种自由基均有清除作用，其中对·OH自由基的清除活力最好，在50 g/L时清除率高达93.94%。该研究利用海参肠道菌发酵海参下脚料来获得具有抗氧化活性的多肽，提高了下脚料的利用率及其经济价值。摘 要以1株海参肠道产蛋白酶菌为研究对象，通过正交试验优化了该菌发酵产多肽的最佳工艺条件。对其进行形态学、生理生化特性、分子生物学16S rDNA序列同源性分析，确定该菌株隶属芽孢杆菌目，命名为Thalassobacillus sp.QDHF-1。利用QDHF-1发酵海参肠，以多肽含量为指标优化发酵条件，并对发酵产物多肽进行了抗氧化活性测定，确定对发酵海参肠产多肽的最佳工艺条件为接种量6%，料水比1∶5(g∶mL)，发酵时间36 h；海参肠发酵产物多肽对种自由基均有清除作用，其中对·OH自由基的清除活力最好，在50 g/L时清除率高达93.94%。该研究利用海参肠道菌发酵海参下脚料来获得具有抗氧化活性的多肽，提高了下脚料的利用率及其经济价值。
蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，它在消化吸收[1-2]、抗氧化[3-4]、降低过敏反应[5]、洗涤剂添加剂[6]、生物活性肽[7-9]等方面发挥着重要作用。目前，蛋白酶的种类主要分为动物蛋白酶[10-11]、植物蛋白酶[12]和微生物蛋白酶[13]。微生物菌群复杂多样，分布较广，繁殖速度较快，具有参与体内新陈代谢，调节内分泌，免疫调节等多种作用[14-15]。海洋微生物酶是一种获得新型酶制剂方式[16]，在工业过程和产品制作得到广泛应用[17-18]。王凤舞等[19]对来自裙带菜的1株产低温碱性蛋白酶内生菌株QD-1，经鉴定该菌株为芽孢杆菌属，该菌产生的蛋白酶的最适作用温度为20 ℃，最适作用pH 9.0，Mn2+对该酶有较强的激活作用，Zn2+，金属蛋白酶抑制剂(ethylenediaminetetra aceticacid，EDTA)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(phenylethanesulfonyl fluoried,PMSF)对该酶有抑制作。李倩倩等[20]以单环刺螠内脏为原料，分离出1种单环刺螠内脏蛋白酶LPN2，分子质量约59 ku，其最适温度为50 ℃，最适pH 6～8，PMSF、EDTA、Ca2+、Zn2+和Ba2+抑制蛋白酶LNP2的酶活，Fe2+在低浓度下对该酶有激活作用。BANERJEE等[21]从鱼肠中分离的细菌菌株棒状杆菌ATH3产生的胞外蛋白酶和淀粉酶，纯化的蛋白酶和淀粉酶的分子质量分别为17和28 kDa，酶的最适pH 7.5～8.0，最适温度35～45 ℃。目前，人们已经从海参体壁[22]、肠[23]和消化道[24]提取出蛋白酶粗酶，而对从海参肠中分离出蛋白酶菌株的研究较少。
本研究拟从海参肠道中分离筛选出1株产蛋白酶活性较高的菌株，对该菌株进行鉴定，以酶活力为指标，对其产酶发酵条件进行优化；利用该菌发酵海参肠产多肽，优化了发酵工艺条件，并对海参肠发酵产物多肽的抗氧化活性进行测定。
鲜活刺参(Apostichopus japonicas)：由青岛佳日隆海洋食品有限公司提供；海参肠(经水煮，去杂质，脱盐，初步脱脂后沥干而成)：由青岛佳日隆海洋食品有限公司提供，于-20 ℃保存；干红枣：福建古田县大丰工贸有限公司；苹果醋：鹤山市东古调味食品有限公司售；蜂蜜：山东华康蜂业有限公司售。
固体培养基：LB营养琼脂3.3 g，海水100 mL，121 ℃灭菌15 min。酪蛋白培养基：干酪素1 g，酵母膏0.1 g，琼脂1.5 g，海水100 mL，pH 7.2-7.4，121 ℃灭菌15 min。液体培养基：蛋白胨0.5 g，酵母膏0.1 g，磷酸高铁0.01 g，海水100 mL，pH 7.8～8.0，121 ℃灭菌15 min。
酪蛋白(casein)：上海索莱宝生物科技有限公司；偶氮酪蛋白(azocasein)：美国Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)：美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯。
DU-800型紫外分光光度计，美国贝克曼公司；TGL-16M型高速台式冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DHP-9032电热恒温培养箱，中国龙口市先科仪器有限公司；IS-RDV3立式恒温振荡器，美国精骐有限公司；SHA-B水浴恒温振荡器，常州国华电器有限公司。
1.3.1 菌株的分离与鉴定
(1)菌株的分离纯化
取活体刺身内脏，剪碎，按100 g/L加入无菌海水制成菌液原液，梯度稀释后分别涂布于固体培养基， 25 ℃，静置培养3 d。挑取单菌落点接种于酪蛋白培养基，25 ℃，培养24 h，观察透明圈大小。选取菌落周围有透明圈的菌株进行分离纯化。挑取适量的菌株，接种于液体培养基上，25 ℃，180 r/min，3 d，选择产蛋白酶活性较高的菌株为目的菌株。挑取少量菌株接种于固体培养基上，置于25 ℃静置培养3 d，观察目标菌株的菌落形态，并进行革兰氏染色，观察菌株的个体形态，芽孢等。
(2)蛋白酶活性的测定
蛋白酶活性的测定采用参照RANILSON的偶氮酪蛋白法[25]。
(3)形态学及生理生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》进行形态学及生理生化鉴定。
(4)16S rDNA序列分析
采用CTAB[26]法提取基因组DNA，PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。序列提交GeneBank数据库，用Blast软件在GeneBank网站上进行相似性搜索，获取相近典型菌株的16S rDNA基因序列，通过Clustal进行多重序列比对，利用MEGA 5.0软件绘制出系统发育树。
1.3.2 QDHF-1菌株产酶发酵条件工艺优化
参照朱玫瑛[27]的前期单因素试验研究结果，采用L9(33)正交试验，以pH值、温度、发酵时间3个因素为影响因素，以蛋白酶活力为指标，对产酶发酵工艺进行正交优化，因素水平见表1。
1.3.3 QDHF-1菌株发酵海参肠工艺优化及抗氧化活性测定
(1)BSA标准曲线的绘制
将BSA标准品(5 g/L)用生理盐水配置成质量浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的溶液，置于离心管中。将BCA试剂盒中的A试剂和B试剂按照50∶1的体积比充分混匀，得到BCA工作液。用移液枪从各浓度的BSA管中吸取20 μL溶液，并与200 μL的BCA工作液充分混匀，置于37 ℃水浴中振摇1 h，用蒸馏水做空白。在562 nm下测定吸光值，绘制BSA标准曲线。
表1 L9(33)正交试验因素及水平
Table 1 Factors and levels in L9(33) orthogonalexperiment design
水平因素pH值温度/℃时间/h172548283060393572
(2)多肽含量的测定
采用BCA法[28]测定样品中的多肽含量。向试管中加入已稀释好的相应倍数的样品溶液20 μL，同时加入已经配好的BCA溶液200 μL，迅速混匀，于水浴37 ℃放置60 min。波长562 nm下测定吸光度值，试验重复3次，根据标准曲线计算样品中多肽的百分含量。
(3)QDHF-1种子液的制备
将Thalassobacillus sp. QDHF-1菌株接种到液体培养基上，30 ℃，180 r/min，培养24 h，制备液体种子液培养基。
(4)接种量对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响
取洗净沥干的海参肠用组织捣碎机捣碎，称取5 g，料水比为1∶10，接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%，发酵时间为60 h，温度30 ℃，转速180 r/min，培养结束后离心，分别测定上清液的多肽含量。
(5)发酵时间对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响
取洗净沥干的海参肠用组织捣碎机捣碎，称取5 g，料水比(g ∶mL)为1∶10，接种量为6%，发酵时间分别为12、24、36、48、60 h，温度30 ℃，转速为180 r/min，培养结束后离心，分别测定上清液的多肽含量。
(6)料水比对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响
取洗净沥干的海参肠用组织捣碎机捣碎，称取5 g，料水比(g∶mL)分别为1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，接种量为6%，发酵时间为36 h，温度30 ℃，转速180 r/min，培养结束后离心，分别测定上清液的多肽含量。
1.3.4 海参肠发酵物抗氧化活性测定
利用QDHF-1菌株发酵海参肠的的最佳工艺条件为接种量6%，料水比1:5，发酵时间36 h，可得到多肽质量浓度达13.21 g/L。海参肠发酵液经离心去除菌体及杂质，再经浓缩、冷冻干燥，获得海参肠发酵物多肽，并对其进行抗氧化测定。
(1)羟自由基(·OH)清除能力的测定采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[29]。
(2)二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的测定采用ALI等的测定方法[30]。
(3)超氧阴离子自由基(O2-·)清除能力的测定采用邻苯三酚自氧化法[31]。
1.3.5 统计分析方法
试验数据以平均值±标准差(M±S.D.)表示，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。分析方法为单因素方差分析和邓肯(Duncan)多重比较，显著性水平选择0.05。
海参肠道产蛋白酶菌株的初筛结果如图1和表2所示。经分离得到的5株菌株，菌落直径差异不显著(P>0.05)，但QDHF-1菌株所产的透明圈直径与菌落直径比值显著高于其他菌株(P<0.05)。酪蛋白培养基上水解透明圈直径与菌落直径的比值(D/d值)越大说明产酶能力越强，所以QDHF-1菌株具有较高产蛋白酶的能力。不同菌株发酵液产蛋白酶活力的测定结果如图2所示。其中QDHF-1菌株产的蛋白酶活性较高，产蛋白酶活力为582 U/mL，显著高于其他菌株(P<0.05)。综合水解透明圈和酶活力两个因素，选择QDHF-1菌株为出发菌株。
图1 QDHF-1菌株透明圈实验结果
Fig.1 Results of transparent circle test of QDHF-1 strain
表2 海参肠道产蛋白酶菌株初筛结果
Table 2 Screening results of protease-producingstrains from tract of sea cucumber
菌落编号透明圈直径(D)/mm菌落直径(d)/mmD/d值QDHF-120.30±0.57d6.66±0.29ab3.2±0.17bQDHF-213.16±0.31c6.83±0.23ab1.91±0.20aQDHF-312.96±0.45c7.25±0.53ab1.78±0.24aQDHF-412.05±0.33b7.33±0.65b1.64±0.11aQDHF-510.12±0.20a6.42±0.35a1.57±0.34a
注：同一列不同字母上标代表数值间差异显著(P<0.05)。下同。
图2 不同菌株发酵液产蛋白酶活力的测定
Fig.2 Determination of protease activity in fermentation broth of different strains
注：图中不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。下同。
如表3所示，3个单因素中，对QDHF-1产酶发酵的影响顺序为时间>pH值>温度，因此最佳产酶发酵条件为pH 8，温度为30 ℃，发酵时间72 h。
表3 正交试验结果表
Table 3 Results of the orthogonal experiment
试验号pH值温度/℃时间/h酶活力/(U·mL-1)11(7)1(25)1(48)515212(30)2(60)582313(35)3(72)58642(8)126555223756623153573(9)1360583215409332577K1561592530K2649627605K3574566649极差R8860119
2.3.1 形态特征及生理生化鉴定
QDHF-1的菌落形态是乳白色、圆形、凸起、边缘整齐、湿润的光滑小菌落。对QDHF-1菌株进行革兰氏染色和芽孢染色，结果如图3所示，QDHF-1为革兰氏阳性、产芽孢的两端钝圆的杆状细菌。对QDHF-1菌株进行部分生理生化鉴定试验，结果如表4所示。查阅《伯杰细菌鉴定手册》和《细菌系统鉴定手册》，并未发现有对应生理特征的种属分类。因此，对QDHF-1菌株采用16S rRNA基因序列分析进行鉴定。
图3 菌株QDHF-1的革兰氏染色观察
Fig.3 The image of QDHF-1 after gram stain
表4 生理生化鉴定
Table 4 Physiological and biochemical experiments
试验名称试验结果试验名称试验结果酪素水解试验+硝酸盐还原试验+吲哚试验-葡萄糖利用试验+甲基红试验+果糖利用试验+V.P. 试验-甘露醇利用试验+硫化氢试验+5%(质量分数)NaCl+明胶液化试验-7%(质量分数)NaCl+淀粉水解试验+10%(质量分数)NaCl+接触酶试验-
注：表中“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。
2.3.2 16S rDNA全序列分析
2.3.2.1 PCR扩增结果
经PCR扩增获得菌株16S rRNA基因片段的长度为1 500 bp左右，如图4所示，条带清晰，可用于菌株16S rRNA序列的测定。
图4 16S rRNA基因PCR扩增产物
Fig.4 PCR amplification product of 16S rRNA gene
2.3.2.2 系统发育树分析
登陆www.NCBI.com网站，在GeneBank中通过Blast得到与QDHF-1菌株序列相似度较大的菌株，通过Clustul软件同GeneBank中的相似序列进行比对，可知QDHF-1与Thalassobacillus sp. LY18同源性为99.3%。利用MEGA 5.0软件绘制出系统发育树，可以确定QDHF-1为Thalassobacillus属。将QDHF-1序列提交GeneBank获得登录号为KF357910(图5)。QDHF-1菌株属于Bacteria(细菌)，Firmicutes(厚壁菌门)，Bacilli(杆菌)，Bacillales(芽孢杆菌目)，Bacillaceae(芽孢杆菌科)，Thalassobacillus属，命名为Thalassobacillus sp.QDHF-1。
图5 QDHF-1菌株16S rRNA同源性构建的系统发育树
Fig.5 Phylogenetic tree of strain QDHF-1 on 16S rRNA gene sequence
2.4.1 接种量对发酵产多肽含量的影响
接种量对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响结果如图6所示。随着接种量不断增加，发酵液中多肽含量呈先上升后下降的趋势。当接种量在2%～8%时，发酵液中多肽含量呈上升趋势，当接种量为6%和8%时，发酵液的多肽含量没有显著性差异(P<0.05)。因此选择接种量为6%较为合适，此时发酵液中多肽质量浓度为5.02 g/L。当接种量为10%时，多肽含量开始下降，可能是由于菌体数量过多，开始分解发酵液中的多肽所致。
图6 接种量对发酵液产多肽含量的影响
Fig.6 Effect of inoculum size on the content of polypeptide in fermentation
2.4.2 发酵时间对发酵产多肽含量的影响
发酵时间对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响结果如图7所示。随着发酵时间的增加，发酵液中多肽含量呈先上升后下降的趋势。当发酵时间为36 h，多肽含量达到最大值为7.66 g/L，显著高于其他组(P<0.05)。随着发酵时间的延长，发酵液中多肽含量开始逐渐下降，可能是菌体开始消耗多肽所致。因此选择发酵时间为36 h较为合适。
图7 发酵时间对发酵液产多肽含量的影响
Fig.7 Effect of fermentation time on polypeptide content in fermentation
2.4.3 料水比对发酵产多肽含量的影响
料水比对QDHF-1发酵海参肠发酵液中多肽含量的影响结果如图8所示。随着料水比的不断增加，肽含量呈先增加后下降的趋势。当料水比为1∶5(g∶mL)时，多肽质量浓度为13.21 g/L，显著高于其他组(P<0.05)。随着料水比的继续增加，肽含量不断减小，原因可能是料水比的增加造成了肽含量的稀释。因此选择料水比为1∶5(g∶mL)较为合适。
图8 料水比对发酵液产多肽含量的影响
Fig.8 Effect of solid-liquid ratio on polypeptide content in fermentation
2.5.1 不同浓度海参肠发酵物多肽对羟自由基(·OH)的清除能力
不同浓度的海参肠发酵物多肽对羟自由基的清除作用结果，如图9所示。随着海参肠发酵物多肽质量浓度的增大，对羟自由基的清除率逐渐增大，质量浓度为50 g/L时，清除率为93.94%。因此，海参肠发酵物多肽对羟自由基具有良好的清除能力。
图9 海参肠发酵物多肽对·OH的清除作用
Fig.9 ·OH scavenging effects of fermentation product polypeptide of sea cucumber
2.5.2 不同浓度海参肠发酵物多肽对二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)的清除能力
不同浓度的海参肠发酵物多肽对DPPH·的清除作用结果，如图10所示。随海参肠发酵物多肽质量浓度的增大，DPPH·自由基清除率呈不断增大的趋势。当海参肠发酵物多肽质量浓度为50 g/L时，清除率为32.38%。随着浓度继续增加，对DPPH·自由基清除率维持在一定水平。
图10 海参肠发酵物多肽对DPPH·的清除作用
Fig.10 DPPH· scavenging effects of fermentation product polypeptide of sea cucumber
2.5.3 不同浓度海参肠发酵物多肽对超氧阴离子自由基
的清除能力
不同浓度的海参肠发酵物多肽对
的清除作用结果，如图11所示。随海参肠发酵物多肽质量浓度的增大，的清除率逐渐增大。海参肠发酵物多肽质量浓度为90 g/L时，清除率为14.47%，与质量浓度为80 g/L时的清除率没有显著性差异(P>0.05)。
图11 海参肠发酵物多肽对
的清除作用
scavenging effects of fermentation
product polypeptide of sea cucumber
本研究中，海参肠发酵物对不同自由基的清除效果依次为：
由此可以说明，经由发酵产生的多肽对·OH具有较高的清除活性，这些多肽中富含多种游离的还原性基团，如巯基、羟基、氨基等，因此可有效保护细胞中极易受·OH攻击的核酸和细胞膜。然而，多肽对DPPH·和
具有较低的清除活性，可能的原因是：一方面，具有清除自由基功能的多肽浓度太低，而总多肽浓度较高；另一方面，这些自由基与多肽作用后产生新的自由基，而这些新的自由基具有较高的活性。
本实验通过初筛和复筛从海参肠道中分离筛选获得1株产蛋白酶的菌株QDHF-1，确定菌株QDHF-1是芽孢杆菌目，命名为Thalassobacillus sp.QDHF-1，其最佳产酶发酵条件为pH 8，温度30 ℃，发酵时间72 h。将菌株Thalassobacillus sp.QDHF-1应用于发酵海参肠，其最佳工艺条件为接种量6%，料水比1∶5(g∶mL)，发酵时间36 h；海参肠发酵物多肽具有良好的抗氧化活性，其中对羟自由基的具有较强的清除能力，当海参多肽质量浓度为50 g/L时，对羟自由基清除率可达93.94%。本研究为开发具有抗氧化活性的海参肠解多肽产品提供实验依据。
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Abstract A protease-producing bacterium from sea cucumber intestinal tract was isolated and identified. Through morphological, physiological, biochemical characterization and 16S rDNA sequence homology analysis, the isolated strain was identified as Thalassobacillus sp. QDHF-1. Sea cucumber intestine waste was fermented by strain QDHF-1, and the fermentation conditions were optimized and the antioxidant activities of produced peptides were determined. The optimal fermentation condition to produce peptides was 6% inoculum, 20% raw materials and 36 h fermentation. The polypeptides could scavenge ·OH, DPPH·, and 
and the highest scavenging rate of 93.94% was obtained on ·OH using 50 g/L polypeptides. The results indicate the potential applications of strain QDHF-1 in sea cucumber offal fermentation to produce bioactive peptides.