树莓为蔷薇科悬钩子属植物，又名木莓、托盘、覆盆子等，果实柔软多汁，酸甜可口，被FAO推荐为“生命之果”[1]。其含有丰富的鞣花酸、水杨酸、黄酮等酚类物质以及SOD(超氧化物歧化酶)，具有很高的抗氧化作用和药用价值[2]。但是，树莓果皮极薄，组织娇嫩，结构易碎，且呼吸速率高，是一种极易腐败的果品，在贮藏、运输过程中易受机械损伤和微生物侵染，极易失去商品价值[3]。因此，树莓货架期的品质维持是亟待解决的问题。
Ca2+是植物生长发育过程中必不可少的矿物质元素之一。作为植物体内的第二信使，参与调节细胞内各类酶的活性与代谢。钙使植物细胞细胞壁硬度增加，降低质膜透性[4]，调节呼吸代谢速率，抑制乙烯合成，延缓衰老，从而延长果实货架期[5]。目前，在西兰花[6]、苹果[7]、甜瓜[8]、彩椒[9]等蔬菜和水果已有大量报道。果胶甲酯酶可以降低高酯果胶的酯化度(将高甲氧基果胶转化为低甲氧基果胶)，从而形成果胶酸，而果胶酸和外源添加的Ca2+在原位形成坚固、不可逆的果胶酸钙网络结构，防止果胶物质溶出，提高果蔬品质[10]。李晓等[10]研究外源果胶甲酯酶(exogenous pectin methylesterase,ePME)对腌渍黄瓜质构特性的影响，表明外源果胶甲酯酶可提高腌渍黄瓜的硬度、咀嚼度。ANTHON等[11]研究发现果胶甲酯酶可以有效提高白萝卜泡菜的脆度。然而，果胶甲酯酶在采后树莓保鲜方面应用尚未报道。本实验主要研究外源添加果胶甲酯酶对树莓贮藏品质的影响，以期为树莓保鲜提供新的技术。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红树莓(品种为R20)：2018年10月16日采自章丘市龙山莓园；果胶甲酯酶： DSM有限公司(Rapidase®PEP)；乙醇：天津市富宇精细化工有限公司; DPPH：阿拉丁试剂上海有限公司;NaOH：国药集团化学试剂有限公司;蒽酮、FeCl3、铁氰化钾：天津市科密欧化学试剂有限公司,以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
YP20002电子天平，金诺天平仪器有限公司；V-1100D分光光度计，上海美欧达公司；SK3200HP超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；DK-98-Ⅱ水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；TGL16冷冻离心机，长沙英泰仪器有限公司；FLF-YS-828L型恒温保鲜柜，北京福意电器有限公司；SHIMADZU高效液相色谱仪(HPLC)LC-20A，日本岛津公司。
1.3 实验方法
1.3.1 前处理方法
选取无病虫害、无机械伤且成熟度一致的树莓，随机分为3组，分别是对照组(无任何保鲜剂)、氯化钙处理组(CaCl2)、果胶甲酯酶与氯化钙复配处理组(CaCl2+ePME)。其中，对照组：用清水浸泡树莓1 min，于室温自然晾干；CaCl2处理组：称取2 g的CaCl2溶于1 000 mL蒸馏水中，配置成质量浓度为0.2 g/L CaCl2溶液浸泡树莓1 min，于室温自然晾干；CaCl2+ePME处理组：吸取0.5 mL果胶甲酯酶溶液，以及称取2 g的CaCl2，共同溶于1 000 mL蒸馏水中，用柠檬酸缓冲溶液调pH值至4.5, 在40 ℃条件下保温20 min。将树莓果实浸泡1 min,取出后自然晾干。将所有样品置于塑料托盘内，放在保鲜柜(温度(4±1)℃，湿度(90±5)%)中贮藏，每隔3 d取样，观察并测定相关指标。
1.3.2 指标测定
1.3.2.1 有机酸的提取和测定
参照陈明[12]的方法，略有改动。称取2 g的果实样品在液氮中研磨并溶解于5 mL、 80%(体积分数)乙醇中，在35 ℃的条件下放置后，以10 000 r/min转速离心10 min后收集上清液并用80%乙醇稀释到25 mL，提取2 mL的溶液在45 ℃条件下旋转蒸干后将剩余物溶解在1 mL的蒸馏水中，用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。将20 μL的样品注入ODS-C18柱进行液相分析，SPD-20A检测器，检测波长210 nm。以流速为0.8 mL/min, 50 mmol/L的(NH4)2HPO4作为流动相，并用H3PO4将pH值调整至2.7。结果用mg/g新鲜果实表示。
1.3.2.2 糖组分的提取和测定
参照OLSEN等[13]的方法，有少量改动。称取1.5 g样品在液氮中磨成粉末并溶解于40 mL 80%乙醇中。超声提取30 min后过滤。上清液在50 ℃ 条件下旋转蒸干后将剩余物溶解于10 mL V(乙晴)∶V(水)=70∶30中，用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。色谱柱为NH2柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，柱温30 ℃，以RID-10A为检测器进行液相分析。流动相为V(乙晴)∶V(水)=80∶20中，流速为0.7 mL/min，进样量20 μL。外标法，结果用mg/g新鲜果实表示。
1.3.2.3 品质指标测定
可溶性糖测定采用蒽酮比色法[14]。总酸参考GB/T 12456—2008(食品中总酸的测定)进行测定，略有改动。Vc测定参照马宏飞等[15]紫外分光光度法，略有改动，标准曲线为y=0.058x+0.003，R2=0.999 3。
1.3.2.4 黄酮、抗氧化活性测定
黄酮参照曹建康等[16]的方法测定。黄酮物质以每克果实在波长325 nm处吸光值(OD325)表示。抗氧化活性：还原力采用MAO等[17]的方法，略有改动，在700 nm下测定吸光值；DPPH自由基清除能力测定采用BRAND-WILLIAMS等[18]的方法，在波长为517 nm处测得吸光值。
1.4 数据处理
用Excel 2010软件绘制图表，并用SPSS 21.0统计软件进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 样品分析
2.1.1 树莓果实中有机酸的保留时间及峰型确定
由有机酸的混合标准样和样品的色谱出峰情况来看，总体分离情况较好。标准样品中草酸和D-酒石酸距离较近。样品中D-酒石酸峰型尖锐，而草酸峰型较差，保留时间偏移较大(图1)。
A-标准样品；B-树莓样品
图1 有机酸混合标准样和树莓样品的高效液相色谱出峰图
Fig.1 HPLC chromatograms of organic acid standards,organic acid extracted from red raspberries
注：1-草酸(3.281 min)；2-D-酒石酸(3.544 min)；3-L-苹果酸
(4.138 min)；4-柠檬酸(5.250min)；5-琥珀酸(6.800 min)。
2.1.2 树莓果实中糖组分保留时间及峰型确定
由糖的混合标准样和样品的色谱出峰情况来看，果糖、葡萄糖、蔗糖峰型尖锐，高效液相色谱法达到很好的分离效果(图2)。
A-标准样品；B-混合样品
图2 糖组分混合标准样和树莓样品的高效液相色谱出峰图
Fig.2 HPLC chromatograms of sugars standards,sugars extracted from red raspberries
注：1-果糖(8.077 min)；2-葡萄糖(8.746 min)；3-蔗糖(11.185 min)。
2.2 树莓果实有机酸代谢
有机酸是一类天然化合物，在果实生长发育阶段不断积累，在果实成熟阶段被当作呼吸底物不断消耗[19]，形成特定的糖酸比。从图3中可以看出，树莓中主要的有机酸是柠檬酸，其次是L-苹果酸，而D-酒石酸和琥珀酸的含量相对较少。
CaCl2单独处理以及与外源果胶甲酯酶复合对不同种类的有机酸影响是有区别的。如图3-A所示，对照组中D-酒石酸呈现先下降后上升的变化趋势，而CaCl2+ePME和CaCl2处理组中D-酒石酸均呈现“波动状”，在第3天出现最小值，分别为1.65和1.68 mg/g。贮藏至第6天，对照与各处理组之间开始出现显著性差异(P<0.05)，这说明CaCl2单独处理和复合处理均能延缓树莓果实中D-酒石酸的降解，保持果实酸度。图3-B中，贮藏至12 d时，CaCl2+ePME处理组L-苹果酸显著高于对照组(P<0.05)，而与CaCl2处理组之间无差异(P>0.05)。这说明相比于对照组和CaCl2处理组，复合处理更有利于保持果实中L-苹果酸的含量。图3-C中，对照组和CaCl2+ePME处理组中柠檬酸含量在贮藏过程中变化较小，分别为5.18和3.78 mg/g，而CaCl2处理组中柠檬酸含量的极差高达7.01 mg/g。图3-D所示，对照组以及各处理组中琥珀酸含量变化均呈“波动状”。贮藏至第12天，CaCl2+ePME处理中琥珀酸是对照组的1.25倍，达到极显著水平(P<0.01)，这说明CaCl2+ePME处理可以延缓果实中琥珀酸的减少。因此，在果实贮藏后期，各处理组均可以减缓各种有机酸的降低，保持果实的口感和品质，延长货架期。结合表1中总酸的变化趋势，可以得知总酸与有机酸的变化呈一定的相关性，在贮藏后期，果胶甲酯酶和CaCl2复合处理对酸度调节作用更明显。
A-D-酒石酸；B-L-苹果酸；C-柠檬酸；D-琥珀酸
图3 CaCl2单独以及与果胶甲酯酶复合处理对树莓中有机酸的影响
Fig.3 Effect of CaCl2 alone and combined with exogenous pectin methylesterase on organic acid of raspberry fruit
注：不同的大写字母表示组内存在显著性差异(P<0.05);不同的小写字母表示组间存在显著性差异(P<0.05)。下同。
2.3 树莓果实糖组分代谢
果实中的糖分主要来源于植物光合作用，而果实采后由于缺少光合器官的供给，糖分作为呼吸底物进行消耗。果实会优先利用糖类维持呼吸作用，其次是有机酸，蛋白质和脂肪较少[20]。树莓中以果糖、葡萄糖和蔗糖为主。由图4可以看出，在贮藏3～9 d时，CaCl2处理可以显著保持果实中的果糖和葡萄糖(P<0.05)，而对于蔗糖影响较小。这说明树莓果实首先利用单糖作为呼吸底物，其次是多糖。CaCl2处理有效减缓了果实中果糖和葡萄糖的消耗，有利于糖分的积累，调节呼吸代谢，进而保持果实的口感和品质。
A-果糖；B-葡糖糖；C-蔗糖
图4 CaCl2单独以及与果胶甲酯酶复合处理对树莓中糖组分的影响
Fig.4 Effect of CaCl2 alone and combined with exogenous pectin methylesterase on carbohydrate composition of raspberry fruit
2.4 可溶性糖和总酸、Vc含量
可溶性糖是评价果实风味的重要指标之一，树莓中的可溶性糖在贮藏中后期出现回升，可能由于果实在成熟过程中，将部分有机酸转化成糖，使糖的含量有小幅增加。CaCl2+ePME和CaCl2处理的树莓中可溶性糖在整个贮藏期间极差分别为1.45%和1.34%，这说明CaCl2处理有利于维持果实中可溶性糖的稳定。
各处理组中，树莓果实的总酸含量整体呈下降趋势，且在贮藏后期(9 d和12 d)降幅较大，这是由于果实自身呼吸代谢消耗。贮藏至12 d时，对照组比新鲜果实减少了37%，CaCl2和CaCl2+ePME处理分别减少了30%和17%，差异达到显著水平(P<0.05)，这说明CaCl2以及与果胶甲酯酶复合处理均可以延缓果实中总酸的下降，且复合处理效果更好。随着贮藏时间不断延长，对照组Vc含量呈整体下降趋势，而CaCl2与CaCl2+ePME处理组在12 d均出现显著上升趋势(P<0.05)，分别是对照的1.34倍和1.67倍。这表示在贮藏后期处理组均能延缓树莓果实中Vc含量的下降，有利于保持果实品质，延长货架期，且复合处理组保鲜效果好于其他处理组(表1)。
表1 氯化钙单独及与果胶甲酯酶复合处理对树莓可溶性糖、总酸和Vc含量的影响
Table 1 Effect of CaCl2 alone or combined with exogenous pectin methylesterase on soluble sugar,total acid and Vc content of raspberry fruit
测定指标组别贮藏时间/d036912CK5.17±0.26a4.34±0.60a4.51±0.28a4.90±0.18a4.84±0.25a可溶性糖/%CaCl25.17±0.26a3.83±0.20b4.38±0.42a4.40±0.54a4.33±0.11bePME+CaCl25.17±0.26a4.07±0.19ab4.42±0.14a3.72±0.46b4.28±0.10bCK7.52±1.13a7.52±0.23b7.36±0.00a6.08±0.22b4.80±0.00c总酸/(g·kg-1)CaCl27.52±1.13a8.96±1.36a7.52±1.13a6.40±0.45a5.28±0.22bePME+CaCl27.52±1.13a7.04±0.91b6.08±0.45b6.56±0.23a6.24±0.03aCK11.85±1.10a13.36±0.00a9.27±1.52a15.52±1.83a7.32±0.21cVc/[mg·(100 g)-1]CaCl211.85±1.10a10.76±1.83b5.81±0.91c5.60±0.61c9.91±0.53bePME+CaCl211.85±1.10a10.77±0.61b8.62±1.22b6.90±1.22b12.28±0.11a
注：组内相同字母代表无显著差异(P>0.05),组内不同字母代表有显著差异(P<0.05)。
2.5 黄酮、还原力和DPPH自由基清除能力
由图5-A和图5-B可知，随着贮藏时间的延长，各处理组中树莓的还原力和DPPH自由基清除能力总体呈上升趋势。贮藏至第6天时，CaCl2+ePME和CaCl2处理树莓中的还原力和DPPH自由基清除能力均显著高于对照组(P<0.05)，这说明二者均可提高树莓的抗氧化能力。贮藏至第9天时，CaCl2处理组中树莓的还原力和DPPH自由基清除能力显著高于CaCl2+ePME处理组(P<0.05)，这表明CaCl2处理更能有效提高果实中抗氧化能力，延缓果实衰老。
与之类似的，由图5-C可以看出，对照组和处理组的树莓在贮藏期间黄酮含量总体呈上升趋势。在贮藏第9天，CaCl2处理组中树莓黄酮含量明显高于CaCl2+ePME和对照(P<0.05)，分别是复合处理的1.23倍，对照的1.21倍，这说明与其他处理组和对照组相比，CaCl2单独处理更能有效延缓果实中黄酮的降解。
A-还原力；B-DPPH自由基清除能力；C-黄酮
图5 CaCl2单独以及与果胶甲酯酶复合处理对树莓抗氧化能力的影响
Fig.5 Effect of CaCl2 alone and combined with exogenous pectin methylesterase on antioxidant ability of raspberry fruit
3 讨论
有机酸是形成树莓果实口感和品质的独特组分。树莓中柠檬酸含量高于其他有机酸，因此是柠檬酸优势型果实。这与CEKIC等[21]、旷慧等[22]报道结果一致。柠檬酸产生酸感快，但持续性差；而苹果酸产生酸感爽口且较慢，持续性较好。旷慧等[22]研究6种树莓果实中均不含酒石酸，与本实验研究结果存在差异，可能是由于树莓的本身品种以及实验的分离条件存在差异。果实中糖组分主要有葡萄糖、果糖和蔗糖。LIU等[23]使用茉莉酸甲酯对樱桃番茄进行采后处理，其葡萄糖和蔗糖显著高于对照，而果糖以及总糖含量没有变化。这与HUANG等[24]研究茉莉酸甲酯对贮藏期间蓝莓糖组分的变化结果一致。而本实验通过外源果胶甲酯酶和CaCl2处理，树莓果实中葡萄糖和果糖显著提高，但蔗糖影响较小。这可能与果实的种类以及保鲜处理方式有关。酚类物质、DPPH与果实抗氧化能力有关。本实验中添加Ca2+能有效提高果实中黄酮含量、还原力以及DPPH自由基清除能力。这与武继芸[25]研究的结果一致，这与Ca2+有效调节果实的次生代谢有关。
果胶甲酯酶(pectin methylesterase，PME)对果实的质构特性(硬度、脆度、咀嚼度)有重要的影响。谢玮等[26]研究不同采收季莲藕中果胶甲酯酶对质构的影响时发现，莲藕硬度与果胶甲酯酶活性呈正相关，而与酯化度呈负相关关系。杜小琴等[27]研究表明，经过果胶甲酯酶处理泡菜的酯化度明显降低，脆度提高。宗迪等[28]研究表明，果胶甲酯酶处理有效提高苹果切块的硬度保持率(48.5%)高于未处理苹果切块(32.5%)。因此，外源果胶甲酯酶处理对树莓质构特性的影响有待于进一步研究。
YANG等[29]研究在真空条件下，乳酸钙和PME处理鲜切木瓜的硬度和咀嚼度分别是未处理木瓜的8.02和7.83倍。这与ZHANG等[30]研究结果相同。在真空条件下，冬枣经过果胶甲酯酶与CaCl2的复合处理，果实品质有明显改善。这主要是由于真空作用促进果胶甲酯酶和Ca2+的充分渗透。而本实验中果胶甲酯酶处理效果不明显，可能是由于浸泡时间较短，外源果胶甲酯酶以及Ca2+未能深入至果实组织内部，今后可采用真空、超声辅助等措施，以到达更好的保鲜效果。
4 结论
树莓果实的口感和品质由糖和有机酸的种类和含量决定。在贮藏前期，CaCl2单独处理可以保持果实中较高的葡萄糖和果糖，维持可溶性糖的稳定，有利于糖分的积累，但对于蔗糖没有任何影响；而贮藏后期，果胶甲酯酶和CaCl2复合处理更有利于延缓果实中各种酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸的降解，维持果实中总酸的含量。果胶甲酯酶、CaCl2单独和复合处理均能提高树莓果实中黄酮含量，增强还原力和DPPH自由基清除能力，且CaCl2单独处理效果较好。结果表明，CaCl2和外源果胶甲酯酶处理可保持树莓果实的品质，延长货架期。
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