术)已成为解决蓝莓收购季节短、易腐烂(同时导致农户难以销售)的问题，同时也是提高附加值、促进蓝莓产业发展的关键[11-12]。市场已有的鲜榨蓝莓果汁、蓝莓果汁饮料、蓝莓乳饮料等产品颇受消费者欢迎，但蓝莓产品在加工过程中涉及到高温、pH值、空气和光照等会加速生物活性成分(如多酚和原花青素等)的降解，导致蓝莓产品保健功效下降、口感降低以及其他负面影响，如何解决这一问题成为制约蓝莓果汁饮品发展的瓶颈。热处理是果汁加工中的关键工序，能够使果汁中的酶失活，破坏其中的微生物及致病菌，对提高果汁的安全性和保质期具有重要的作用[13-14]。一般来说，低酸性果汁(pH>4.6)的热处理温度需高于100 ℃，才能实现“灭菌”，而酸性果汁(pH值<4.6)仅需要100 ℃以下的热处理[15]。热杀菌处理的温度和时间是控制果汁的安全性、保质期和品质的重要因素。LANGER等[16]通过代谢组学研究蓝莓全果与蓝莓果汁对人体蓝莓代谢产物的影响，9名健康受试者食用了250 g新鲜蓝莓或等量蓝莓果汁，结果发现二者有着相似的代谢特征。目前，对蓝莓果汁在热处理过程中品质和抗氧化成分的变化未见报道。因此，研究不同热处理温度对蓝莓果汁在冷藏过程中其主要功效成分(即总多酚、总黄酮、花色苷和原花青素)含量的影响，以及应用动力学模型预测热杀菌蓝莓果汁在冷藏过程中其主要功效成分的变化规律，为蓝莓果汁杀菌温度的选择、冷藏特性及其品质综合分析提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜蓝莓，购买于当地超市(品种为高丛蓝莓安娜，Vaccinium corymbosum L.vs Anna)，可溶性固形物为(9.50±0.16)°Brix、可滴定酸为(2.28±0.42)%和pH值为2.91±0.01。

没食子酸(gallic acid，GAE)、芦丁(rutin)、矢车菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，COG)和儿茶素(catechin，Cat)，美国Sigma-Aldrich公司；普通化学试剂(分析纯)，成都科龙试剂厂。

UV-2450紫外可见分光光度计，日本岛津公司；JYL-C022E九阳料理机，九阳股份有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 不同温度杀菌处理的蓝莓果汁及其制备方法

蓝莓果汁的制备方法：蓝莓→清洗→打浆、均质处理(100 g蓝莓)→装袋→热杀菌→4 ℃贮藏保存，具体如图1所示。将已处理的蓝莓果汁采用高温塑料瓶封口(50 mL/瓶)，然后于60、70、80、90 ℃分别杀菌30 min，杀菌后立即进行恒温贮藏试验(4±0.5 ℃)，分别于0、1、2、4、6、8、10、12、14、16周取样分析。

1.2.2 蓝莓果汁中主要功效成分测定方法

(1)前处理方法：取10 g蓝莓果汁，加入100 mL 75%乙醇(体积分数)，超声提取30 min(功率70 W)，5 000 r/min条件下离心10 min(4 ℃)，将上清液置于-4 ℃保存备用。

(2)总多酚含量测定：采用Folin-Ciocalteu法测定[17]。取0.4 mL样液加入2 mL Folin-Ciocalteu试剂，反应5 min后，加入1.8 mL Na2CO3溶液(75 g/L)，常温下避光反应1 h后，以蒸馏水为空白对照，测定吸光值A765 nm；以GAE乙醇溶液(100～300 mg/L)做标准曲线，蓝莓果汁中总多酚含量以每100 mg新鲜果汁中含有的GAE当量来表示(mg GAE/100 mg Fw)。

(3)总黄酮含量采用三氯化铝比色法测定[18]，取0.05 mL样液，依次加入0.5 mL蒸馏水、0.04 mL 50 g/L Na2CO3溶液，摇匀，待5 min后加入0.04 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液，定容至1 mL。在室温下反应15 min后于510 nm处测定吸光值。总黄酮含量以每100 g新鲜果汁含有的芦丁当量来表示(mg Rutin/100 g Fw)。

(4)花色苷含量采用pH值示差法测定[19]，样品分别用pH 1.0的KCl(0.025 mol/L，采用0.2 mol/L HCl溶液调节pH)缓冲液和pH 4.5的CH3COONa(0.4 mol/L)稀释相同的倍数，混匀，室温下避光静置30 min，测定每个样品在520和700 nm波长下的吸光值，蓝莓果汁中花色苷含量以每100 g新鲜果汁含有的COG当量来表示(mg COG/100 g Fw)，按公式(1)计算：

式中：A，吸光度，A=(A510-A700)pH 1.0-(A510-A700)pH 4.5；MW，COG的相对分子质量(449.2 g/mol)；DF，新鲜蓝莓果汁样品的稀释倍数；ε，COG的摩尔消光系数(26900 L/(mol·cm))。

(5)原花青素含量采用香草醛-盐酸法测定[20]，取0.05 mL样品液，依次加入0.05 mL蒸馏水、0.6 mL 4%香草醛甲醇溶液、0.3 mL浓HCl，于20 ℃水浴中反应30 min，测定500 nm处的吸光值。蓝莓果汁中原花青素含量以每100 g新鲜果汁含有的Cat当量表示(mg Cat/100 g Fw)。

1.2.3 降解动力学评价方法

(1)果汁中绝大多数营养成分在贮藏过程中均会发生降解，其降解基本符合零级或一级反应动力学模型[21-22]。分别采用零级、一级动力学和“零级+一级”结合动力学模型拟合蓝莓果汁中总多酚、总黄酮、花色苷和原花青素变化，如公式(2)、(3)和(4)所示：

零级反应：C=C0+(-k0)t

一级反应：C=C0×exp(-k1×t)

“零级+一级”结合动力学模型：C= k0/k1-(k0/k1-C0)×exp(-k1×t)

式中：C，各成分的含量[mg/(100)g Fw)]；C0，各成分的初始含量；k0和k1，分别为各成分的零级和一级反应降解速率常数(w-1)；t，贮存时间(周)。将各个功效成分评价指标的冷藏时间和对应的功效成分含量分别代入零级反应和一级反应方程式中，作C—t图并进行动力学方程拟合，得到各个动力学模型方程及其拟合曲线。

(2)根据蓝莓果汁热处理温度(T)对其功效成分降解速度常数(k)的影响，采用阿伦尼乌斯(Arrhenius)计算各成分在降解过程中的热力学参数，如公式(5)所示。

式中：k，蓝莓果汁主要功效成分的降解速率常数(w-1)；Ea，活化能(kJ/mol)；k0，频率因子；R，通用气体常数(8.314 J/(mol·K))；T，热杀菌处理的绝对温度(K)；将各个功效成分热处理的1/T和最优动力学拟合方程所得的k值分别代入公式(5)，作k—1/T图并计算拟合参数。

(3)测定16个蓝莓果汁热处理样品(每个温度4个样品)在冷藏过程中其总多酚、总黄酮、花色苷、原花青素含量，采用最佳动力学模型预测蓝莓果汁在16 周冷藏过程中总多酚、总黄酮、花色苷、原花青素含量变化，通过分析测定值和预测值的线性关系，进而判断预测效果。

1.2.4 数据统计分析

根据国内外学者在研究功效成分降解试验中选用的评价指标评判模型拟合效果的经验，本试验选用残差平方和(residual sum of squares，RSS)和校正决定系数

作为评价指标[23]。其计算如公式(6)和公式(7)所示：

式中：RSS，残差平方和；N，数据个数；Cpred，i，预测指标成分含量；Cexp，i，实测指标成分含量。

式中：

校正决定系数；DFerror和DFtotal,分别为总体和误差自由度；SSQtotal和SSQregression,分别为总平方和与回归平方和。

各试验数据结果均以平均值±SD(n=3)表示，采用SPSS 15软件(SPSS Inc.,Chicago,IL)进行方差分析，采用Origin 8.5软件(Origin Lab Corporation,USA)进行数据拟合，采用LSD法进行多重比较，P<0.05表示差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 不同热杀菌温度对蓝莓果汁在冷藏过程中多酚和黄酮含量的影响

不同热杀菌温度(60～90 ℃)处理的蓝莓果汁在4 ℃条件下贮藏16周过程中总多酚和总黄酮含量的变化曲线如图2-A和图2-B所示。未经过热杀菌处理的鲜蓝莓果汁的总多酚和总黄酮含量分别为(249.5±7.8)mg GAE/(100 g)Fw、(427.1±9.3)mg Rutin/(100 g)Fw。经60、70、80和90 ℃处理30 min的蓝莓果汁在4 ℃条件下贮藏16周后，其总多酚和总黄酮保留率分别为73.62%、71.59%、68.43%、68.72%和68.53%、65.78%、67.47%、69.67%，其中温度对总黄酮保留率的影响不显著(P>0.05)；与经60 ℃杀菌的蓝莓果汁相比，经70、80和90 ℃处理30 min的蓝莓果汁的总多酚和总黄酮损失率分别为1.90%、3.49%、6.75%和3.26%、7.89%、12.68%；热杀菌处理的蓝莓果汁在贮藏初始阶段其总多酚和总黄酮迅速下降，10周之后逐渐趋于平稳；温度越高，贮藏初始阶段其总多酚和总黄酮下降越明显。近年来，流行病学研究表明食用富含多酚和黄酮的食品能够预防疾病[24-25]；多酚和黄酮是蓝莓果汁中重要的抗氧化成分，蓝莓果汁饮料的开发和应用主要难点在于，如何防止多酚和黄酮类成分的氧化和降解、提高其保留率[11-12]。

不同热处理温度对蓝莓果汁中花色苷和原花青素含量的影响如图2-C和图2-D所示。未经过热杀菌处理的鲜蓝莓果汁的花色苷和原花青素含量分别为(169.7±9.3)mg COG/(100 g)Fw、(101.2±5.9)mg Cat/(100 g)Fw。经60、70、80和90 ℃处理30 min的蓝莓果汁在4 ℃条件下贮藏16周后，其花色苷和原花青素保留率分别为55.06%、53.41%、52.20%、57.43%和63.42%、62.98%、64.06%、65.51%。与经60 ℃处理样品相比，经70、80和90 ℃处理30 min的蓝莓果汁的花色苷和原花青素损失率分别为4.37%、12.41%、25.99%和3.33%、8.71%、12.52%；60和70 ℃热杀菌对蓝莓果汁中花色苷和原花青素影响不显著(P>0.05)，而高温处理(>70 ℃)花色苷和原花青素含量的变化影响较大；并且与总多酚和总黄酮相比，热处理后花色苷和原花青素损失更大。经60和70 ℃处理的蓝莓果汁的花色苷和原花青素含量在10 周之后趋于平稳，而经80和90 ℃处理的蓝莓果汁的花色苷和原花青素含量在8周之后就趋于平稳。同时结果显示，60 ℃低温杀菌处理可有效减缓蓝莓果汁中活性成分的损失，提高其保留率。通常鲜榨果汁富含原花青素和其他多酚类物质，而商业杀菌果汁中发现的原花青素和多酚含量相对较低[26-27]；主要有2个方面的原因：(1)大多数商业杀菌果汁都是经过稀释的；(2)一般商业杀菌果汁均需要经过破碎、加热、酶处理、压榨、热杀菌、澄清、过滤等各种复杂的加工处理，导致花色苷和多酚类物质被氧化降解或破坏，从而降低花色苷和多酚类物质的含量[10,28]。通过测定不同热杀菌处理的蓝莓果汁在冷藏过程中的主要活性成分的变化，结果表明，鲜榨蓝莓果汁经过60 ℃低温杀菌处理，冷藏16 周后其功效成分含量损失可以接受。VEGARA等[13,29]研究发现，低温杀菌结合制冷有助于降低商业杀菌石榴汁中原花青素的降解，避免对其颜色产生显著影响，并保留了该类生物活性物质对人体健康的有益作用。目前，市场上鲜榨蓝莓果汁较多，而冷藏类蓝莓果汁产品较少，采用60 ℃低温杀菌+4 ℃冷藏，既能保持鲜榨果汁产品良好的营养，又能延长保质期。经60 ℃低温杀菌+4 ℃冷藏处理的蓝莓果汁可作为一种冷藏型饮料，具有工业应用和市场推广价值。

2.2 蓝莓果汁总多酚、总黄酮、花色苷、原花青素热降解动力学研究

采用零级、一级和“零级+一级”结合动力学模型分别对图2试验数据进行拟合，根据

值越大、RSS值越小”原则，确定最佳拟合模型，结果见表1。如表1所示，零级、一级动力学模型和“零级+一级”结合动力学模型拟合的

分别为0.74～0.96、0.81～0.97、0.98～1.00，其中“零级+一级”结合动力学模型能更好的预判蓝莓果汁在4 ℃贮藏16周其总多酚、总黄酮、花色苷、原花青素热降解动力学行为。

2.3 “零级+一级”结合动力学模型应用于预测蓝莓果汁在冷藏期间功效成分含量

以

作为拟合效果的评价参数，

越接近于1，说明“零级+一级”结合动力学模型预测效果的精度越高。如图3所示，总多酚、总黄酮、花色苷、原花青素热降解的“零级+一级”结合动力学模型预测值与实测值较为接近，线性拟合的

分别为：0.986 0、0.967 8、0.972 1和

均大于0.90，其中原花青素含量的相关性略低于前三者。

零级和一级动力学被广泛应用于果汁的维生素和多酚类物质的降解过程，其中鲜切果蔬及果汁中Vc的降解符合零级或一级动力学模型已成为共识[30]，而多酚类物质降解情况则较为复杂。曹雪丹等[31]研究了蓝莓果汁花色苷热降解动力学及抗坏血酸对其热稳定性的影响，结果发现花色苷的降解呈现二级反应动力学特征。ZHENG等[21]分别采用零级、一级动力学、Weibull和偏最小二乘回归(partial least squares regression,PLSR)模型拟合和预测热杀菌菠萝汁在贮藏过程中总多酚含量及抗氧化活性，结果发现，不同的预测模型均可以准确地描述果汁贮藏过程中总多酚含量及抗氧化活性的具体变化。ROIDOUNG等[32]在研究巴氏杀菌越橘果汁贮藏过程中发现了可预测其花色苷变化的模型，不仅引入了创新的统计技术来提高参数之间的高度相关性，而且提出了预测的经验模型。因此，选择最合适的模型对预测果汁在贮藏过程中的营养成分变化具有重要意义。本研究建立的“零级+一级”结合动力学预测模型可应用于蓝莓果汁在贮藏过程中主要活性成分总多酚、总黄酮、花色苷、原花青素在热降解过程的预测和分析。

3 结论

通过测定不同温度杀菌处理的蓝莓果汁在冷藏16周过程中多酚和黄酮含量变化，结果发现，随着热杀菌温度的升高，初始蓝莓果汁中总多酚、总黄酮、花色苷和原花青素含量均呈现不同程度的降低，其中花色苷降低最为显著；蓝莓果汁在16周贮藏过程中活性成分含量均明显下降，冷藏期活性成分降解状况与热杀菌温度呈正相关；且经高温处理后其活性成分降解量增加，各功效成分热降解更符合“零级+一级”结合动力学模型，该结合动力学模型可作为热杀菌蓝莓果汁在冷藏中功效成分降解的预判方式。60 ℃低温杀菌+4 ℃冷藏有利于蓝莓果汁功效成分的保留，可作为产品生产的指导方法。后续将继续研究添加物(如食品抗氧化剂及其他饮料基质成分等)对热杀菌蓝莓果汁在冷藏中品质的影响，全面揭示影响热杀菌蓝莓果汁的内外因素，提高蓝莓果汁品质和保质期。

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