谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统优化

王婷1,马洪坤1,赵桂红1,蔡柠匀1,张德志1,陈宁1,2,3,4*

1(天津科技大学 生物工程学院,天津,300457) 2(代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室(天津科技大学),天津,300457) 3(教育部工业发酵微生物重点实验室(天津科技大学),天津,300457) 4(天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心,天津,300457)

摘 要 谷氨酸棒状杆菌作为重要的微生物细胞工厂,基因组修饰已经成为调节目标代谢物的首要途径。为了提高基因定点突变的编辑效率,建立了高效省时的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统。利用卡那霉素抗性作为筛选标记,构建了1株严谨的单链模式菌M-1,用于验证与统计编辑效率。首先,采用强启动子Ptuf,优化了切割效率;其次,利用重组酶RecT和合理长度与添加量的ssDNA,优化了重组效率。实验结果显示:在启动子Ptuf和RecT的双重作用下,采用滞后链(70 bp、12.5 μg)优化组合方式,使基因编辑效率提升至(80±5.7)%。由RecT介导的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统可在很大程度上加快谷氨酸棒状杆菌代谢工程改造。

关键词 CRISPR-Cpf1;ssDNA;谷氨酸棒状杆菌;优化;基因组编辑

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的工业微生物[1-2]。为了获得优良的工程菌株,提高目的产物产量,常在代谢工程改造过程中对关键基因进行定点突变。然而,C. glutamicum遗传操作工具十分匮乏,导致筛选突变菌株困难重重。传统策略采用的是随机诱变的方法[3]。目前,C. glutamicum ATCC 13032的基因组编辑主要依赖pk18mobsacB反选择系统[4],使用该系统对基因组进行定点突变时,通常采用的是先敲除再整合的策略,首先对靶向基因进行敲除,然后将携带点突变的同源序列整合到靶位点上,每次编辑过程都需要经过2轮单交换菌和双交换菌的筛选过程,增加了工作量,耗费了时间[5]

最近发展的CRISPR(the clustered regularly interspaced short palindromic repeat)技术已成功应用于许多物种的基因编辑[6-9]。核酸内切酶Cpf1与Cas9相比有许多不同的特性:Cpf1蛋白更小,更利于转化宿主;Cpf1剪切产生黏性末端,更有利于基因编辑后的修复,而Cas9是平末端剪切;在进行多位点编辑时,由于Cpf1本身可以对转录的RNA进行加工剪切,简化了crRNA的表达,而Cas9对应的多个sgRNA表达则需要多个终止子。鉴于CRISPR/Cpf1精准性和特异性的基因编辑优势,使其更加有利于克服CRISPR/Cas9的限制,在水稻、小鼠和人体细胞的应用中几乎没有脱靶效应[10-11]。有研究表明C. glutamicum基因组缺少一种SpCas9典型的crRNA序列,造成SpCas9在C.glutamicum中表达时,对细胞产生毒害作用[12]。所以,在使用Cas9时,研究者发现非特异密码子优化[13],或者需要控制Cas9表达量[5],才能保证基因编辑的顺利进行。因此,Francisella novicida(Fn)Cpf1蛋白成为首选。在CRISPR-Cpf1/ssDNA系统中,编码大肠杆菌前噬菌体的重组酶RecT起到了至关重要的作用,重组酶RecT将合成的单链寡脱氧核糖核苷酸合并到基因组中,促进ssDNA重组,提高CRISPR-Cpf1系统筛选突变体的效率[14]。本研究建立了CRISPR-Cpf1/ssDNA单质粒基因编辑系统,单质粒是指pXMJ19质粒上同时携带靶向特异的crRNA和Cpf1蛋白,并在C. glutamicum中表达RecT,构建了一株严谨的单链模式菌用于验证和统计基因编辑效率,成功地对其基因组靶位点进行了基因编辑修饰。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

本研究所用菌株见表1。

1.1.2 质粒

本研究所用质粒见表2。

1.1.3 引物信息

本研究所用引物序列见表3。

表1 本研究所用菌株
Table 1 Strains used in the study

菌株特性来源E.coli DH5αF-, Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(r-k,m+k), recA1, endA1, relA1Lab stockWTWild type(C.glutamicum ATCC 13032)Lab stockM-1WTΔcgl1890::kan#This studyM-2WTΔcgl1890::kanThis study

表2 本研究所用质粒
Table 2 Plasmids used in the study

质粒特性来源pXMJ19CmR, tac promoter, E.coli/C.glutamicum shuttle cloning vectorLab stockPUC57-Cpf1KanR, carrying Cpf1Lab stockpECSpeR, hom promoter, E.coli/C.glutamicum shuttle cloning vectorLab stockpK18mobsacBKanR, Suicide vectorLab stockpEC-Phom-recTSpeR, hom promoter, carrying recT geneThis studypXMJ19-PlacM-Cpf1CmR, lacM promoter, carrying Cpf1 geneThis studypk18mobsacB△cgl1890::kan#KanR, carrying a inactivated kan geneThis studypXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNADLCmR, carrying crRNADLThis studypXMJ19-Ptuf-Cpf1CmR, tuf promoter, carrying Cpf1 geneThis studypXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNADLCmR, carrying crRNADLThis study

表3 本研究所用引物
Table 3 Primers used in the study

引物序列(5′-3′)酶切位点DL-1tgcctgcaggtcgacTCTAGAGACTAGTGGGGGTTTCTGCTGTTXba IDL-2GTTCCGCTTCCTTTAGCAGCCCTGGCGATAGGTGTCAAGAATTCGDL-3CGAATTCTTGACACCTATCGCCAGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACDL-4GAAAAGCGGCCATTTTCCACGTCAGATATTCGGCAAGCAGGCATDL-5ATGCCTGCTTGCCGAATATCTGACGTGGAAAATGGCCGCTTTTCDL-6ATAGCGTGGTTGGCGAAGTTCGCGATTTACTTTTCGACCTCDL-7GAGGTCGAAAAGTAAATCGCGAACTTCGCCAACCACGCTATDL-8tacgaattcgagctcGGTACCAATGGTAGTGAACTACCGTCCCTTKpn ISCGACAGGTAAAGGTTTGATATATGCACTCGATAAATAGTGTTTGGCCAGTDLK-gacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcATGgtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtDLK+acagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccacCATgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcCPF-1ttctgaaatgagctgAAGCTTATCGTGTGGTACCATGTGTGGAATTGGAAAGGACTTGAACGATGTCCATCTACCAAGAGTTTGTGAAHindIIICPF-2gagctcggtacccggGGATCCTTAGTTATTGCGGTTCTGGACAAATBamHIIICPF-3cgaagtccaggaggaAAGCTTATGTCCATCTACCAAGAGTTTGTGAHindIIIcrRNADLtgtccagaaccgcaataactaaTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGGTCTCGAATTTCTACTGTTGTAGATGCCTGCTTGCCG AATATCTGaCGTGGAAAGAGACCTCTAGAggctgttttggcggatgagagaagXba IphT-1aggaaacagaccatgGAATTCTGTAAGGCCTGCACCAACAATEcoR IphT-2AAGAGTGGTTTTGTGCTCATGATTCTCCAAAAATAATCGCGGTphT-3CCGCGATTATTTTTGGAGAATCATGACTAAGCAACCACCAATCGphT-4tagaggatccccgGGTACCTTATTCCTCTGAATTATCGATTACACTGKpn I

注:下划线代表酶切位点,斜体代表引物间重叠区域,小写字母代表同源臂。

1.1.4 主要仪器与设备

Mastercycler nexus PCR仪、Eppendorf Eporator电击转化仪,德国Eppendorf公司;GL20A高速冷冻离心机,日本日立有限公司;UV200紫外可见波长检测器,美国Laballiance公司;SCD-II高纯水装置,美国Millipore公司。

1.1.5 主要试剂

Primer STAR HS脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)polymerase(2.5 U/μL)、QuickCut限制性内切酶(120 U/μL),大连宝生物工程有限公司;Taq聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)MasterMix、Clone Express®ⅡOne Step Cloning Kit,南京诺维赞生物工程有限公司;质粒提取及DNA回收试剂盒,上海Omega Bio-tek公司;氯霉素、盐酸壮观霉素和卡那霉素,美国Sigma公司。

1.1.6 培养基

LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 5,121 ℃灭菌20 min;脑心浸液培养基(brian heart infusion,BHI):脑心浸液37.5 g/L,121 ℃灭菌20 min;BHIS复苏液(g/L):脑心浸液37.5,葡萄糖 5,115 ℃灭菌15 min。

1.2 实验方法

1.2.1 质粒构建与转化

C.glutamicum基因组为模板,用DL-1/DL-2和DL-7/DL-8为引物,分别PCR扩增上下游同源臂;以pk18mobsacB质粒为模版,用DL-3/DL-4和DL-5/DL-6作为引物,分别扩增获得被拆分的2部分kan#基因片段,并将上述2部分重叠。pk18mobsacBXba I和Kpn I双酶切线性化,将DNA片段与线性化载体用Clone Express®ⅡOne Step Cloning Kit同源重组酶连接获得用于构建单链模式菌M-1的重组质粒pk18mobsacBcgl1890::kan#;以PUC57-Cpf1为模板,用引物CPF-1/CPF-2扩增PlacM-Cpf1的基因片段。pXMJ19经Hind III单酶切线性化,按照上述同源重组方法获得质粒pXMJ19-PlacM-Cpf1;用引物CPF-3/CPF-2扩增Cpf1基因。pXTuf经Hind III和BamH I双酶切线性化,同上获得重组质粒pXTuf-Cpf1;采用miniGene合成crRNADL,pXMJ19-PlacM-Cpf1质粒经BamH I单酶切线性化,将二者同源重组获得切割质粒pXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNA;同法获得切割质粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNA;以C. glutamicum基因组作为模板,用引物phET-1/phET-2扩增Phom,以E. coli基因组作为模板,用引物phT-3/phET-4扩增recT,将质粒pEC-XK99E经EcoR I和Kpn I双酶切线性化。按照上述同源重组方法获得pEC-Phom-recT。采用CaCl2介导的化学转化法[12]获得重组质粒,并按照试剂盒说明书提取质粒。

PCR体系:5×PS Buffer 10 μL、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)mixture (10 mmol/L) 4 μL、上下游引物各2 μL、DNA模板约200 ng、HS酶(5 U/μL) 0.5 μL、ddH2O补充至50 μL。PCR条件:95 ℃预变性5 min;98 ℃变性10 s,适当退火温度下退火15 s,72 ℃延伸适当时间(1 min延伸约1 kb),30个循环;72 ℃再延伸10 min。

1.2.2 谷氨酸棒状杆菌电转化法

将重组质粒(500 ng)与谷氨酸棒状杆菌感受态细胞混合后加入电转杯,冰浴20 min,电击,加葡萄糖脑心浸液肉汤(BHIS)复苏液,46 ℃水浴热激6 min,32 ℃、220 r/min条件下复苏2 h,涂布于添加相应抗生素的BHI培养基平板,32 ℃培养,PCR鉴定目的菌株。

1.2.3 单链模式菌M-1的构建

采用pk18mobsacB反选择基因编辑系统[15]。将质粒pk18mobsacBcgl1890::kan#电转化至C. glutamicum感受态细胞,利用单交换菌株(鉴定引物S/DL-4)和双交换菌株(鉴定引物DL-5/A)筛选到重组菌株WT△cgl1890::kan#(M-1)。

1.2.4 质粒的消除

采用液体传代培养的方法,将携带质粒的目的菌株接种于无抗生素的BHI液体培养基,32 ℃过夜培养,再将菌液稀释涂布于无抗BHI平板,然后将平板上的单菌落依次分别对点至有抗和无抗平板。选择在有抗平板上不生长而在无抗平板上生长的菌株,即为成功消除质粒的目的菌株。

2 结果与分析

2.1 构建单链模式菌

2.1.1 选择卡那霉素抗性作为筛选标记

为了便于验证和统计CRISPR-Cpf1/ssDNA系统的基因编辑效率,构建了1株严谨的C. glutamicum单链模式菌M-1。菌株M-1的构建原理:在cgl1890位点整合了一个移码突变失活KanR(kan#-cassette),使用ssDNA(DLK-/DLK+)修复突变碱基(图1),使KanR恢复[16],即修复后的菌株可在含有卡那霉素的BHI平板中正常生长。

图1 单链模式菌M-1基因编辑示意图
Fig.1 Schematic diagram of gene editing for ssDNA model strain M-1

2.1.2 验证单链模式菌M-1的KanR严谨性

随机选取经正确编辑且具有KanR的单菌落进行基因测序,测序结果如图2显示,移码突变碱基序列TGAC变为ATG,说明正确修复了失活的KanR。由此可见,采用单链模式菌M-1验证编辑效率是严谨的,利用KanR筛选标记获得的验证数据是可靠的。

图2 单链模式菌KanR的严谨性
Fig.2 Rigor of KanR on ssDNA model strain

2.2 CRISPR-Cpf1/ssDNA系统基因组编辑流程

RecT介导的基因编辑流程(图3-a):首先,构建过表达recT的重组质粒pEC-Phom-recT。构建切割质粒pXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNA[12];然后,制备含有RecT的菌株感受态细胞,将切割质粒和ssDNA同时电转至上述感受态,涂布含有氯霉素和奇霉素BHI固体培养基,32 ℃过夜培养;再次,随机挑选平板中的菌株基因测序;最后,消除质粒(进行连续基因操作时,质粒pEC-Phom-recT可以保留)。基因编辑周期为N+3 d(N为RecT感受态细胞制备的时间);无RecT介导的基因编辑流程(图3-b):操作基本同上,只是该流程省略了RecT感受态细胞的制备过程。

P-携带Cpf1和crRNA的载体;SpeR-奇霉素抗性基因;CmR-氯霉素抗性基因;
a-RecT介导的CRISPR-Cpf/ss DNA系统;b-无RecT介导的CRISPR-Cpf1/SS DNA系统
图3 CRISPR-Cpf1/ssDNA系统基因编辑流程图
Fig.3 A flow-chart for CRISPR-Cpf1/ssDNA gene editing

2.3 优化CRISPR-Cpf1/ssDNA系统的切割致死作用

CRISPR-Cpf1系统由一段向导RNA引导,识别靶基因位点的PAM(protospacer adjacent motif),再与核酸内切酶蛋白结合实现特定DNA靶向切割[17],即Cpf1-crRNA复合物可以结合靶DNA产生双链断裂(double-strand break,DSB)[18-19]。DSB是一种功能强大的反选择标记,它可以提供一种选择压力用于供体DNA模板修复,保证较高的基因编辑效率[20-22]。由于CRISPR-Cpf1系统诱导的DSB对C.glutamicum具有致死性,因此crRNA的靶向切割效率通过菌株细胞的存活转化子数量(colony forming units,c.f.u.)来反映[23-25]。低靶向效率的crRNA在基因组编辑过程中会导致很高的假阳性率,导致群体中许多野生型细胞存活。因此,建立CRISPR基因编辑系统时,首先要构建切割质粒,并验证其是否具有良好的切割作用。一个单一成熟的crRNA包含一段20 bp保守序列和一段24 bp的靶向序列。本研究将Cpf1和crRNA同时置于切割质粒上,当crRNA中富含胸腺嘧啶的。crRNA-cassette包含启动子Pj23119、靶基因位点的crRNA和终止子rrnb。

为了选择更好的方式表达Cpf1,提高基因组切割效率,比较了启动子Ptuf和PlacM对切割效率的影响,靶位点设计在单链模式菌M-1的突变位点,分别构建切割质粒pXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNADL和pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNADL。将切割质粒和对照质粒pXMJ19-Cpf1分别电转至菌株M-1的感受态细胞,涂布固体BHI培养基(氯霉素),统计平板中漏切的转化子数量。

如图4所示,当没有crRNA时,对照组Ptuf和PlacM存活细胞数(个)分别约为3.35×103和3.72×103,说明对照质粒pXMJ19-Cpf1并不起切割作用。然而,切割质粒的转化子数量明显少于对照组,说明切割质粒发挥了良好的切割致死作用;当crRNA存在时,Ptuf和PlacM组存活细胞数分别大幅下降,Ptuf组漏切的转化子数量明显少于PlacM组,说明Ptuf启动子更加有助于Cpf1的表达,切割质粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNA切割效果更好,若采用启动子Ptuf更加有助于提升基因编辑效率。

图4 CRISPR-Cpf1系统切割作用
Fig.4 Cutting effect of CRISPR-Cpf1 system

2.4 优化CRISPR-Cpf1/ssDNA系统的重组作用

由于DSB对大多数缺乏非同源末端连接(NHEJ)机制的细菌是致命的[26],因此,为了提高经DNA双链断裂后被修复的菌株存活率,需要一个外来修复模板刺激DNA修复通路,对断裂的靶位点进行同源定向修复。

2.4.1 RecT对ssDNA基因重组的影响

谷氨酸棒状杆菌自身的同源重组能力较低,通常需要借助重组酶提高其重组能力。在RecET重组系统中,RecT是DNA退火蛋白和单链结合蛋白[27]。因此,本研究尝试用RecT提高CRISPR-Cpf1/ssDNA系统的重组作用。将前导链和滞后链分别电转至两种单链模式菌M-1的感受态细胞(-RecT或+RecT),涂布含有卡那霉素的BHI固体培养基,统计转化子数量。

如图5所示,首先,滞后链的转化子数量高于前导链,说明滞后链的重组作用优于前导链;其次,当菌株表达RecT时,被成功修复且具有KanR的转化子数量高于-RecT组,并且滞后链+RecT组的重组作用比-RecT组提高了25%。由此可见,RecT可对单链重组起到促进作用。

图5 RecT对单链重组的影响
Fig.5 Effect of RecT on ssDNA recombination

2.4.2 优化ssDNA长度

当发生DSB双链断裂时,可通过同源重组作用将断裂位点修复,且通过增加同源臂长度提高同源重组效率,从而提高细胞存活率。有相关研究采用了长度为59 bp的ssDNA进行了基因编辑[12]。为了更加系统的研究单链长度对重组作用的影响,本文参考上述报道中所使用的单链长度,同时考虑到引物合成成本的因素,将长度范围为30~70 bp的ssDNA(滞后链,DLK+)和切割质粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNADL电转至菌株M-1的感受态细胞(+RecT),涂布含有卡那霉素的BHI平板,统计平板中转化子数量。实验结果如图6所示,被正确编辑的且具有KanR的转化子数量随着ssDNA长度的增加而增加。当ssDNA长度达到70 bp时,ssDNA重组作用最佳。

图6 单链ssDNA长度对基因重组的影响
Fig.6 Effect of ssDNA length on gene recombination

2.4.3 优化ssDNA添加量

当ssDNA被转化进入菌株细胞后,大部分会被细胞自身降解,只有很小一部分ssDNA会发挥重组作用。有相关研究采用了10 μg的ssDNA进行了基因编辑[12]。为了深入研究单链添加量对重组作用的影响,获得最佳添加量,本文参考上述报道中所使用的添加量,同时考虑到引物合成成本的因素,将添加量为2.5~12.5 μg的ssDNA(滞后链,DLK+,70 bp)和切割质粒同时电转至菌株M-1的感受态细胞(+RecT),涂布含有卡那霉素的BHI平板,统计平板中转化子数量。实验结果如图7所示,转化子数量随着ssDNA浓度的增加而增加,当添加量达到12.5 μg时,被正确修复且具有KanR的菌落数达到最高值。说明合理增加ssDNA浓度会促进ssDNA重组作用。

图7 单链ssDNA添加量对基因重组的影响
Fig.7 Effect of ssDNA addition on gene recombination

2.5 RecT介导的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因编辑效率

为了统计RecT介导的ssDNA基因编辑效率,按照2.2节所示的基因编辑流程方法将ssDNA(滞后链DLK+、添加量12.5 μg、长度70 bp)和切割质粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-crRNADL同时电转至单链模式菌M-1的感受态细胞(-RecT/+RecT),涂布含有氯霉素的BHI固体培养基,再对点卡那霉素BHI固体培养基,统计ssDNA基因编辑效率,计算公式如下所示,

基因编辑效率

(1)

如图8所示,当无RecT时,ssDNA编辑效率分别为(15%±2.4)%(按照公式(1)计算3组平行试验的转化子数之比:6/50、8/52、10/60);当有RecT时,编辑效率分别为(80±5.7)%(19/22、18/24、20/25),是无RecT时的5.3倍。由此可见,优化后的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因编辑系统,在Ptuf切割质粒和重组酶RecT的双重作用下,提高了突变菌株的筛选效率。

图8 RecT介导的CRISPR-Cpf1/ssDNA系统基因编辑效率
Fig.8 Gene editing efficiency of RecT-CRISPR-Cpf1/ssDNA system

3 结论

本研究建立了RecT介导的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因编辑系统,对切割和重组两方面进行了深入研究,通过利用启动子Ptuf优化了切割效率以及对比不同ssDNA长度和添加量优化了重组效率。确定的最佳基因编辑方案为:ssDNA(滞后链)的添加量为12.5 μg,ssDNA的长度为70 bp。优化后的基因编辑效率为(80±5.7)%,可有效地对基因靶点进行编辑修复。可进一步尝试研究该系统的多基因定点编辑,使其在C. glutamicum基因组代谢工程改造中发挥更大的应用价值与潜力。

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Optimization of a CRISPR-Cpf1/ssDNA genome editing system for Corynebacterium glutamicum

WANG Ting1,MA Hongkun1,ZHAO Guihong1,CAI Ningyun1,ZHANG Dezhi1,CHEN Ning1,2,3,4*

1(College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China) 2(National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology(Tianjin University of Science and Technology), Tianjin 300457, China) 3(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education(Tianjin University of Science and Technology), Tianjin 300457, China) 4(Tianjin Engineering Research Center of Microbial Metabolism and Fermentation Process Control, Tianjin 300457, China)

ABSTRACT Corynebacterium glutamicum is an important microbial cell factory, and genomic modification has become a primary way to regulate target metabolites. In order to improve the editing efficiency of site-directed mutation, an efficient and time-saving CRISPR-Cpf1/ssDNA genome editing system was established. The kanamycin resistance was used as a screening marker to construct a rigorous ssDNA model strain M-1 to verify and calculate editing efficiency. Firstly, strong promoter Ptuf was adopted to optimize cutting efficiency. Secondly, the recombination efficiency was optimized by recombinase RecT and reasonable length and addition amount of ssDNA. The results showed that under the dual action of promoter Ptuf and RecT, the gene editing efficiency increased to (80±5.7)% using the optimized combination of lagging strands (70 bp and 12.5 μg). Overall, the RecT-mediated CRISPR-Cpf1/ssDNA genome editing system can greatly accelerate the metabolic engineering modification of C. glutamicum.

Key words CRISPR-Cpf1;ssDNA;Corynebacterium glutamicum;optimization;genome editing

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.021520

第一作者:博士研究生(陈宁教授为通讯作者,E-mail:ningch@tust.edu.cn)。

基金项目:国家重点研发计划(2018YFA0900304);工业微生物优良菌种选育与发酵技术公共服务平台项目(17PTGCCX00190)

收稿日期:2019-07-02,改回日期:2019-07-18