不同冰藏处理对鲈鱼品质、ATP关联物及微生物变化的影响

鲈鱼(Lateolabrax japonicus)又名花鲈、四肋鱼等，广泛分布于中国沿海区域，是我国重要的海水经济鱼类之一，其味道鲜美，鱼肉中富含蛋白质、维生素与必需氨基酸等营养成分，深受消费者青睐[1]。然而由于鲈鱼肌肉组织脆弱，水分与蛋白质含量丰富，其在贮运过程中易受微生物与内源活性酶的影响，发生腐败变质，导致其营养价值降低[2]。冰鲜法是目前应用普遍的贮藏技术之一，其操作简单，使用方便。但传统碎冰处理通常存在密封不充分，抑菌效果差等不足，致使保鲜效果不佳，因此优化冰鲜处理技术对延长水产品货架期具有重要意义。

流化冰作为一种新型的制冷介质逐渐受到科研人员的广泛关注，其具有冰粒细小光滑，流动性好，潜热值高及预冷速度快等优点，在贮藏保鲜中流化冰可将鱼体完全浸没，达到隔绝氧气的效果，同时还可降低鱼体表面的机械损伤，延缓由氧化导致样品腐败[3]。酸性电解水冰是一种新型高效的冷杀菌保鲜技术，其不仅结合了传统冰低温贮藏的作用，还具有杀菌能力强、应用范围广且安全方便的特点[4]。近年来，已有学者研究了流化冰冰藏过程中鲈鱼鲜度指标和蛋白生化指标变化[5]，分析了酸性电解水冰处理对水产品新鲜度与色差值变化的影响[6-7]。其中，KILINC等[8]利用流化冰、碎冰对鲈鱼进行预处理，结果表明流化冷却除对感官变化的影响较小外，可延缓鲈鱼嗜温菌生长，抑制TVB-N值上升，货架期相对碎冰预冷组延长2 d。CAKLI等[9]研究发现，与碎冰处理相比，流化冰处理抑制了鲈鱼嗜温菌生长，但在外观品质和TVB-N值控制上无明显优势。

前期研究主要涉及鲈鱼品质和理化指标等方面，而从ATP关联产物、微生物变化规律及相关性角度分析鲈鱼在流化冰、酸性电解水冰贮藏过程中的品质变化研究较少。因此，本文以碎冰为对照，分别采用流化冰和酸性电解水冰处理新鲜鲈鱼，通过品质(质构分析与TVB-N值)、ATP关联物(K、H和Fr值)、微生物(细菌总数、假单胞菌数与希瓦氏菌数)等指标，综合表征不同冰藏处理对鲈鱼鲜度变化影响，以期为水产品的冰藏保鲜提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 冰的制备

流化冰(slurry ice，SI)：利用RE-1000W-SP流化冰机制取流化冰，所得冰浆由80%冰与20%水组成(质量分数)，含盐质量分数为3.3%，流化冰体系温度在(-1.8±1.0) ℃。根据前期实验探究结果，由于渗透压作用，贮藏过程中流化冰浆中的NaCl会使鱼肉盐度值升高，但其贮藏终点的盐度值远低于低盐腌制水产品要求[10]。

酸性电解水冰(acid electrolyzed water ice，AEWI)：使用质量浓度为1 g/L的NaCl溶液电解5 min后取酸性电解水，将其立即密封置于-20 ℃低温箱中冷冻24 h成冰，制成的酸性电解水冰有效氯含量(available chlorine concentration, ACC)、pH值、氧化还原电位(oxidative redox potential, ORP)分别为(25±1) mg/kg, 3.64±0.03, (1 124±0.8) mV。碎冰(CK)：由碎冰制冰机制备，体系温度为0 ℃左右。

1.2 原料处理

鲜活鲈鱼：生长在沿海海水养殖池中，捕捞期一般在春、秋两季，均重为(500±20) g，体长(27.5±1.2) cm，购自上海市浦东新区水产品批发市场，置于盛有水的聚乙烯泡沫箱中，30 min内运往实验室立即进行处理。鲈鱼用冰水洗净后随机分为3组，分别置于盛有流化冰、酸性电解水冰和碎冰的泡沫箱中，层冰层鱼放置，样品处理好后置于4 ℃冰箱保存，隔天换冰。分别在0、3、6、9、12、15、18、21、23 d取样，鲈鱼去头去尾，去内脏，固定取背部鱼肉进行各项指标测定。

1.3 主要药品试剂

ATP关联物标准品,均由Sigma公司生产；NaOH、MgCl2、Na2HPO4、NaH2PO4、平板计数琼脂(PCA)、假单胞选择性培养基(CFC)、含铁琼脂(IA)、甘油(丙三醇)等，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.4 仪器与设备

RE-1000W-SP流化冰机，江苏南通瑞友工贸有限公司；AF-103 AS制冰机，意大利Scotsman公司；FW-200强酸性电解水生成器，日本Amano公司；TA.XT Plus质构仪，英国Stable Micro System公司；Kjeltec 8400型凯氏定氮仪，丹麦FOSS公司；Alliance 2695型高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)系统，美国Waters公司；ZORBAXSB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美国Agilent公司。

1.5 实验方法

1.5.1 质构分析(texture profile analysis,TPA)

参照LI等[11]方法并稍作改动，取背部鱼肉切成(15×15×10) mm的方块，采用TPA分析模式测试，选用型号为TA39的探头，测试条件：测前速率2 mm/s，测试速率1 mm/s，探头触发力20 g，剪切距离 20 mm。每组样品平行测定6次。

1.5.2 总挥发性盐基氮(TVB-N)

参考SC/T 3032—2007《水产品中挥发性盐基氮测定方法》[12]进行操作，平行测定3次。

1.5.3 ATP关联物含量

1.5.3.1 ATP关联物提取

参考齐亮等[13]法并稍作修改，准确称取鱼背部肌肉4.0 g，加入20 mL、4 ℃预冷的10%高氯酸溶液，均质1 min，经10 000 r/min，4 ℃冷冻离心15 min，取上清液。沉淀用5%(质量分数)高氯酸溶液20 mL洗涤，离心取上清液，合并上清液，用10 mol/L KOH溶液调节pH值为6.8，静置30 min后离心，将上清液转移到100 mL容量瓶中，用双蒸水定容后经0.22 μm滤膜过滤待测。

1.5.3.2 ATP关联物测定

色谱条件：色谱柱C18柱，4.6 mm×250 mm，粒度5 μm。流动相：0.05 mol/L磷酸盐缓冲液。色谱柱温：35 ℃。流速：1.0 mL/min。检测波长：260 nm。进样量：10 μL。

1.5.3.3 鲜度指标计算

鱼肌肉中ATP按ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx的途径依次降解，其计算公式(1)、(2)和(3)如下：

式中: ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx分别代表腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、腺苷酸、肌苷酸、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤浓度(μmol/g，湿基)。

1.5.4 微生物指标

微生物指标采用GB/T 4789.2—2016[14]平板倾注计数测定。鲈鱼去皮去内脏后，称取10 g背部鱼肉于灭菌袋中，加入90 mL 0.85%(质量分数)无菌生理盐水，以10倍梯度稀释，取3个合适的稀释度进行培养，每个稀释度作3个平行。不同微生物的选择性培养基与培养条件如表1所示。

实验数据均采用3次平行实验的平均值，数据用软件Origin (Pro) 8.0绘制曲线，数据间的差异通过统计软件SPSS 13.0中的Duncan新复极差法进行方差分析与多重比较，结果以平均值±标准偏差表示。鲜度指标的综合分析由AlphaSoft V11.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 多面剖析法(TPA)

质构与鱼肉组织中的脂肪与胶原蛋白含量、贮藏温度与时间等相关，其易受鱼体死后产生的微生物与自溶酶影响[15]。

如图1所示，CK组鲈鱼样品的硬度值与弹性值降幅最明显，AEWI组样品次之，SI组样品下降速度最慢。在第9～23 天时，AEWI和CK组样品的硬度值和弹性值无显著差异(P>0.05)。因此，与CK组样品相比，酸性电解水冰不能显著抑制鲈鱼纤维组织的劣变，但对质构特性的变化也无不利影响。姚鑫等[16]研究酸性电解水冰对小黄鱼质构特性的影响中也有相似结论。第12天时CK、SI与AEWI组样品的咀嚼性值，分别从0 d时的793.89 N降至185.04、393.69、302.62 N，此时CK组样品已腐败，而AEWI和SI组样品仍保持一定的咀嚼性质。周然等[17]发现AEW保鲜河豚鱼时，可能是通过减缓贮藏过程中鱼肉中的肌原纤维分解作用，避免鱼肉硬度、弹性和回复性等质构变化。因此，采用AEWI保鲜鲈鱼，其作用机制是可能通过冰中缓释的有效氯成分，协同其高氧化还原作用[18]，延缓了微生物产生的酶类对肌肉纤维分解，有效保持鱼肉弹性等特性。综上所述，流化冰与酸性电解水冰处理均可在一定程度上维持鲈鱼的质构特性。

2.2 总挥发性盐基氮(TVB-N)

鲈鱼肉的TVB-N值<13 mgN/100 g为一级鲜度，TVB-N值>30 mgN/100 g即不可食用[19]。由图2可知，贮藏前期，样品的TVB-N值出现下降趋势，可能由于贮藏前期鱼肉产生的乳酸与氨及胺类物质发生中和所致[5]。CK组样品的TVB-N值上升趋势明显，在第12天时超过一级鲜度，贮藏18 d时已超过限量标准，而AEWI组和SI组在前12、15 d的TVB-N值都处于一级鲜度标准内。从12 d开始，CK组和AEWI组的TVB-N上升趋势明显，由于酸性电解水仍具有一定的抑菌和杀菌效果，故其TVB-N值显著低于CK组(P<0.05)。SI组TVB-N值上升平缓，贮藏后期时其TVB-N值在初始值附近， width=10,height=15,dpi=110

SCAR等[20]、林雪等[21]利用流化冰对鲹鱼、鲐鱼保鲜，在贮藏第15天时的TVB-N值与初始值相比基本无变化。这与本文研究结果类似。结果表明，流化冰和酸性电解水冰对鲈鱼均有一定的保鲜作用。

2.3 ATP关联物含量变化

一般认为鱼体死后，ATP在内源酶的作用下依次降解为ADP、AMP、IMP、HxR和Hx，其中IMP是鱼肉中重要的鲜味物质，HxR和Hx则是鱼肉中不可接受气味的主要来源[22]。

由图3可知，随着贮藏时间的延长，不同冰藏组的ATP、ADP含量快速下降并在第3天后趋于稳定，这与刘寿春等[23]研究结果一致。与CK组样品相比，SI和AEWI组样品的ATP、ADP含量较高。AMP具有苦味抑制功能，3组样品在前3 d的AMP含量显著降低，随后上升并维持在较低水平。ATP及其关联物的降解水平主要受鱼类的品种、肌肉类型和贮藏条件的影响[5]。3组鲈鱼的IMP在0～3 d均呈现上升趋势，而后快速下降，这是由于前期ATP、AMP在内源酶作用下降解为IMP，使IMP出现一定累积，随后磷酸水解酶的作用使IMP分解为HxR和Hx，史策[24]对鲢鱼的研究也有相似结论。HxR呈先升后降的趋势，AEWI和CK组在18 d达到最大值8.69和8.29 mg/100 g，SI组在15 d达到最大值7.51 mg/100 g。冰藏期间Hx含量持续增加，其中CK组的Hx含量最高，AEWI冰次之，SI组在12 d后显著低于另2组。随着HxR和Hx含量的增加，鱼肉品质不断下降，由此可知，酸性电解水冰中的次氯酸(HOCl)能在一定程度上抑制或杀灭鱼体表面的微生物，延缓ATP降解速度。流化冰也可抑制微生物和内源酶活性，延缓样品中的ATP和IMP降解为HxR和Hx的速度，具有更好的保鲜效果。

2.4K值与相关鲜度指标变化

K值是评价大多数鱼类鲜度的重要指标，一般认为作为生鱼片新鲜鱼的K值在20%以下，20%～50%为二级鲜度，高于60%为不可食用[25]。除K值外，Fr和H值也被认为是客观评价鱼肉腐败程度的鲜度指标[26]。

如图4所示，鲈鱼的初始K值为3.95%，表明其新鲜度较高。贮藏第18天时，CK和AEWI处理后样品的K值分别达到62.81%、63.56%，SI组样品为47.47%，低于其余2组。这与前期得到的HxR与Hx值结果趋势相近。3组样品的H值呈上升趋势，而Fr值逐渐下降。CK组样品的Fr值显著低于SI和AEWI处理组，这些鲜度值的变化准确体现了Hx与HxR的整体含量，其主要原因是贮藏期间样品中的微生物增殖促进IMP向HxR、Hx转化。因此，流化冰和酸性电解水冰处理能抑制样品核苷酸的降解速度。

然而，随着鲈鱼新鲜度的降低，贮藏期间H值的增长速度仍较缓慢，可推测除H值外，K和Fr值在评价冰藏鲈鱼的新鲜度上方法可行，这与SONG等[26]研究结论一致。

2.5 微生物分析

微生物是引起水产品蛋白质和氨基酸分解代谢的主要因素之一，腐败微生物的生长状况反映水产品的腐败程度[27]。

由图5-a可知，鲈鱼贮藏初期的菌落总数为3.92 lgCFU/g，表明样品新鲜度较高，这与邵颖[2]研究结果相似。随着贮藏时间的延长，CK组样品的菌落总数上升趋势明显，显著高于其余2组。在第12天时，CK组样品的菌落总数达6.21 lgCFU/g，超出限量标准，不可食用，而AEWI与SI组样品的菌落总数仍处于水产品可食用鲜度范围[28]。其中，以流化冰处理对菌落总数的影响最显著。

冷藏过程中，水产品中耐冷优势腐败菌——假单胞菌和腐败希瓦式菌更能表征其鲜度[29-30]。由图5-b与5-c可见，与CK组样品相比，酸性电解水冰缓慢释放的ClO-、ClO2-、O3、H2O2及[O]等活性物质，可有效抑制细菌的细胞质酶活性，损坏细菌外层细胞膜进而导致菌体死亡，表现出良好的抑菌活性，使腐败菌数有所减少[31]。有研究发现AEW碎冰同样能表现出良好杀菌活性[18]。此外，SI组样品的假单胞菌与希瓦氏菌数上升缓慢。因此，在无交叉污染情况下，流化冰的强热交换能力与NaCl的抑菌作用可有效抑制鱼肉中微生物生长。林雪[19]在鲐鱼保鲜中因流化冰与鱼发生交感染，得出流化冰对于微生物的抑制作用并不比碎冰突出。

2.6 相关性分析

将鲈鱼贮藏期间的微生物指标、质构与ATP关联物测定结果通过皮尔森相关系数分析，以明确各类指标间的相关性，结果如表2所示。

由表2可知，冰藏过程中鲈鱼肉的TVC、假单胞菌与希瓦氏菌间彼此极显著相关(P<0.01)，且3个微生物指标均与硬度值、弹性值、咀嚼性值、IMP值、HxR值、Hx值显著相关(P<0.05)。其中微生物变化与HxR值、Hx值正相关，但与ATP值、ADP值和AMP值指标相关性不显著(P>0.05)。同时，硬度值与弹性值、咀嚼性值、IMP值呈显著正相关(P<0.05)，相关系数分别为0.942、0.983、0.820，与HxR值、Hx值显著负相关，相关系数为-0.931、-0.881，与微生物指标呈显著负相关(P<0.05)。ATP值与ADP值极显著正相关，相关系数为0.981，IMP值与Hx值呈负相关，相关系数为-0.941。

注：*表示在0.05水平上显著相关；**表示在0.01水平上显著相关。

综上分析，在反映冰藏鲈鱼鲜度的指标方面，微生物指标、质构和IMP值、HxR值、Hx值相关性明显，说明这些指标均能很好反映鲈鱼冰藏期间的新鲜度变化。其中，LI等[32]研究表明鲤鱼在冷链贮藏中腐败菌是HxR向Hx转化过程的关键因素。吴依蒙等[33]实验得出，牙鲆在保藏过程中微生物生长与IMP降解紧密相关。

2.7 鲜度指标的主成分分析

主成分分析(principal component analysis，PCA)为统计方法之一，其通常可通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量，转换后的这组变量叫主成分。近年来，PCA分析已逐渐用于食品相关领域的研究中。图6直观显示了各主成分主要提取的信息和各指标之间的相关性。其中，距离象限分界线较远的指标对主成分的贡献更大，与每个主成分中位置相近的指标正相关，呈180°分布的指标呈现负相关，而距离远且呈90°分布指标不相关[34]。

由图6所示，通过对不同冰藏处理下鲈鱼的鲜度指标进行主成分分析，得到特征值>1的2个主成分，累积方差贡献率为92.87%，说明2个主成分反映了原始变量的绝大部分信息，满足主成分分析的降维目的。同时，鲈鱼的鲜度指标主要分布在第一、四象限内，在第一主成分提取的指标主要位于图的左右两侧。

其中，TVC、希瓦氏菌、假单胞菌、HxR与Hx距离较近，咀嚼性、硬度、弹性与IMP也有同样变化，这2组指标呈180°分布。这与前面的皮尔森相关性分析结果相符。

3 结论

贮藏期间，经流化冰和酸性电解水冰保鲜处理的鲈鱼肌肉质构特性保持效果较好，且其TVB-N值、微生物数、K值及主要鲜度指标值均显著低于碎冰处理组样品。与酸性电解水冰处理组相比，流化冰能在无交叉污染情况下显著延缓鲈鱼TVB-N、HxR、Hx的生成速率，抑制K值的升高与假单胞菌、希瓦氏菌增殖，较好保持其鲜味成分。相关性与主成分分析结果表明，微生物数、质构和IMP、HxR、Hx显著相关，说明这些指标均能很好反映鲈鱼冰藏期间的鲜度变化。综合各指标得出，与碎冰组样品相比，流化冰和酸性电解水冰处理可延缓鲈鱼品质劣变，延长货架期。可见，酸性电解水冰在鲈鱼贮藏过程中起到积极作用，在鲈鱼贮藏中还有待进一步探究酸性电解水冰的最佳制冰浓度、电解时间与鲈鱼保鲜间相关性。流化冰的高潜热能力与密封隔绝空气效应能有效抑制微生物的生长与酶的活性，在鲈鱼贮藏保鲜中有明显的效果。因此，将流化冰和酸性电解水冰技术用于水产品的保鲜加工上具有潜在的发展前景。

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