基于无机元素结合偏最小二乘判别与聚类分析的柚品种比较

柚(Citrus grandis L. Osbeck)俗称抛子、团圆果、文旦等，属芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)植物，素有“天然水果罐头”之称。柚原产中国，其栽培历史悠久，变异类型及品种甚多，我国柚类品种、品系、类型和株系多达200个以上[1]。柚果肉富含矿物质与微量元素[2-3],关于柚子中元素含量的研究未见详细报道。食品中必需宏量元素和微量元素的含量对其营养价值及其活性机理有重要影响，甚至发挥着关键作用；果蔬中元素摄入与机体的健康、生长发育和疾病预防有着密切关系，对体内多种活性酶和免疫过程也有直接或间接作用[4-6]。

目前，无机元素指纹分析已广泛应用于果蔬、农产品及其他食品原料的品质评价及其质量控制[7-12]，而化学计量学方法为无机元素指纹数据解析发挥了不可替代的作用[13]，因为化学计量学方法能够发现食品原料与化学成分之间的内在联系[14]。无机元素测定结合化学计量学方法已经逐渐用于红枣、辣椒、柠檬、番茄的品质评价与产地溯源[15-17]。偏最小二乘判别分析(partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA)和聚类分析(clustering analysis，CA)作为经典的化学计量学中“无监督分类”方法，常用于食品及其原料的品质评价、产地识别、掺假鉴别[15, 18]。本实验采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES)测定不同品种柚果肉中Al、B、Ba、Ca、Co、Cu、Na、K、Fe、Mg、Mn、Zn、Ni、Se、Cr、V、Sr 17种无机元素的含量，建立柚五类品种果肉中无机元素的PLS-DA和CA模型，为我国柚品种特性比较、品种划分及其综合利用提供了基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为完全成熟的柚水果(柚子种质资源共67份)：沙田柚(n=13)、玉环柚(n=14)、脆香甜柚(n=13)、琯溪蜜柚(n=12)、梁平柚(n=15)，具体见表1(每种柚取样3次，分别测定3次)；各品种均由重庆市中药研究院专家鉴定。Al、B、Ba、Ca、Co、Cd、Cu、Na、K、Fe、Mg、Mn、Zn、Ni、As、Pb、Se、Hg、Cr、V和Sr标准储备液(100 mg/L) 国家有色金属及电子材料分析测试中心；HNO3、高氯酸均为优级纯；所用溶液均利用去离子水自行配制；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

Optima 7000DV型全谱直读电感耦合等离子体原子发射光谱仪，美国Perkin Elmer公司；DFY-500D高速粉碎，机上海新诺仪器设备有限公司；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柚采摘方法及其果肉预处理方法

分别选树龄一致、生长正常、结果量基本相同的柚树3株，于成熟期挑选外观颜色和果实大小相当、果面无明显机械伤的正常果；样品用纯净水冲洗干净，剥皮，去籽，取其中鲜果肉阴干后，于50 ℃干燥箱中烘干至恒重，粉碎后过60目筛。

所用玻璃器皿均用1%HNO3浸泡12 h，再用去离子水冲洗2～3遍，烘干备用。将干燥柚果肉粉末(5.00 g)置于洁净的250 mL玻璃圆底烧瓶，加入一定量的HNO3-HClO4(体积比4∶1)加热消化完全(注意及时补加混酸，当溶液变为清亮无色并伴有白烟时，继续加热至近干，向圆底烧瓶中加入少量超纯水继续加热以赶尽多余的高氯酸，蒸发至近干)，冷却至室温，加HNO310 mL及适量水并定容于50 mL容量瓶中成为待测液。

1.3.3 柚果肉中无机元素测定方法及条件

采用ICP-AES技术测定，具体参考姚鑫等方法[19]。仪器参数：射频功率1 350 W；检测器CID的高波段(>265 nm)积分时间5 s，低波段(<265 nm)积分时间15 s；进样雾化器氩气压力28 psi；进样蠕动泵转速：100 r/min；辅助气流量1.0 L/min，载气流速1.12 L/min；测定波长范围：188.979～396.153 nm。标液质量浓度分别为10、20、40、80、100 μg/L，测定并计算各柚果肉样品中无机元素含量。

1.3.4 化学计量学分析方法

显著性分析采用SAS 8.2(SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)的LSD(least significant difference)方法，P<0.05表示差异显著。采用SIMCA-P(SIMCA-P 13.0；Umetrics，Umea，Sweden)对已标准化处理的无机元素矩阵数据进行分析，建立其PLS-DA和CA模型，并计算其特征值和贡献率。

2 结果与分析

2.1 柚果肉中17种主要无机元素含量测定及其分布分析

目前ICP-AES方法广泛应用于食品及其原料中多种无机元素测定，已经成为元素分析和测定的主流方法[20]。采用ICP-AES测定了柚果肉中21种主要的无机元素含量，结果见表2，其中所有样品中Cd、Pb、As、Hg均未检出；柚果肉中富含有益元素Ca、K、Fe、Mg、Mn，其平均含量分别达到341.54、844.45、11.54、197.85、6.76 μg/g。同时研究发现不同品种柚果肉常量元素和微量元素差异较大，但均为低Na和高K水果。重金属均符合GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》中“水果及其制品”的限量要求。柚果肉无机元素差异主要与品种、产地土壤环境、测定方法等因素相关，柚果肉的重金属元素含量较低，说明所采集各产区柚基本无重金属污染，并且其植物果肉重金属富集和迁移率较低，对于我国整体柚资源的重金属情况，具有一定的参考价值。

2.2 PLS-DA模型分析柚果肉中17种主要的无机元素

2.2.1 PLS-DA模型主因子(F)提取过程分析

PLS-DA是一种基于偏最小二乘回归算法的线性分类方法，该模型适用于多自变量并且线性强情况的分析和预测，该技术已成为化学计量建模中的一种成熟工具，因为它通常可以从内部本质角度来解释所提取的主因子[21]。对柚果肉无机元素采用PLS-DA分析，所提取的4因子模型的特征值(Ev)分别为500.284、102.306、26.087、5.937，对应的方差贡献率分别为：78.833%、16.121%、4.111%和0.936%；其中前3个主因子(即F1、F2和F3)的累计方差贡献率达到99.065%，远远大于85%，说明该PLS-DA模型能够完整和准确反映不同品种柚果肉中无机元素的分布情况。F2与B、V的变化相关，F3与Mg、Mn的相关性非常强，而其余的无机元素均与F1相关性较高。因此我们将PLS-DA模型的前3个主因子作为评价不同品种柚子中17种主要无机元素及柚品质的代表性变量。

2.2.2 基于PLS-DA模型的柚不同品种的分类分析

分别以PLS-DA模型的主因子F1为X轴、F2为Y轴(或以F1为X轴、F3为Y轴)，将67份柚样品分别标入二维坐标系中，即得到主因子得分的二维图，具体见图1。由图1-a和图1-b可知，该模型明确将67份柚样品分为五类，说明该PLS-DA模型可以作为不同品种柚分类的识别方法。由图1-a可知，脆香甜柚和沙田柚分别位于PLS-DA模型分类图的上方和下方，梁平柚和琯溪蜜柚分别位于PLS-DA模型分类图左侧和右侧，而玉环柚分布略微居中。此外，脆香甜柚和沙田柚样品分布更加聚集，说明其个体差异较小；玉环柚、琯溪蜜柚和梁平柚分布略微分散，说明其个体差异和栽培环境等因素影响较大。因此，PLS-DA模型结合无机元素分布可应用于不同品种柚的分类分析。

注：Max、Min、Mean和S.D.分别表示最大值、最小值、平均值和相对标准偏差；不同小写字母(a～j)表示各无机元素最大值、最小值之间具有显著性差异(P<0.05)；“-”表示无。每个指标重复测定3次。

图2为PLS-DA模型分析的17个主要无机元素载荷图，图2中柚果肉的17个无机元素向量长短代表其能解释原始矩阵变量的程度，无机元素向量方向表示其与主因子F1和 F2(或F1和F3)的相关性；图2中2个不同柚果肉无机元素向量夹角<90°代表它们之间有正相关，如Fe与Mn之间；当2个无机元素向量之间相互垂直时，则它们属性之间相关性很弱，说明互不影响[22]；不同柚果肉的无机元素向量方向相反代表其存在负相关，如Co与Cr之间。郭爱民等[23]采用系统聚类法对柚14个品种果实综合性状数量指标进行分析，结果发现柚类果实品质数量性状指标聚类分析在品质分析中更具客观性和准确性；李先信等[24]研究发现柚类特有的果实性状和花器官性状可作为划分柚类种质资源的依据；刘勇等[25]采用主成分分析从柚类33个品种65个形态学性状中筛选出了影响柚品种的核心性状，并揭示了柚类品种重要特征；

等[26]采用聚类分析、主成分分析、线性判别分析等多元数据分析方法结合HPLC-Ms建立了柚子不同品种的鉴别技术；YAN等[27]采用线性判别分析(LDA)和主成分分析评价了不同产地柚无机元素(Ca、Mg、Zn、Cu、Fe、Mn、K和Na)差异，LDA法具有较好的分类评价效果。目前，生产商、贸易商和消费者对水果及果汁产品的原产地和可追溯性非常感兴趣，水果品种的优劣和原产地真实性的确定是水果原料质量控制和安全评价的重要环节，对于上游的品种选育与改良、栽培和下游的食品加工及其综合利用都具有重要的意义[28]，在这方面多元素指纹图谱结合化学计量学方法体现了明显的优势。我们的试验结果将有利于今后更好地利用无机元素指标评定柚类品种，根据分类结果更好地利用这些无机元素矩阵数据及其模型。

2.3 柚子无机元素含量相关性及其聚类分析

采用SAS 8.2软件对柚子果肉中17种主要的无机元素进行相关性分析，相关性用皮尔逊(Pearson)相关系数表示，聚类分析按相近或相似程度分组，相似性的度量是基于欧氏距离平方，最小的距离表示其关系程度最高，因此，这些对象被认为属于同一组[29]。相关性和聚类结果如图3所示。显著性分析发现，柚果肉中有2对元素(Fe与Ba、Fe与Mn)间呈现极显著正相关(P<0.01)，42对元素间呈显著正相关(P<0.05)，虽然不同元素的吸收与富集机理不尽相同，但各元素间可能存在相互协同或促进吸收的关系；并且柚在富集以上元素时表现出较强的协同作用，可能与柚子植物吸收代谢、土壤元素状态等因素相关；已知植物的微量元素含量受植物品种、土壤条件、气候、肥料的使用和收获时植物的成熟状态等因素的影响[30]。柚果肉中有1对元素(Al与Ba)之间呈现极显著负相关(P<0.01)，25对元素间呈显著负相关(P<0.05)，表现出元素间可能具有相互拮抗吸收的关系；其余各元素之间多存在正相关趋势，但均未达到显著性水平。聚类分析发现，17个无机元素基本聚为四大类：Na、Co、Se、Mg、Cu和Zn聚为第一类(其中Na、Co、Se与Mg、Cu、Zn分别来于2个小类)，Cr和B聚于第二类，V、Ni和Al聚为第三类，Sr、K、Ca、Mn、Ba和Fe聚为第四类(Sr、K、Ca与Mn、Ba、Fe分别来于两个小类)，在一定程度上说明了各个元素在果肉中积累过程中的内在联系。陈巍等[31]研究发现柚叶片与果实之间矿质元素协同吸收作用较弱，而柚子果实与果皮之间作用较强。一般根据特征成分、生物学特征等分析变量与种质之间的相互关系，为柚类种质资料调查、品种分类系统的建立、品种溯源与划分、产品的合理开发利用提供科学依据[32]。无机元素在这方面体现了其自身优势，表明不同品种的柚子果肉其无机元素产量存在较大差异，这种差异还能够进一步作为不同品种柚子划分的参考依据，进一步揭示了通过测定无机元素，对柚子的种质资源调查、品种划分具有参考价值。该聚类分析在一定程度上解释了柚果肉中无机元素的分布特征和积累的内在联系。该方法为无机元素含量与化学计量学技术相结合作为评价柚子品质和品种鉴定提供了有价值的基础。我们后续将分析柚不同部位(如果皮、柚果实囊衣、种子等)的无机元素组成及其迁移规律，建立指纹图谱，为柚的品种选育、引种栽培、良种繁育、污染防控、柚副产物(花、叶、柚皮等)综合利用提供依据。

3 结论

(1)柚果肉样品中Cd、Pb、As和Hg均未检出，柚果肉中Ca、K、Fe、Mg和Mn等有益元素含量较高，其平均含量分别达到341.54、844.45、11.54、197.85、6.76 μg/g；同时研究发现不同品种柚果肉其常量元素和微量元素差异较大，但均为低Na和高K水果。

(2)采用化学计量学方法结合ICP-AES测定柚果肉无机元素组成，可区分和评价沙田柚、玉环柚、脆香甜柚、琯溪蜜柚、梁平柚，能够揭示各品种柚无机元素之间的差异、污染状态及其综合品质。

(3)通过PLS-DA模型分析不同品种柚的无机元素分布差异，PLS-DA模型提取的前3个主因子所代表的信息可以明显区分各品种的柚果肉，相关性和聚类分析揭示了柚的无机元素之间的协同或拮抗吸收内在的机制，为柚的品种选育、综合利用提供理论依据。

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