干红葡萄酒中的酚类物质(phenolic substances)主要源于酿酒葡萄，根据化学结构可分为类黄酮及非类黄酮两大类。由于其特殊的理化性质，酚类物质的组成和含量水平，与葡萄酒的色泽、收敛性、苦味以及酒体结构等感官特征都有着密切的关系[1]。此外，酚类物质还具有较髙的生理活性，是构成葡萄酒抗氧化、预防疾病等功效的重要成分[2]。干红葡萄酒的色泽是葡萄酒感官特征的重要指标之一，提供了酿酒葡萄品种、葡萄酒类型、酒龄及储存期的稳定性等信息，在葡萄酒感官质量、评价体系以及内在品质中起着重要作用，是消费者选购和品评葡萄酒的重要参考因素[3]。
近年来，由于冷浸渍工艺对葡萄酒品质具有良好的提升作用，尤其是在红葡萄酒的酿造过程中，受到越来越多的关注和应用。在红葡萄酒酿造中，冷浸渍工艺通常是指在较低温度下(5～15 ℃)对葡萄果实或葡萄醪进行一段时间的浸渍，低温浸渍结束后再启动酒精发酵[4]。与酒精发酵过程中和发酵结束后的酒精溶液浸提过程不同的是，冷浸渍是在无酒精状态下纯水相对葡萄原料中的酚类物质和香气物质进行浸提的过程[5]。有研究表明，冷浸渍工艺可以提高葡萄酒中酚酸类物质的含量，增加酒体的丰满度[6]；提升香气的浓郁度和复杂性[7]，增添葡萄酒中的果香和花香特征[8]。
目前冷浸渍工艺在国内较多的葡萄酒企业中推广得到普及，但相关工艺参数大多是经验性质或借鉴国外研究，其中浸渍时间是决定冷浸渍技术效果的重要因素。现有的关于冷浸渍对葡萄酒的研究主要集中在香气物质组成上，对葡萄酒酚类物质和色泽品质影响的研究还很少。为此本试验结合工业生产需要，通过发酵前冷浸渍处理工艺进行葡萄酒酿造试验，以传统工艺所酿葡萄酒为对照(CK)，对所得酒样理化指标、酚类化合物及色泽相关参数进行测定，并通过相关性分析和主成分分析法，综合评价其最佳冷浸渍时间，以期为冷浸渍工艺在干红葡萄酒的酿造生产中提供一定的理论依据和技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验用酿酒葡萄品种为梅鹿辄(Merlot)，2018年9月3日采自新疆芳香庄园股份有限公司有机酿酒葡萄种植园，含糖量232.69 g/L(以还原糖计)，可滴定酸6.07 g/L(以酒石酸计)。
没食子酸、芦丁、儿茶素、p-DMACA：Sigma-Aldrich公司；单宁酸：上海山浦化工有限公司；HCl、Na2CO3(分析纯)：天津光复科技发展有限公司。
1.2 仪器与设备
TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器有限公司；BCD-160冰箱，青岛海尔有限公司；PL303分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；DZK W-D2恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 不同冷浸渍工艺干红葡萄酒的酿造
原料采摘筛选后，进行除梗破碎，添加30 mg/L SO2入60 L不锈钢发酵罐，启动酒精发酵之前，将葡萄醪液置于机械冷库降温至8 ℃，分别进行3、5、7 d的低温浸渍，期间每6 h进行1次循环操作，冷浸渍结束后将发酵罐转至室温(22～25 ℃)下，待温度回升至 15 ℃接入200 mg/L商业酵母(Actiflore，F15)以启动酒精发酵，发酵温度控制在25～28 ℃。酒精发酵结束后，接入乳酸菌LALVIN 31(lallemand fermented beverages)启动苹果酸-乳酸发酵，发酵温度控制在18～20 ℃，苹果酸-乳酸发酵结束后分离转罐，添加50 mg/L SO2 终止发酵，随后进行正常澄清稳定处理工艺，酿造次年3月，葡萄酒装瓶，进行分析检测。
对照组酒样采用传统干红工艺酿造，原料入罐后接入上述商业酵母启动酒精发酵，后续操作与上述冷浸渍酿造工艺一致。
1.3.2 葡萄酒常规理化指标的测定
参照GB/T 15038—2006中方法[9]测定葡萄酒中总糖(以葡萄糖计)、酒精度、总酸(以酒石酸计)、挥发酸(以醋酸计)、干浸出物、pH、游离SO2和总SO2等指标，所有酒样均重复测定3次。
1.3.3 葡萄酒酚类化合物含量的测定
葡萄酒中总酚含量采用Folin-Ciocalteu比色法测定(以没食子酸计)[10]，总单宁含量采用Folin-Denis法测定(以单宁酸计)[11]，总花色苷含量采用pH示差法测定(以二甲基花翠素-3-葡萄糖苷计)[12]，总类黄酮含量参考PEINADO等[13]的方法测定(以芦丁计)，总黄烷醇含量采用p-DMACA-盐酸法测定(以儿茶素计)[14]，每个指标设3次重复。
1.3.4 葡萄酒CIELab颜色参数的分析
酒样经0.45 μm滤膜过滤，稀释10倍后置于2 mm 光径石英比色皿中，以纯水作为参比，在400～700 nm UV-Visible谱段连续扫描，扫描间隔1 nm，计算选用CIE1964做标准，根据光谱值找出450、520、570、630 nm波长处的4个吸光度，依据公式建立CIE颜色坐标系，继而得到L*(亮度)、a*(红色调)、b*(黄色调)、Cab(饱和度)和Hab(色调角)参数值[15]，每个指标设3次重复。
1.3.5 葡萄酒色泽相关参数的测定
采用紫外可见分光光度计分析葡萄酒酒色(wine color，WC)、聚合色素(polymeric pigment color，PPC)、总色素(total color of pigments，WCP)，测定参考郝笑云[16]的方法，每个指标设3次重复。
1.3.6 数据统计分析
采用Excel 2010进行数据统计；通过SPSS 19.0对数据进行单因素方差分析、相关性分析以及主成分分析，利用Origin 8.5软件绘图。
2 结果与分析
2.1 不同冷浸渍时间对干红葡萄酒常规理化指标的影响
由表1可知，不同处理所得葡萄酒酒精度、总糖、总酸、挥发酸、干浸出物、pH值、游离SO2和总SO2等指标均符合国家标准GB/T 15037—2006中对干红葡萄酒的要求。
表1 不同处理干红葡萄酒的常规理化指标
Table 1 Routine physical and chemical indexes of dry red wine treated differently
理化指标CK冷浸渍时间/d357酒精度/(%,体积分数)13.44±0.14b13.52±0.25b13.85±0.19a13.77±0.29a总糖/(g·L-1)2.62±0.17c2.68±0.09c3.17±0.15a2.86±0.32b总酸/(g·L-1)5.55±0.69d6.26±0.35c6.57±0.59b6.64±0.32a挥发酸/(g·L-1)0.33±0.08a0.34±0.05a0.27±0.04b0.26±0.07b干浸出物/(g·L-1)26.36±1.98d27.83±1.33a27.13±2.86c27.47±1.27bpH3.91±0.42a3.83±0.77c3.84±0.83b3.81±0.45d游离SO2/(mg·L-1)27.55±1.42b28.26±0.86a26.86±1.23c24.58±1.62d总SO2/(mg·L-1)52.12±1.89b54.35±1.56a50.78±2.02d51.20±2.51c
注：同行肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同。
其中，冷浸渍5和7 d处理所得酒样中酒精度显著高于对照组(P<0.05)，冷浸渍3 d与对照组间则无显著差异，主要是由于较长时间的浸渍促进了果皮中氮元素的释放，在酒精发酵期间影响酵母活性，使其转化更多的糖为酒精[17]；随着冷浸渍时间的延长，总酸逐渐升高，其中冷浸渍7 d酒样中总酸含量最高，CK对照组酒样总酸含量显著低于其他冷浸渍处理组(P<0.05)，并且冷浸渍处理酒样pH值均有所降低，这可能是浸渍过程促进葡萄果实中有机酸物质向葡萄汁中转移，进而影响葡萄酒酸度及pH值，这与多数研究一致[18]；通过对酒样挥发酸的检测，可以了解葡萄原料新鲜度及发酵过程管理是否得当，结果显示各处理之间差异不显著，说明不同冷浸渍处理均能进行正常的酒精发酵过程；干浸出物含量是影响葡萄酒质量的重要指标，相比于对照，冷浸渍处理显著提高了葡萄酒中干浸出物的含量，表明该处理使得酒体更加饱满、醇厚；此外，各处理间其他理化指标并无显著差异。
2.2 不同冷浸渍时间对干红葡萄酒酚类化合物的影响
酚类化合物是影响葡萄酒质量的重要组成部分，赋予了葡萄酒独特的感官品质(色泽、苦味、收敛性)，其组成和含量与葡萄酒品质密切相关[19]。由图1可以看出，经过发酵前冷浸渍处理后，葡萄酒总酚含量显著提升，其中冷浸渍3、5、7 d所得酒样总酚含量较对照组分别增加了9.8%、11.9%和16.9%，而冷浸渍3 d与5 d之间差异不显著(P>0.05)。单宁是一类具有鞣性的多元酚，是葡萄酒中主要的涩感物质[20]；冷浸渍酒样中单宁含量显著高于对照组(P<0.05)，且随着浸渍时间的延长，其单宁含量显著增加，但冷浸渍5与7 d处理之间差异不显著。花色苷主要存在红色品种葡萄的果皮中，是干红葡萄酒呈色的主要化合物[21]；冷浸渍酒样中花色苷含量随浸渍时间的延长略微增加，各处理组之间差异不显著，但与对照组差异显著，这是由于在低温条件下葡萄果实中大分子酚类物质的溶出受到一定的限制[22]。类黄酮是葡萄酒中含量最高的一类物质，与酒体的感官品质密切相关，能够与花色苷发生反应形成辅色效应，进而提高葡萄酒色泽稳定性[23]；冷浸渍达到7 d时，其葡萄酒中类黄酮含量最高，达到2 880.79 mg/L，且其他处理组类黄酮含量也均显著高于对照组，但浸渍3与5 d之间差异不显著，说明短时间的低温浸渍并不利于干红葡萄酒中类黄酮物质的积累。黄烷醇是葡萄酒中重要的酚类物质，是构成葡萄酒苦味、收敛性和结构的主要成分[24]；相比于对照，冷浸渍处理显著提高了干红葡萄酒中的黄烷醇含量，但各处理组之间差异不显著，即在一定浸渍时间内，黄烷醇不是浸渍时间越长含量越高。综上可知，通过控制发酵前冷浸渍时间可有效提高葡萄酒中酚类物质含量。
图1 不同处理干红葡萄酒中酚类物质含量
Fig.1 Content of phenolic substances in dry red wine under different treatments
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2.3 不同冷浸渍时间对干红葡萄酒色泽品质的影响
色泽是干红葡萄酒重要的感官特征，在葡萄酒的质量评价中起视觉导向作用，并可能影响消费期望[25]。在CIELab(D65)坐标体系中，L*表示颜色的明暗程度，与葡萄酒的色泽深浅呈负相关，由表2可知，葡萄酒的L*值随冷浸渍时间的延长逐渐降低，其中浸渍7 d的L*值最小，而对照酒样的L*值显著高于各处理组(P<0.05)，表明经冷浸渍处理的酒样颜色较深。葡萄酒中a*值与酒体红绿程度相关，干红葡萄酒a*值越大，其红色调越强；冷浸渍3、5和7 d所得酒样a*值与对照组相比增加了10.41%、14.75%和27.78%，表明冷浸渍处理后酒样的颜色更红，其原因可能是随着浸渍时间的延长，果皮中更多的花色苷被浸提出来，a*值逐渐增大。b*值表示葡萄酒中的黄色调，其中对照酒样的b*值最大，而冷浸渍处理使葡萄酒b*值显著降低，研究表明，葡萄中呈黄色调的酚类物质(黄烷醇类)浸入酒体后，会与花色苷相作用形成辅色效应，增强葡萄酒色泽[26]，从而导致浸渍后酒体的黄色调不明显。Cab值的大小与葡萄酒颜色的饱和度相关，试验结果显示Cab值的变化趋势与a*值相似，都随浸渍时间的延长呈上升趋势，而色调Hab则与b*值呈正比，Hab值越接近0，则葡萄酒越接近红色，因此表明冷浸渍处理酒样色泽鲜艳，外观品质较好。葡萄酒酒色(WC)包含了易被氧化的花色苷，而总色素(WCP)与游离态的花色苷密切相关，聚合色素(PPC)则是单体花色苷与酚类物质间相互作用聚合而成的色素，对葡萄酒陈酿潜力有一定预测价值，上述与葡萄酒颜色相关联的指标，可对葡萄酒色泽品质进行更加全面的评价。结果显示冷浸渍处理可提升酒样中的WC、WCP和PPC含量，且均显著高于对照组，其中冷浸渍7 d最高，冷浸渍3与5 d酒样的WC无显著差异(P>0.05)，各处理组之间WCP指数差异不显著，说明冷浸渍处理有利于葡萄酒中呈色物质的浸出，提高与酚类物质结合后的聚合色素含量。
表2 不同处理干红葡萄酒的色泽相关指标
Table 2 Relative indexes of color of dry red wine with different treatments
色泽指标 CK冷浸渍时间/d357L*80.87±0.75a79.28±0.13b78.89±0.29b76.96±0.11ca*20.27±0.33d22.38±0.07c23.26±0.29b25.90±0.23ab*6.24±0.13a5.93±0.09b4.96±0.09c4.77±0.16dCab21.10±0.43c22.99±0.24bc24.09±1.25b26.68±0.72aHab16.95±0.37a14.62±0.52b12.39±0.22c10.94±0.48dWC4.06±1.17c4.27±1.35b4.35±0.91b4.82±1.06aPPC1.64±0.55b1.72±0.41a1.75±0.46a1.77±0.39aWCP1.74±0.06d1.85±0.04c1.94±0.14a1.93±0.14b
2.4 不同冷浸渍时间干红葡萄酒指标的相关性分析
由表3可知，葡萄酒的a*与L*呈极显著负相关(P<0.01)，与Cab呈极显著正相关，而L*与Cab呈极显著负相关，即随着a*的升高，Cab增大而L*降低；Hab与总酸、a*和Cab呈显著负相关(P<0.05)，与L*和b*呈显著正相关；PPC和WCP与Hab呈显著负相关，相关系数分别为-0.970、-0.956；即PPC和WCP含量升高，Hab越低酒体颜色越接近红色[27]；总酸与PPC和总单宁呈极显著正相关，与WCP、总酚、总花色苷和类黄酮之间呈显著正相关；总酚与L*、Hab和pH呈显著负相关，与a*、Cab和PPC呈显著正相关，即总酚含量越高，干红葡萄酒色泽更饱满，聚合色素含量越高；总单宁与PPC呈极显著正相关，与WCP和总酚呈显著正相关；总花色苷和总酚呈极显著正相关，与a*、Cab、PPC和总单宁呈显著正相关，与L*和pH呈显著负相关；总类黄酮与a*、Cab、PPC、总酚、总单宁和总花色苷呈正相关，其中与总酚和总花色苷呈极显著正相关，与L*和Hab呈显著负相关，因而有利于酒体色泽品质的提升；总黄烷醇与PPC、总单宁呈显著正相关，相关系数分别为0.951、0.950。经相关性分析可知，上述葡萄酒各指标之间存在着一定的相关性，由于不同指标的信息之间存在一定程度的重叠，因此有必要通过主成分分析来提高综合评价的准确性。
表3 不同处理干红葡萄酒指标的相关系数
Table 3 Correlation coefficients of dry red wine indexes with different treatments
指标酒精度总糖总酸挥发酸干浸出物pH游离SO2总SO2L*a*b*CabHabWCPPCWCP总酚总单宁总花色苷总类黄酮总黄烷醇酒精度1.000 总糖0.9311.000 总酸0.8760.7201.000 挥发酸-0.929-0.783-0.7511.000 干浸出物0.3060.1420.722-0.1131.000 pH-0.659-0.440-0.9380.544-0.8931.000 游离SO2-0.641-0.358-0.570-0.860-0.1050.5011.000 总SO2-0.713-0.692-0.3210.8520.4170.0270.6851.000 L*-0.736-0.448-0.8900.773-0.6410.9030.8240.3451.000 a*0.7680.4870.895-0.8070.608-0.8890.841-0.395-0.998**1.000 b*-0.962*-0.797-0.9020.962*-0.3770.7470.8050.6840.880-0.9041.000 Cab0.7840.5060.890-0.8310.573-0.871-0.859-0.435-0.995**0.999**-0.9171.000 Hab-0.902-0.692-0.957*0.882-0.5670.8750.7810.5050.955*-0.967*0.973*-0.970*1.000 WC0.6790.3650.803-0.7810.531-0.820-0.898-0.398-0.985*0.984*-0.8510.985*-0.9151.000 PPC0.8570.6730.996**-0.7570.731-0.952*-0.619-0.316-0.9250.929-0.9070.923-0.970*0.8491.000 WCP0.9370.8160.988*-0.8120.619-0.874-0.577-0.438-0.8490.863-0.9350.863-0.956*0.7630.977*1.000 总酚0.8010.5730.973*-0.7420.747-0.966*-0.679-0.281-0.967*0.996*-0.8900.958*-0.970*0.9080.989*0.9381.000 总单宁0.8730.7121.000**-0.7520.725-0.941-0.578-0.320-0.8960.902-0.9030.896-0.960*0.8110.997**0.987*0.977*1.000 总花色苷0.7390.4920.952*-0.6860.788-0.979*-0.664-0.203-0.970*0.963*-0.8460.952*-0.9460.9130.974*0.9030.995**0.957*1.000 总类黄酮0.7780.5320.958*-0.7360.744-0.964*-0.703-0.272-0.978*0.976*-0.8810.968*-0.966*0.9270.979*0.9180.998**0.963*0.997**1.000 总黄烷醇0.6820.5120.949-0.5170.903-0.988*-0.401-0.009-0.8440.832-0.7310.813-0.8520.7400.951*0.8950.9440.950*0.9490.9331.000
注：*表示显著相关(P<0.05)；**表示极显著相关(P<0.01)。
2.5 主成分分析
将不同处理酒样所测指标进行主成分分析，以特征值λ>1为依据进行因子抽提，提取3个公因子，其中PC1、PC2和PC3的累积方差贡献率为100%，能够反映原数据的变异信息。由图2可知，PC1、PC2和PC3的贡献率分别为79.2%、13.3%和7.5%。其中PC1主要反映了总单宁、总酚、总酸、L*、a*、Cab、总类黄酮、总花色苷、总黄烷醇、PPC、WC、WCP和酒精度等指标的变异信息(载荷系数>0.8)，而Hab、b*和pH与PC1呈负相关； PC2主要体现了总SO2和干浸出物等指标的重要信息(载荷系数>0.9)；对PC3起主要贡献作用的指标有总糖、游离SO2等(正相关)。
a-PC1-PC2；b-PC1-PC3
图2 葡萄酒指标PCA的因子载荷图
Fig.2 PCA factor loading diagram of wine indicators
由图3可知，冷浸渍7 d酒样分布在第 Ⅰ 象限，冷浸渍3 d酒样分布在第 Ⅱ 象限，冷浸渍5 d和对照组酒样分布在第 Ⅲ 象限；其中冷浸渍7 d处理酒样PC1得分最高，这主要代表葡萄酒中一些重要的酚类物质和色泽相关指标信息，说明冷浸渍7 d酒样中酚类物质含量较高，葡萄酒色泽品质较好；冷浸渍3 d酒样PC2得分较高，PC1得分不高；冷浸渍5 d酒样位于PC3的正半轴，与PC2一样，主要反映一些理化指标的信息；对照组酒样在PC1上的得分最低，故而酒中酚类物质含量较低，色泽品质劣于冷浸渍处理组。
图3 不同处理酒样PCA的分布图
Fig.3 PCA distribution map of wine samples with different treatments
3 结论
本试验以梅鹿辄葡萄为原料，发酵前8 ℃下分别浸渍3、5和7 d。通过冷浸渍工艺对干红葡萄酒酚类物质含量及色泽特性研究发现：与传统工艺相比，冷浸渍处理酒样总酸含量增大，pH值降低，干浸出物含量有所增加，其他理化指标则无显著差异。冷浸渍工艺有助于提高干红葡萄酒酚类物质含量，其中总酚、总单宁、总花色苷、总类黄酮含量随浸渍时间延长呈增加趋势，浸渍7 d时达到最高；而对于酒体苦涩味影响较大的黄烷醇物质并不随浸渍时间的延长而增加，表明发酵前冷浸渍7 d处理不会增强酒体苦涩感。冷浸渍3、5和7 d均能在不同程度上提升酒体红色色调，增强颜色饱和度；主成分分析结果表明，酚类物质含量与酒体颜色参数密切相关，其中冷浸渍7 d 有利于花色苷的浸出与聚合，提升聚合色素含量，进而增强颜色稳定性，改善葡萄酒色泽品质。
综上，发酵前冷浸渍7 d处理工艺能更好地提升干红葡萄酒中酚类物质含量和改善酒体色泽，且不影响葡萄酒整体质量。在后续研究中，将进一步研究冷浸渍时间与浸渍温度的交互作用对干红葡萄酒品质的影响,以期为酿造高品质干红葡萄酒工艺的优化提供一定的理论依据和技术参考。
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