传统白酒酿造过程中存在着设备落后、劳动强度大、生产效率低、工艺控制粗放等问题，随着经济的发展和技术的创新，酿酒行业开始采用机械化、自动化、智能化和信息化等手段不断地促使传统白酒酿造模式升级[1-4]。机械化酿酒工艺虽然在酒曲应用和酿造流程方面与传统工艺相似，但因其独特的酿造设备以及酿造环境，导致生产出来的原酒相比较传统工艺，在风味组成上具有显著性差异。解析机械化酿酒工艺过程中风味物质形成和积累的驱动因子将有助于了解机械化酿酒工艺风味物质形成规律，最终达到机械化酿造出的原酒酒质与传统工艺保持一致甚至更优的目标。
作为白酒发酵过程中最重要的生物因子——微生物，代谢酒醅中淀粉、蛋白质等物质，将其转化为白酒的主要成分及微量风味物质。白酒发酵过程中微生物群落演替和结构改变会驱动风味物质组成发生变化，引起从乙醇到乙酸等一系列呈香物质生成和转化[5]。同样，微生物生长代谢引起了窖内酒醅理化指标呈现一定规律的变化，同时酒醅中成分改变也引起微生物群落生存环境和群落结构的相应改变，使窖内优势菌群逐渐呈现稳定状态[6]，进而影响酒醅中风味物质代谢和积累。可见微生物和环境因子是影响白酒中风味物质形成的重要因素[7-8]。随着劲牌小曲白酒机械化新工艺近年不断完善和成熟，原酒品质得到了极大的提高。但通过近几年的原酒生产数据发现，原酒的出酒率和酒质随着酿造原料和季节的变化而产生差异。因此，揭示小曲清香型白酒机械化工艺过程中风味物质形成的驱动因子，不仅有助于探索清香型白酒稳定生产工艺，更能进一步了解小曲清香型白酒发酵过程中微生物变化及风味产生机理。以往研究大多集中在浓香型或大曲清香型酒醅中微生物、理化指标和风味成分之间的研究[9-20]，而涉及小曲清香型白酒的研究甚少[4,21-25]。
本文以正常发酵清香型小曲机械化车间酒醅为研究对象，分析不同发酵时期酒醅发酵过程中微生物动态变化，以及风味物质生成的过程，并结合酒醅环境理化参数的变化，揭示了清香小曲白酒新工艺中微生物及环境因子对酒体风味变化的影响，以期指导实际生产，使原酒中各主要香味成分含量波动较小，为机械化工艺改进和酒质的不断提升提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品的采集
样品采集于劲牌有限公司机械化白酒发酵车间酒醅，目前车间糖化时间1 d，发酵周期为15 d，一个发酵批次为16 d。选择发酵0～15 d每天固定一个发酵槽车连续取样。为了获得不同时间发酵酒醅中各参数的变化，先后于2015年11～12月、2016年1～4月(2月除外)对同一个车间发酵过程中酒醅连续跟踪取样，每个月1个发酵批次，每次取样量为1 500 g，样品混匀后采用封口塑料袋密封后置于4 ℃冰箱或冰柜中冷藏备用，冷藏时间不超过1周，且用于微生物平板计数的样品为当天采集的样品。
1.1.2 主要试剂及仪器
蛋白胨、酵母浸粉、无水葡萄糖、牛肉浸膏、乙酸钠、吐温-80、琼脂粉、MgSO4、MnSO4、CuSO4、酒石酸钾钠、NaOH、次甲基蓝、亚铁氰化钾等，国药集团化学试剂(北京)有限公司。
恒温培养箱，上海博讯实业有限公司；凯氏定氮仪，丹麦FOSS公司；便携式酒精度密度计，奥地利安东帕公司；气相色谱仪，美国安捷伦公司；精密pH计，美国Mettle-Toledo公司。
1.1.3 培养基
酵母总数计数培养基为YPD培养基(g/L)：酵母浸粉10，葡萄糖20，蛋白胨20，琼脂粉20，青霉素0.5，1×105 Pa灭菌30 min。
细菌总数计数培养基为MRS培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉浸膏10，酵母浸粉5，葡萄糖5，乙酸钠5。柠檬酸二铵2，MnSO4·7H2O 0.05，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO4 2，琼脂20，吐温80体积分数0.1%，pH 6.8，1×105 Pa灭菌30 min。
1.2 方法
1.2.1 微生物总数平板计数
称取10 g酒醅，置于含90 mL无菌水的三角瓶中，加入玻璃珠，摇床150 r/min振荡30 min，使酒醅与水充分混合，吸取1 mL菌悬液进行梯度稀释后，取200 μL进行平板涂布，其中细菌计数采用倾注倒平板法。酵母和细菌分别放置于30和37 ℃培养箱中进行培养，培养2～3 d后，采用菌落记号方式进行酵母和细菌单菌落数的统计。
1.2.2 酒醅理化指标的检测
利用常规方法分析检测酒醅中水分、酸度、淀粉、还原糖、氨基酸态氮和粗蛋白，具体步骤参照文献[26]。
1.2.3 酒醅风味物质分析
称取1 000 g酒醅于磨口三角瓶内，模拟车间水蒸气蒸馏收集前段100 mL馏出液进行分析，溜出液用便携式密度计测定酒精度数，利用气相色谱仪检测微量成分组成及含量。气相色谱具体方法见文献[27]。
1.2.4 数据分析
利用SPSS 19.0 统计软件对酒醅微生物总数与各理化指标、风味物质进行Pearson相关性分析，|r| >0.7 且P<0.05 代表高度显著性相关。为了揭示不同时期酒质整体的变化，采用R语言中Vegen模块[28]对不同批次酒醅风味物质进行了主成分分析。同时对环境因子、酒醅微生物和酒醅风味物质之间相关性进行了冗余分析，并进了蒙特卡洛置换检验，以解释环境因子对酒醅发酵过程中微生物的影响以及环境因素、酒醅发酵过程中微生物对风味物质的影响。
2 结果与分析
2.1 酒醅发酵过程中酵母和细菌总数的动态变化
酒醅发酵过程中酵母总数的动态变化见图1，酵母总数在整个发酵过程中呈先上升后下降的趋势。在发酵2～4 d，酵母数量达到峰值，最高为108 CFU/g酒醅。发酵前期由于霉菌的糖化作用，使淀粉转换为大量能被酵母利用的糖类，所以酵母繁殖较快；发酵中后期，由于氧气的消耗和营养物质的降低，酵母的生长繁殖受限制，数量逐渐降低，最后稳定在106 CFU/g酒醅。
图1 酒醅发酵过程中酵母的动态变化
Fig.1 Dynamic change of yeast number in fermented grains
前期研究发现，清香型小曲白酒发酵过程中乳酸菌为主要的优势菌，酒醅发酵中后期乳酸菌占了90%[4]，故本次细菌总数计数以乳酸菌为主。酒醅发酵过程中细菌总数的动态变化如图2所示，发酵前期细菌总数进入一个迟滞期，发酵中后期才呈缓慢上升趋势。这是由于前期酒醅温度过低，加之酵母的快速增殖，细菌生长繁殖停缓；发酵中后期，温度上升，此时还原糖被酵母大量消耗，渗透压下降，加上酵母数量的减少，使酿造环境适宜细菌快速繁殖，所以细菌总数快速上升，最后稳定在107 CFU/g酒醅。
图2 酒醅发酵过程中细菌的动态变化
Fig.2 Dynamic change of bacteria number in fermented grains
2.2 酒醅发酵过程中理化指标的变化
酒醅中水分不足会影响微生物生长发酵，降低出酒率；水分过多致使细菌生长旺盛从而使酒醅易酸化，影响酒质，因此要合理的控制酒醅中的含水量。由图3可知，发酵过程中酒醅的含水量整体呈现上升趋势，水分在60%～75%。发酵0～4 d酒醅水分上升较快，发酵4 d后水分上升缓慢，逐步至一个稳定的状态。酒醅中水分的增加可能与酒醅中淀粉、蛋白质等大分子物质在微生物作用下逐步代谢为醇、醛、酸、酯等小分子物质，在各种生理生化反应中，同时产生大量的水分[29]有关。
图3 酒醅发酵过程中水分的动态变化
Fig.3 Dynamic change of water content in fermented grains
酸度是酒醅中所有酸性成分的总量，一定程度上反映了酒醅微生物生长代谢的变化情况。酒醅中的酸度不仅能够影响微生物的生长代谢，还是白酒中主要的呈味物质和香气成分的前体物质。适宜的酸度有利于酒醅糊化、糖化作用，还可以抑制有害微生物的污染[19]。如图4可知，发酵过程中酸度的变化呈整体缓慢上升的趋势，酸度在0.4～1 g/L。发酵前期，上升较缓慢；发酵中后期，相对平稳；发酵后期，酸度上升较快，这可能与中后期产酸细菌生长繁殖较活跃有关。
蛋白质是白酒生产过程中微生物必需的氮源，其水解产物游离氨基酸是酵母生长、繁殖的重要物质基础，同时游离氨基酸与糖发生的美拉德反应是谷氨酸等众多香味成分的前驱物质，对后期白酒品种、产量和质量有很大影响。菌体在生长过程中菌体蛋白水解为氨基酸和氨态氮(结构氨基酸在酵母等菌体生长发酵后期，由于原料减少，部分自溶、自发酵，释放成为游离氨态氮)，成为入窖发酵风味成香物质的前趋物质或本身就是呈香呈味物质。但是过量的蛋白所产生氨基酸便会提高酒体中高级醇的含量[30]。
图4 酒醅发酵过程中酸度的动态变化
Fig.4 Dynamic change of acidity in fermented grains
由图5可知，酒醅发酵过程中氨基酸态氮呈先下降后上升的趋势，发酵0～3 d氨基酸态氮呈下降趋势，这与此时期酵母快速增殖、以氨基酸态为氮源消耗氨基酸态氮有关。发酵3 d后酵母数量下降，此时氨基酸态氮含量逐渐稳步上升，酒醅中氨基酸态氮含量大都在0.2～0.8 g/kg。由图6可知，酒醅发酵过程中粗蛋白呈逐步上升的趋势，粗蛋白含量绝大部分在15%～30%。其中发酵0～3 d，酒醅中粗蛋白含量快速增加，发酵3 d后，粗蛋白处于一个平稳的状态，波动不大。
图5 酒醅发酵过程中氨基酸态氮的动态变化
Fig.5 Change of amino acid nitrogen in fermented grains
图6 酒醅发酵过程中粗蛋白的动态变化
Fig.6 Change of crude protein in fermented grains
酒醅中微生物代谢产生酒精需要有足够的淀粉转化成微生物可以直接利用的碳源，因此淀粉含量是酒精发酵的物质基础。淀粉糖化和发酵速度保持在相对平衡的状态，才能够保证酒醅发酵正常进行。由图7可知，不同时期淀粉含量变化一致，均是呈逐渐降低的趋势。其中酒醅发酵前期(发酵前3～4 d)淀粉含量迅速下降，发酵中后期淀粉含量呈缓慢下降趋势。发酵前期酒醅中含氧量较多，霉菌分泌的酶类将淀粉转化为酵母可以利用的还原糖类，为酵母的快速增殖提供碳源，从而使淀粉含量快速下降。发酵中后期，酒醅中乙醇浓度和酸度的增加，会影响微生物的生长代谢，从而使淀粉消耗速度变得逐步平缓。
图7 酒醅发酵过程中残余淀粉的动态变化
Fig.7 Change of starch content in fermented grains
酒醅中还原糖由淀粉酶水解淀粉而生成，还原糖既可以为微生物的生长提供能量，同时又被酵母利用生成酒精，酒醅中还原糖浓度的变化，一定程度上反映了糖化与发酵速度的平衡和协调关系。酒醅中残糖含量的多少，直接反映窖内酒醅发酵正常与否[18]。酒醅中还原糖含量变化见图8，还原糖在发酵1 d时达到最大，这是由于淀粉酶水解淀粉产生大量的还原糖，而此时酵母数量还未快速增加，所以还原糖含量有所积累。随着酵母数量的快速增加，需要还原糖作为碳源生长，故发酵1～3 d还原糖含量快速降低。发酵中后期由于酵母数量较少，加上酒醅中环境的变化，使还原糖含量的降幅逐渐趋于稳定。
图8 酒醅发酵过程中还原糖的动态变化
Fig.8 Change of reducing sugar in fermented grains
2.3 酒醅发酵过程中主要风味物质的变化
酒醅中的酒精含量是微生物代谢产生的，由图9可知，整个发酵过程酒醅中的酒精含量是逐渐增加的。发酵0～1 d增幅较小，发酵1～3 d快速增加；随着发酵时间的延长，发酵中后期酒精含量增幅较少，逐渐趋于平稳。且酒醅中酒精含量最高不超过60% vol。发酵前期由于氧气的大量存在，导致酵母以生长繁殖为主，故酒精含量较低；发酵中后期，由于氧气的消耗，酵母以无氧呼吸为主，产生大量的酒精。
图9 酒醅发酵过程中酒精含量的动态变化
Fig.9 Change of alcohol content in fermented grains
白酒中杂醇油(异丁醇和异戊醇的总和)主要是在酒精发酵过程中产生的，杂醇油含量过高会对人体造成伤害，还给酒的风味带来邪杂味，它是中国白酒苦味或涩味的主要来源之一，亦是造成我国白酒出现白色浑浊的原因之一[21]。正是由于杂醇油是酵母代谢产乙醇的副产物，故酒醅中杂醇油含量的变化与酒精含量变化基本保持一致。如图10所示，杂醇油含量随着发酵的进行呈逐渐增大的趋势，发酵前期增长较快，发酵中后期趋于平缓，变化幅度不大。
图10 酒醅发酵过程中杂醇油含量的动态变化
Fig.10 Change of fusel oils content in fermented grains
乙醛是酵母乙醇发酵的中间产物，其含量的变化主要与酵母菌种类和发酵条件相关。适量乙醛可能成为构成白酒香气的成分，但超过一定数量也会使白酒综合品质下降，同时可能有对人体害[31]。由图11可知，酒醅发酵过程中乙醛呈先增加后下降最后趋于稳定的趋势。发酵前期，乙醛含量迅速升高，这与酵母快速生长有关。发酵中期，酵母数量快速下降，导致乙醛含量迅速下降。发酵末期，此时酒醅中含糖量趋于零，酵母数量缓慢降低到达平稳期，致使乙醛含量缓慢降低。
图11 酒醅发酵过程中乙醛含量的动态变化
Fig.11 Change of acetaldehyde content in fermented grains
乙酸乙酯是清香型小曲白酒的主体香气成分，其含量高低很大程度决定着清香型白酒的质量及风格。酒醅中乙酸乙酯含量变化呈逐步累积增加的趋势(图12)，发酵前期增加较快，发酵中后期趋于稳定。说明乙酸乙酯的合成代谢，在发酵初期已经开始，随着乙醇与乙酸的积累，合成代谢速率有所增加。发酵中后期由于酯的分解作用，导致了酒醅中积累乙酸乙酯的速率下降，所以发酵中后期，乙酸乙酯含量趋于稳定。
图12 酒醅发酵过程中乙酸乙酯含量的动态变化
Fig.12 Change of ethyl acetate content in fermented grains
为了进一步解析不同时期酒质的变化，本文对不同批次酒醅中的6种主要风味物质(甲醇、乙醛、正丙醇、乙醇、乙酸乙酯和杂醇油)进行了主成分分析。主成分分析结果显示2015年和2016年5个批次的酒醅样品中风味物质的点并未明显区分开来(图13)，这表明不同时期的不同批次的酒醅风味物质之间并没有显著的差异，可见在小曲清香白酒新工艺条件下，不同时期白酒风味物质虽然有着波动变化，但仍呈现出相对较为稳定的趋势。而同一批次酒醅随着微生物发酵进行，其中的风味物质之间表现显著的变化。
图13 不同时期酒醅风味物质的主成分分析
Fig.13 Principal component analysis of flavor in fermented grain of different period
2.4 环境因素对酒醅发酵过程中微生物的影响
为了揭示酒醅发酵过程中影响微生物变化的环境因素，利用冗余分析(redundancy analysis,RDA)并采用蒙特卡洛对6个环境因子进行了置换检验。冗余分析结果显示环境因素解释了酒醅微生物群落动态变化的32.33%，蒙特卡洛检验结果显示氨基酸态氮、还原糖、粗蛋白(P<0.01)和水分(P<0.001)是影响酒醅发酵过程中微生物群落变化重要因素。其中氨基酸态氮、粗蛋白和水分与细菌总数、酵母总数呈负相关，而还原糖与微生物群落呈正相关(图14)。
Y-酵母；B-细菌；R-还原糖；S-淀粉；C-粗蛋白；A-氨基酸态氮；W-水分；Ac-酸度
图14 酒醅微生物结构和环境因子之间冗余分析
Fig.14 Redundancy analysis of microbes and environmental factors in fermented grain
因此酒醅中氨基酸态氮、还原糖、粗蛋白和水分变化推动着酒醅中微生物演替。从相关性分析中也可以看出，酸度对酵母群落变化有着显著影响，其含量与酒醅中酵母的数量呈显著负相关(R=-0.204，P<0.05)，随着酒醅中酸度在发酵后期逐渐上升，会抑制酵母的繁殖，有利于后期酵母将酒醅中糖类转化为酒精(表1)。
表1 环境因素与酒醅微生物和风味物质之间的Pearson相关性
Table 1 Pearson correlation between microbes,flavor and environmental factors in fermented grain during fermentation process
因素乙酸乙酯杂醇油正丙醇乙醛酒度甲醇酵母细菌酵母0.0090.0070.010.225*-0.243*0.34**--0.13细菌0.150.1290.090.0230.1440.079-0.13-还原糖-0.193-0.626**-0.564**0.105-0.797**0.0170.0710.013淀粉-0.385**-0.716**-0.554**0.057-0.802**-0.270.108-0.053粗蛋白0.434**0.567**0.485**-0.1090.865**0.068-0.093-0.12水分0.2120.7590.571**-0.0970.895**0.015-0.1720.021氨基酸态氮-0.235*-0.462**-0.283*0.084-0.374**-0.188-0.18-0.18酸度0.1890.148**0.455**-0.1480.454**-0.037-0.248*0.067
注:*:P<0.05，**:P<0.01。
2.5 环境因素和酒醅微生物对风味物质的影响
为了解析影响发酵过程中酒质变化的因素，分析了酒醅风味物质与环境因子和酒醅微生物的相关性，Pearson相关系数显示还原糖、淀粉、粗蛋白、氨基酸态氮和酸度与杂醇油、正丙醇和酒度呈显著性相关(P<0.05)，水分与正丙醇和酒度呈显著性相关(P<0.05),乙酸乙酯则与淀粉、粗蛋白和氨基酸态氮显著相关，而乙醛和甲醇含量与环境因子之间相关性不具有统计学意义。在微生物方面，酵母与乙醛、酒度和甲醇之间显著相关(P<0.05)，而细菌与主要的风味物质含量之间相关性不显著。同样冗余分析结果显示环境和微生物因素共解释了酒醅风味物质38.44%的变化。蒙特卡洛检验结果显示水分(P<0.05)、酵母、还原糖(P<0.01)和淀粉(P<0.001)是影响酒醅中风味物质的重要因素，推动不同发酵时期风味物质组成以及含量发生变化(图15)。
Y-酵母；B-细菌；R-还原糖；S-淀粉；C-粗蛋白；A-氨基酸态氮；W-水分；Ac-酸度；E-乙酸乙酯；F-杂醇油；N-正丙醇；Ace-乙醛；Al-酒度；M-甲醇
图15 酒醅风味物质与环境因子和微生物之间冗余分析
Fig.15 Redundancy analysis of flavor,microbes and environmental factors in fermented grain
作为白酒微生物重要组成的乳酸菌在分析中并没有呈现出对风味物质有重要贡献。这可能是由于乳酸菌的主要产物—乳酸挥发性较弱，蒸馏后进入白酒中的比例较低，且平板计数也存在误差，因此在本次实验中细菌数量与酒醅酸度未呈现出显著性相关。
3 结论与讨论
小曲清香型白酒机械化生产工艺作为白酒生产新工艺，区别于传统白酒酿造，实现了全程机械化，信息化，现代化，有效地确保酿造工艺稳定性。在机械化白酒酿造中，作为重要催化剂的微生物，处在不同于传统白酒开放式生产环境下，群落动态将会出现其独特变化，同样微生物代谢产生的风味物质也随之形成其特有变化趋势[11,32]。因此开展酿酒微生物、环境和白酒风味品质之间相互作用的研究将有助于解析机械化白酒生产过程中风味物质形成机理。
对2015年和2016年共5个批次酒醅研究显示不同时期酒醅各项指标变化趋势相似，进一步表明了新工艺的相对稳定性。冗余分析结果表明，环境因素是影响新工艺酒醅中微生物群落变化的重要因素，酒醅中氨基酸态氮、还原糖、粗蛋白和水分变化推动着酒醅中微生物演替，尤其是在酵母类群的方面。酒醅发酵过程中还原糖和氨基酸态氮作为酵母可以利用的碳、氮源，为发酵前期酵母快速增殖提供了营养物质，因此还原糖和氨基酸态氮在发酵前期(0～3 d和1～3 d)含量呈现下降趋势。乳酸菌作为清香型白酒酒醅中优势微生物类群，在发酵过程中数量较为稳定，可以代谢产生乳酸、乙酸等，维持酸性酿造环境，同时为其他发酵微生物提供了营养物质和风味化合物的前体物质[33]。
环境因子和微生物是驱动酒醅风味物质生成的重要因素[34]。李小龙和王鹏等对浓香型和芝香型白酒发酵过程中微生物群落演替进行研究，发现微生物代谢导致的化学因素改变是群落演替的关键推动力[7-8]。随着酿造微生物群落结构改变，其代谢产生的风味物质也随之改变。本研究结果显示环境因子(水分、还原糖和淀粉)和酵母是影响机械化清香型小曲白酒酒醅中风味物质的重要因素，推动不同发酵时期风味物质组成以及含量发生变化。清香型小曲白酒酿造过程中，高粱中的淀粉作为微生物代谢的重要底物，被微生物分解转化为还原糖。酿酒酵母和产酯酵母、乳酸菌利用还原糖进行增殖与发酵产生代谢产物，产生乙醇、乙酸乙酯等小曲中重要的呈香物质[35]。酒醅含水量与各种微生物的生化活动有密切的关系，含水量促进了窖池中微生物的生长、代谢和发酵，保证了还原糖的有效转化。环境因素和微生物相互作用形成了清香型小曲原酒独特风味。在小曲清香白酒新工艺条件下，不同时期的不同批次酒醅中的风味物质之间虽然有着波动变化，但之间没有显著差异，呈现出了与传统工艺生产条件下不同的风味组成。这表明小曲白酒酿造新工艺在一定程度上摆脱了传统工艺生产过多依赖于经验的问题，通过机械智能对酿造环境因子和微生物群落进行调控，形成稳定酿酒生态微环境，有助于维持酒体风味物质稳定。
本研究对不同时期清香型小曲白酒新工艺酒醅发酵过程中的环境因素、微生物动态变化和风味物质变化规律进行探讨，并利用多元统计分析方法探究了环境因素对酒醅微生物以及环境因素、酒醅微生物对酒醅风味物质的影响。分析结果显示不同时期不同批次的酒醅环境因子、微生物动态变化和风味物质之间并没有显著的差异；且环境因子水分、还原糖和淀粉以及酵母总数是影响酒醅中风味物质的重要因素。这对于解析清香型小曲白酒发酵的机理以及通过调整生产参数提高固态发酵过程的可控性具有重要意义。
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