新疆光热资源丰富，昼夜温差大，有利于葡萄的生长。据 2018 年统计，新疆葡萄种植面积约 14.4万公顷，年产量约 270.6 万t[1]。葡萄种植过程中，病害时有发生，新疆葡萄病害主要有霜霉病、白粉病和炭疽病等[2]。为减少经济损失，常使用化学杀菌剂预防和治疗病害，由于管理缺乏规范，甚至出现过量使用和滥用的情况，导致葡萄杀菌剂残留，通过酿造过程转移到葡萄酒中，给葡萄酒质量安全带来隐患。
农药残留，一方面可能会对消费者造成损害，另一方面也会影响葡萄酒的酿造过程。葡萄酒加工过程大体可以分为3个阶段：酒精发酵(AF)，苹果酸-乳酸发酵(MLF)，陈酿。BRIZCID等[3]研究发现，在AF过程中一些杀菌剂会抑制或刺激酵母菌的活动，进而影响酒精发酵过程，甚至产生某些有害代谢产物或异味物质，对葡萄酒品质和感官质量造成影响；李记明等[4]发现一定浓度的农药会改变AF发酵过程，同时造成感官质量明显下降。RUEDIGER等[5]在研究农药对MLF的影响时发现，农药在一定程度上也会影响乳酸菌活性，改变MLF进程，影响葡萄酒品质。
CABRAS等[6]提出发酵过程中农药与酵母是相互作用的。一方面，农药影响发酵的活动；另一方面，发酵也能降低农药残留。农药会在葡萄酒酿造过中被皮渣、酒泥及澄清剂吸附，使得残留量降低，不同程度的降解，不同种类农药在固体相(酒泥和皮渣)与葡萄酒两相中的分布差异较大[7-8]。OLIVA等[9] 发现在下胶澄清过程中使用不同澄清剂可以有效去某些农药。综上所述，农药会对葡萄酒品质和感官质量造成影响，酿造过程中农药残留量也会降低，但不同农药对葡萄酒品质影响程度或变化规律有差异。
目前，国内外对葡萄或葡萄酒农药残留研究较多的主要是农药残留的检测手段和降解规律[10]。国内研究杀菌剂对葡萄酒品质的影响则较少。本文以“赤霞珠”葡萄为原料，研究生产中常使用的3种广谱杀菌剂(嘧菌酯、甲基硫菌灵、甲霜灵)对葡萄酒酿造过程、品质及感官质量的影响，同时检测酿造过程中3种农药含量的变化规律。目的是为酿酒葡萄杀菌剂的使用提供相应理论指导，为葡萄酒农药残留安全性标准的制定提供一定的数据支持。
1 材料与方法
1.1 葡萄品种
试验葡萄品种为有机“赤霞珠”，2018 年 9月 13 日在“国菲酒庄”采摘，选取生长周期相近(可溶性固形物(22±0.5)%)、无机械损伤和病虫害的葡萄，散去田间热后及时运回。
1.2 仪器与试剂
UV-1700紫外/可见分光光度计，上海美析仪器有限公司；UPHE-Ⅲ-90T超纯水机，四川优普超纯科技有限公司；R1001-VN旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；3H16RI智能高速冷冻离心机，湖南赫西仪器设备有限公司；FE22 pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；LE204E/02万分之一天平，特勒-托利多仪器有限公司；TQS micro液相色谱-质谱联用仪，美国Waters公司；Sun FIre TM C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，美国Waters公司。
甲基硫菌灵、甲霜灵、嘧菌酯、多菌灵标准品:阿尔塔科技有限公司；QuEChERS萃取盐包：上海岛津；甲醇、甲酸、乙腈(色谱纯):天津光复；酿酒酵母(Zymaflore F15)、乳酸菌:法国LAFFORT公司；其他未列出试剂均为分析纯。
1.3 处理方法
1.3.1 农药添加
参照GB 2763—2016[11]，将其允许最高农药残留量作为农药添加量，即甲基硫菌灵 5 mg/kg、甲霜灵2 mg/kg、嘧菌酯 2 mg/kg，以不添加农药为对照。
1.3.2 葡萄酒酿造工艺
葡萄原料除梗破碎、添加农药后装入 20 L玻璃罐，加入60 mg/L SO2，浸渍 12 h，添加活化后的酵母启动发酵，酒精发酵温度控制在 25～30 ℃，比重降至 1.015 时，分离皮渣，添加乳酸菌后继续发酵至比重 0.992～0.996，添加50 mg/L SO2，终止发酵，倒罐澄清，随后葡萄酒在 10 ℃下满罐密封贮藏。试验酒样设2次重复。
1.4 理化指标的测定
残糖、酒精度、pH、总酸的测定参照GB/T 15038—2006[12] 葡萄酒、果酒通用分析方法；总酚的测定参照CLIFF等[13]的方法；花色苷的测定采用pH示差法[14]；色度和色调、总单宁、盐酸指数、乙醇指数的测定参照彭传涛等[15]的方法。
1.5 感官评价
感官品尝小组成员由 15 名接受过专业感官培训的人员组成。评价小组分别从外观(颜色 10 分，澄清度 5分)、香气(浓度 10 分，质量10分，浓郁度 15 分)、口感(风味浓郁度 15 分，余味 15 分，平衡感 20 分)3个方面对葡萄酒进行比较品尝，总分为 100 分。使用 5分结构化数值尺度来量化，0～4表示感觉强烈程度逐渐增大。
1.6 农药含量测定
嘧菌酯含量测定参照吴延灿等[16]的方法，甲霜灵含量测定参照徐娟等[17]的方法，GB 2763—2016 规定甲基硫菌灵的残留定义为甲基硫菌灵和多菌灵的残留总和，以多菌灵计。甲基硫菌灵、多菌灵含量测定参照王昕璐等[18]的方法，4 种农药标准曲线方程、线性范围和相关系数见表1。4种农药的相关系数R2均>0.99，表明4种农药峰面积在线性范围内与相对应的质量浓度呈现出良好的线性关系。
表1 标准曲线方程
Table 1 Standard Curve Equations
农药 线性范围/(mg·L-1)回归方程R2嘧菌酯 0.01～200y=33 869.9x+3 930.740.998 6甲基硫菌灵0.01～100y=25 220.1x+2 986.470.999 0多菌灵 0.01～200y=26 383.4x+2 024.050.999 6甲霜灵 0.01～200y=19 716.7x+2 868.880.998 5
1.7 数据处理
使用Excel 2010 和SPSS 19.0 进行数据分析，利用Duncan多项式进行差异显著性分析，P<0.05 表示差异显著。使用Sigma Plot 14.0 绘图。
2 结果与分析
2.1 农药对葡萄酒AF进程的影响
如图1，随着葡萄酒发酵的进行，各处理组葡萄醪发酵温度整体上呈先上升后下降趋势，发酵前 24 h，温度上升速度较快。在整个发酵过程中，甲基硫菌灵和甲霜灵处理的葡萄醪温度变化过程与CK组相比较差异不显著，添加嘧菌酯的葡萄醪发酵温度整体上低于CK组(P<0.05)。随着AF发酵的进行，各组比重呈现下降趋势，甲基硫菌灵和甲霜灵比重下降速度与CK组差异不显著，发酵进行 48 h后，嘧菌酯处理后的葡萄醪比重均高于同期各处理组(P<0.05)，推迟了AF约24 h，延长了葡萄酒AF过程。
a-温度;b-比重
图1 农药对发酵醪的影响
Fig.1 Effects of pesticides on fermentation mash of wine
2.2 农药对葡萄酒品质的影响
残糖、总酸和酒精的含量与比例是影响葡萄酒品质的重要因素，葡萄酒颜色是葡萄酒重要的感官特征，单宁和花色苷等多酚是葡萄酒颜色主要的呈色和稳定物质[19]，同时单宁还能赋予葡萄酒涩味和厚重感[20]，盐酸指数和乙醇指数分别表示与多糖结合单宁比例和高聚合度单宁比例[21]。
由表2可看出，3种杀菌剂在不同程度上影响了葡萄酒的理化指标，不同杀菌剂对葡萄酒品质的影响不同。与CK相比，甲霜灵显著降低了葡萄酒的色调、单宁、花色苷含量和盐酸指数，同时显著提高了残糖含量(P<0.05)，其中对盐酸指数影响最大，盐酸指数降低了25.63%。甲基硫菌灵对葡萄酒的色度、色调、总酚、花色苷的影响达到了显著水平(P<0.05)，说明甲基硫菌灵对葡萄酒的颜色影响较大。嘧菌酯对葡萄酒品质影响最大，显著提高了葡萄酒残糖(34.62%)、总酸(22.26%)、降低了酒精度(8.46%)、色度(3.25%)、总酚(5.88%)、单宁(8.78%)、花色苷(4.90%)、盐酸指数(15.42%)和乙醇指数(0.52%)(P<0.05)。
表2 农药对葡萄酒品质的影响
Table 2 Effects of pesticides on wine quality
相关指标CK甲霜灵甲基硫菌灵嘧菌酯残糖/(g·L-1)3.90±0.13b4.10±0.14ab3.96±0.24ab5.25±0.11a总酸/(g·L-1)5.48±0.037b5.45±0.043b5.93±0.074b6.70±0.057a酒精度/(% Vol)13.00±0.02b12.8±0.03b12.90±0.01b11.90±0.03a色度I0.85±0.006 8b0.85±0.006 4ab0.86±0.003 2a0.80±0.002c色调N0.82±0.009 8a0.79±0.026 3b0.77±0.002 1b0.83±0.006 5a总酚/(g·L-1)1.54±0.01bc1.58±0.03ab1.60±0.04a1.52±0.01c单宁/(g·L-1)1.48±0.04a1.41±0.03bc1.45±0.02ab1.35±0.03c花色苷/(mg·L-1)201.28±1.22a183.30±0.61b195.64±1.06c191.41±1.06d盐酸指数19.98±2.00a14.86±0.48c19.48±0.74ab16.90±1.88bc乙醇指数92.09±0.46b92.79±0.02a92.06±0.16b91.61±0.12c
注：同行不同字母表示差异显著(P<0.05)。
2.3 农药对葡萄酒感官质量的影响
由图2可看出，不同杀菌剂对不同感官指标的影响存在差异，3种杀菌剂对葡萄酒澄清度和色泽的影响较小，但3种农药在不同程度上影响了葡萄酒的香气和风味，其中甲基硫菌灵显著降低了香气质量、浓度和纯正度(P<0.05)，嘧菌酯对葡萄酒理化指标影响较大，感官评价发现该农药显著降低了葡萄酒的平衡感和风味浓郁度(P<0.05)，而甲霜灵对葡萄酒感官品质影响较小。
图2 农药对葡萄酒感官质量的影响
Fig.2 Effects of pesticides on sensory quality of wine
2.4 农药在酿造过程中的消减
由表3可看出，在葡萄酿造过程中3种农药含量均显著降低，但3种农药降解率在不同相和不同阶段中不同。陈酿 3个月后，3种农药在液体相均有明显的降解(62.30%～82.98%)，平均为 73.79%，但降解程度会随着农药种类不同有所差异，说明3种农药在葡萄酒中最终残留量会显著低于葡萄。本次试验同时测定了葡萄酒酿造3个阶段(AF、MLF、陈酿)对农药的降解作用。结果表明，AF对农药降解作用最为明显(43.98%～64.54%)，平均为 52.44%，而MLF(平均 40.74%)和陈酿(平均 11.16%)对农药降解作用较弱，即AF>MLF>陈酿。对AF结束液体相(酒)和固体相(皮渣)进行比较，发现不同农药在两相中的分配系数差异很大，嘧菌酯固液分配系数为 1.79∶1，甲基硫菌灵为1.43∶1，甲霜灵固液分配系数为 1.41∶1，说明皮渣可以对嘧菌酯有很强的吸附作用，甲基硫菌灵次之，甲霜灵最弱，不同农药固液分配率不同。对MLF结束固液分配系数进行比较，发现嘧菌酯(4.51∶1)>甲基硫菌灵(2.11∶1)>甲霜灵(1.75∶1)，说明皮渣对嘧菌酯吸附作用最强。总体来看，皮渣或酒泥对不同农药吸附作用不同。
表3 农药在葡萄酒不同相中的分布
Table 3 Distribution of pesticides in different phases of wine
供检试样 嘧菌酯甲基硫菌灵甲霜灵含量/(mg·kg-1)阶段降解率/%累计降解率/%含量/(mg·kg-1)阶段降解率/%累计降解率/%含量/(mg·kg-1)阶段降解率/%累计降解率/%混合相葡萄4.85--4.94--1.91--液体相葡萄酒(AF结束)1.7264.5464.542.5348.7948.791.0743.9843.98葡萄酒(MLF结束)0.8351.7482.891.4841.5070.040.7628.9760.21葡萄酒(陈酿3个月)0.6818.0785.981.3310.1473.080.725.2662.30固体相皮渣3.0836.49-3.6326.52-1.5120.94-酒泥3.74--3.12--1.33--
注：降解率/%=(初始农药含量-目标农药含量)×100/初始农药含量。“-”表示未检出。
3 讨论
杀菌剂对葡萄酒酿过程造会产生一定的影响，农药可以通过影响酵母的繁殖或代谢过程来改变葡萄酒AF进程[22]。农药残留对葡萄酒酿造的影响会因农药种类、剂量和酵母种类而异。本研究发现嘧菌酯能延缓酒精发酵过程，造成残糖、总酸含量升高，酒精度含量下降(P<0.05)。这与李记明等[4]、MULERO等[23]的研究结果相似。嘧菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，可以抑制呼吸链中电子传递过程，进而抑制糖酵解作用，延长AF进程。同时，嘧菌酯显著降低了乙醇指数、盐酸指数以及葡萄酒的平衡感和风味浓郁度。甲基硫菌灵主要对葡萄酒香气质量和风味影响较大，这可能是由于其分子中的含硫基团和亚氨基在酿造过程中转化为异味物质的结果。甲霜灵对酿造过程和品质影响相对较小。本次试验发现3种农药均对葡萄酒感官品质造成了不良影响，这说明农药改变了酵母的代谢过程，并产生了某些不良的代谢产物，这与NOGUEROLPATO等[24]、GARCIA等[25]研究农药对感官品质和香气物质的影响结果相似。
葡萄酒发酵后其农药残留的种类和含量不同程度的减少或降低，其主要原因是皮渣和酒泥对农药的吸附作用[26]。本试验发现，3种农药经AF、MLF及陈酿后，其含量平均减少70%以上，说明经发酵后葡萄酒农药含量会显著低于葡萄，这与DOULIA等[27]研究结果一致。对比3个阶段农药降解率，发现AF阶段是农药降解或降低最快阶段，结合AF后农药在固液分配情况，发现皮渣吸附嘧菌酯附作用最强，多菌灵次之，甲霜灵最弱，这可能与其极性弱，水溶性差的特点有关。嘧菌酯(6 mg/L、20 ℃)溶解度远小于甲霜灵(8.4 g/L、20 ℃)。NAVARRO等[28]和DANAE等[27]也认为农药在葡萄破碎后的去除程度和农药的溶解度有很大关系，溶解度越低，极性越弱，去除程度越大，这与本试验结果一致。
农药残留和发酵过程相互影响，农药残留会影响发酵进程，发酵过程也会降低农药残留，二者相互作用效果会因农药种类、葡萄品种、酿造工艺等改变而变[29]。CUS等[8]认为带皮浸渍比去皮发酵更有利于农药去除，DOULIA等[30]研究不同澄清剂对农药吸附作用时发现，活性炭、蛋清等澄清剂可以去除农药残留，且农药水溶性越弱越容易去除。综上所述，在实际生产中选择水溶性弱农药，结合适当的发酵工艺，有助于农药残留的去除。
4 结论
3种农药在不同程度上改变了葡萄酒的发酵进程，降低了葡萄酒的品质和感官质量。发酵过程会显著降低农药含量，不同发酵阶段对农药的降解作用不同，AF>MLF>陈酿。固相(皮渣、酒泥)对溶解度越低、极性越弱的农药吸附作用较强，此类农药容易去除。
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