谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的工业微生物[1-2]。为了获得优良的工程菌株,提高目的产物产量,常在代谢工程改造过程中对关键基因进行定点突变。然而,C. glutamicum遗传操作工具十分匮乏,导致筛选突变菌株困难重重。传统策略采用的是随机诱变的方法[3]。目前,C. glutamicum ATCC 13032的基因组编辑主要依赖pk18mobsacB反选择系统[4],使用该系统对基因组进行定点突变时,通常采用的是先敲除再整合的策略,首先对靶向基因进行敲除,然后将携带点突变的同源序列整合到靶位点上,每次编辑过程都需要经过2轮单交换菌和双交换菌的筛选过程,增加了工作量,耗费了时间[5]。
最近发展的CRISPR(the clustered regularly interspaced short palindromic repeat)技术已成功应用于许多物种的基因编辑[6-9]。核酸内切酶Cpf1与Cas9相比有许多不同的特性:Cpf1蛋白更小,更利于转化宿主;Cpf1剪切产生黏性末端,更有利于基因编辑后的修复,而Cas9是平末端剪切;在进行多位点编辑时,由于Cpf1本身可以对转录的RNA进行加工剪切,简化了crRNA的表达,而Cas9对应的多个sgRNA表达则需要多个终止子。鉴于CRISPR/Cpf1精准性和特异性的基因编辑优势,使其更加有利于克服CRISPR/Cas9的限制,在水稻、小鼠和人体细胞的应用中几乎没有脱靶效应[10-11]。有研究表明C. glutamicum基因组缺少一种SpCas9典型的crRNA序列,造成SpCas9在C.glutamicum中表达时,对细胞产生毒害作用[12]。所以,在使用Cas9时,研究者发现非特异密码子优化[13],或者需要控制Cas9表达量[5],才能保证基因编辑的顺利进行。因此,Francisella novicida(Fn)Cpf1蛋白成为首选。在CRISPR-Cpf1/ssDNA系统中,编码大肠杆菌前噬菌体的重组酶RecT起到了至关重要的作用,重组酶RecT将合成的单链寡脱氧核糖核苷酸合并到基因组中,促进ssDNA重组,提高CRISPR-Cpf1系统筛选突变体的效率[14]。本研究建立了CRISPR-Cpf1/ssDNA单质粒基因编辑系统,单质粒是指pXMJ19质粒上同时携带靶向特异的crRNA和Cpf1蛋白,并在C. glutamicum中表达RecT,构建了一株严谨的单链模式菌用于验证和统计基因编辑效率,成功地对其基因组靶位点进行了基因编辑修饰。
1.1.1 菌种
本研究所用菌株见表1。
1.1.2 质粒
本研究所用质粒见表2。
1.1.3 引物信息
本研究所用引物序列见表3。
表1 本研究所用菌株
Table 1 Strains used in the study
菌株特性来源E.coli DH5αF-, Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(r-k,m+k), recA1, endA1, relA1Lab stockWTWild type(C.glutamicum ATCC 13032)Lab stockM-1WTΔcgl1890::kan#This studyM-2WTΔcgl1890::kanThis study
表2 本研究所用质粒
Table 2 Plasmids used in the study
质粒特性来源pXMJ19CmR, tac promoter, E.coli/C.glutamicum shuttle cloning vectorLab stockPUC57-Cpf1KanR, carrying Cpf1Lab stockpECSpeR, hom promoter, E.coli/C.glutamicum shuttle cloning vectorLab stockpK18mobsacBKanR, Suicide vectorLab stockpEC-Phom-recTSpeR, hom promoter, carrying recT geneThis studypXMJ19-PlacM-Cpf1CmR, lacM promoter, carrying Cpf1 geneThis studypk18mobsacB△cgl1890::kan#KanR, carrying a inactivated kan geneThis studypXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNADLCmR, carrying crRNADLThis studypXMJ19-Ptuf-Cpf1CmR, tuf promoter, carrying Cpf1 geneThis studypXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNADLCmR, carrying crRNADLThis study
表3 本研究所用引物
Table 3 Primers used in the study
引物序列(5′-3′)酶切位点DL-1tgcctgcaggtcgacTCTAGAGACTAGTGGGGGTTTCTGCTGTTXba IDL-2GTTCCGCTTCCTTTAGCAGCCCTGGCGATAGGTGTCAAGAATTCGDL-3CGAATTCTTGACACCTATCGCCAGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACDL-4GAAAAGCGGCCATTTTCCACGTCAGATATTCGGCAAGCAGGCATDL-5ATGCCTGCTTGCCGAATATCTGACGTGGAAAATGGCCGCTTTTCDL-6ATAGCGTGGTTGGCGAAGTTCGCGATTTACTTTTCGACCTCDL-7GAGGTCGAAAAGTAAATCGCGAACTTCGCCAACCACGCTATDL-8tacgaattcgagctcGGTACCAATGGTAGTGAACTACCGTCCCTTKpn ISCGACAGGTAAAGGTTTGATATATGCACTCGATAAATAGTGTTTGGCCAGTDLK-gacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcATGgtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtDLK+acagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccacCATgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcCPF-1ttctgaaatgagctgAAGCTTATCGTGTGGTACCATGTGTGGAATTGGAAAGGACTTGAACGATGTCCATCTACCAAGAGTTTGTGAAHindIIICPF-2gagctcggtacccggGGATCCTTAGTTATTGCGGTTCTGGACAAATBamHIIICPF-3cgaagtccaggaggaAAGCTTATGTCCATCTACCAAGAGTTTGTGAHindIIIcrRNADLtgtccagaaccgcaataactaaTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGGTCTCGAATTTCTACTGTTGTAGATGCCTGCTTGCCG AATATCTGaCGTGGAAAGAGACCTCTAGAggctgttttggcggatgagagaagXba IphT-1aggaaacagaccatgGAATTCTGTAAGGCCTGCACCAACAATEcoR IphT-2AAGAGTGGTTTTGTGCTCATGATTCTCCAAAAATAATCGCGGTphT-3CCGCGATTATTTTTGGAGAATCATGACTAAGCAACCACCAATCGphT-4tagaggatccccgGGTACCTTATTCCTCTGAATTATCGATTACACTGKpn I
注:下划线代表酶切位点,斜体代表引物间重叠区域,小写字母代表同源臂。
1.1.4 主要仪器与设备
Mastercycler nexus PCR仪、Eppendorf Eporator电击转化仪,德国Eppendorf公司;GL20A高速冷冻离心机,日本日立有限公司;UV200紫外可见波长检测器,美国Laballiance公司;SCD-II高纯水装置,美国Millipore公司。
1.1.5 主要试剂
Primer STAR HS脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)polymerase(2.5 U/μL)、QuickCut限制性内切酶(120 U/μL),大连宝生物工程有限公司;Taq聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)MasterMix、Clone Express®ⅡOne Step Cloning Kit,南京诺维赞生物工程有限公司;质粒提取及DNA回收试剂盒,上海Omega Bio-tek公司;氯霉素、盐酸壮观霉素和卡那霉素,美国Sigma公司。
1.1.6 培养基
LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 5,121 ℃灭菌20 min;脑心浸液培养基(brian heart infusion,BHI):脑心浸液37.5 g/L,121 ℃灭菌20 min;BHIS复苏液(g/L):脑心浸液37.5,葡萄糖 5,115 ℃灭菌15 min。
1.2.1 质粒构建与转化
以C.glutamicum基因组为模板,用DL-1/DL-2和DL-7/DL-8为引物,分别PCR扩增上下游同源臂;以pk18mobsacB质粒为模版,用DL-3/DL-4和DL-5/DL-6作为引物,分别扩增获得被拆分的2部分kan#基因片段,并将上述2部分重叠。pk18mobsacB经Xba I和Kpn I双酶切线性化,将DNA片段与线性化载体用Clone Express®ⅡOne Step Cloning Kit同源重组酶连接获得用于构建单链模式菌M-1的重组质粒pk18mobsacB△cgl1890::kan#;以PUC57-Cpf1为模板,用引物CPF-1/CPF-2扩增PlacM-Cpf1的基因片段。pXMJ19经Hind III单酶切线性化,按照上述同源重组方法获得质粒pXMJ19-PlacM-Cpf1;用引物CPF-3/CPF-2扩增Cpf1基因。pXTuf经Hind III和BamH I双酶切线性化,同上获得重组质粒pXTuf-Cpf1;采用miniGene合成crRNADL,pXMJ19-PlacM-Cpf1质粒经BamH I单酶切线性化,将二者同源重组获得切割质粒pXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNA;同法获得切割质粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNA;以C. glutamicum基因组作为模板,用引物phET-1/phET-2扩增Phom,以E. coli基因组作为模板,用引物phT-3/phET-4扩增recT,将质粒pEC-XK99E经EcoR I和Kpn I双酶切线性化。按照上述同源重组方法获得pEC-Phom-recT。采用CaCl2介导的化学转化法[12]获得重组质粒,并按照试剂盒说明书提取质粒。
PCR体系:5×PS Buffer 10 μL、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)mixture (10 mmol/L) 4 μL、上下游引物各2 μL、DNA模板约200 ng、HS酶(5 U/μL) 0.5 μL、ddH2O补充至50 μL。PCR条件:95 ℃预变性5 min;98 ℃变性10 s,适当退火温度下退火15 s,72 ℃延伸适当时间(1 min延伸约1 kb),30个循环;72 ℃再延伸10 min。
1.2.2 谷氨酸棒状杆菌电转化法
将重组质粒(500 ng)与谷氨酸棒状杆菌感受态细胞混合后加入电转杯,冰浴20 min,电击,加葡萄糖脑心浸液肉汤(BHIS)复苏液,46 ℃水浴热激6 min,32 ℃、220 r/min条件下复苏2 h,涂布于添加相应抗生素的BHI培养基平板,32 ℃培养,PCR鉴定目的菌株。
1.2.3 单链模式菌M-1的构建
采用pk18mobsacB反选择基因编辑系统[15]。将质粒pk18mobsacB△cgl1890::kan#电转化至C. glutamicum感受态细胞,利用单交换菌株(鉴定引物S/DL-4)和双交换菌株(鉴定引物DL-5/A)筛选到重组菌株WT△cgl1890::kan#(M-1)。
1.2.4 质粒的消除
采用液体传代培养的方法,将携带质粒的目的菌株接种于无抗生素的BHI液体培养基,32 ℃过夜培养,再将菌液稀释涂布于无抗BHI平板,然后将平板上的单菌落依次分别对点至有抗和无抗平板。选择在有抗平板上不生长而在无抗平板上生长的菌株,即为成功消除质粒的目的菌株。
2.1.1 选择卡那霉素抗性作为筛选标记
为了便于验证和统计CRISPR-Cpf1/ssDNA系统的基因编辑效率,构建了1株严谨的C. glutamicum单链模式菌M-1。菌株M-1的构建原理:在cgl1890位点整合了一个移码突变失活KanR(kan#-cassette),使用ssDNA(DLK-/DLK+)修复突变碱基(图1),使KanR恢复[16],即修复后的菌株可在含有卡那霉素的BHI平板中正常生长。
图1 单链模式菌M-1基因编辑示意图
Fig.1 Schematic diagram of gene editing for ssDNA model strain M-1
2.1.2 验证单链模式菌M-1的KanR严谨性
随机选取经正确编辑且具有KanR的单菌落进行基因测序,测序结果如图2显示,移码突变碱基序列TGAC变为ATG,说明正确修复了失活的KanR。由此可见,采用单链模式菌M-1验证编辑效率是严谨的,利用KanR筛选标记获得的验证数据是可靠的。
图2 单链模式菌KanR的严谨性
Fig.2 Rigor of KanR on ssDNA model strain
RecT介导的基因编辑流程(图3-a):首先,构建过表达recT的重组质粒pEC-Phom-recT。构建切割质粒pXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNA[12];然后,制备含有RecT的菌株感受态细胞,将切割质粒和ssDNA同时电转至上述感受态,涂布含有氯霉素和奇霉素BHI固体培养基,32 ℃过夜培养;再次,随机挑选平板中的菌株基因测序;最后,消除质粒(进行连续基因操作时,质粒pEC-Phom-recT可以保留)。基因编辑周期为N+3 d(N为RecT感受态细胞制备的时间);无RecT介导的基因编辑流程(图3-b):操作基本同上,只是该流程省略了RecT感受态细胞的制备过程。
P-携带Cpf1和crRNA的载体;SpeR-奇霉素抗性基因;CmR-氯霉素抗性基因;
a-RecT介导的CRISPR-Cpf/ss DNA系统;b-无RecT介导的CRISPR-Cpf1/SS DNA系统
图3 CRISPR-Cpf1/ssDNA系统基因编辑流程图
Fig.3 A flow-chart for CRISPR-Cpf1/ssDNA gene editing
CRISPR-Cpf1系统由一段向导RNA引导,识别靶基因位点的PAM(protospacer adjacent motif),再与核酸内切酶蛋白结合实现特定DNA靶向切割[17],即Cpf1-crRNA复合物可以结合靶DNA产生双链断裂(double-strand break,DSB)[18-19]。DSB是一种功能强大的反选择标记,它可以提供一种选择压力用于供体DNA模板修复,保证较高的基因编辑效率[20-22]。由于CRISPR-Cpf1系统诱导的DSB对C.glutamicum具有致死性,因此crRNA的靶向切割效率通过菌株细胞的存活转化子数量(colony forming units,c.f.u.)来反映[23-25]。低靶向效率的crRNA在基因组编辑过程中会导致很高的假阳性率,导致群体中许多野生型细胞存活。因此,建立CRISPR基因编辑系统时,首先要构建切割质粒,并验证其是否具有良好的切割作用。一个单一成熟的crRNA包含一段20 bp保守序列和一段24 bp的靶向序列。本研究将Cpf1和crRNA同时置于切割质粒上,当crRNA中富含胸腺嘧啶的。crRNA-cassette包含启动子Pj23119、靶基因位点的crRNA和终止子rrnb。
为了选择更好的方式表达Cpf1,提高基因组切割效率,比较了启动子Ptuf和PlacM对切割效率的影响,靶位点设计在单链模式菌M-1的突变位点,分别构建切割质粒pXMJ19-PlacM-Cpf1-Pj23119-crRNADL和pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNADL。将切割质粒和对照质粒pXMJ19-Cpf1分别电转至菌株M-1的感受态细胞,涂布固体BHI培养基(氯霉素),统计平板中漏切的转化子数量。
如图4所示,当没有crRNA时,对照组Ptuf和PlacM存活细胞数(个)分别约为3.35×103和3.72×103,说明对照质粒pXMJ19-Cpf1并不起切割作用。然而,切割质粒的转化子数量明显少于对照组,说明切割质粒发挥了良好的切割致死作用;当crRNA存在时,Ptuf和PlacM组存活细胞数分别大幅下降,Ptuf组漏切的转化子数量明显少于PlacM组,说明Ptuf启动子更加有助于Cpf1的表达,切割质粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNA切割效果更好,若采用启动子Ptuf更加有助于提升基因编辑效率。
图4 CRISPR-Cpf1系统切割作用
Fig.4 Cutting effect of CRISPR-Cpf1 system
由于DSB对大多数缺乏非同源末端连接(NHEJ)机制的细菌是致命的[26],因此,为了提高经DNA双链断裂后被修复的菌株存活率,需要一个外来修复模板刺激DNA修复通路,对断裂的靶位点进行同源定向修复。
2.4.1 RecT对ssDNA基因重组的影响
谷氨酸棒状杆菌自身的同源重组能力较低,通常需要借助重组酶提高其重组能力。在RecET重组系统中,RecT是DNA退火蛋白和单链结合蛋白[27]。因此,本研究尝试用RecT提高CRISPR-Cpf1/ssDNA系统的重组作用。将前导链和滞后链分别电转至两种单链模式菌M-1的感受态细胞(-RecT或+RecT),涂布含有卡那霉素的BHI固体培养基,统计转化子数量。
如图5所示,首先,滞后链的转化子数量高于前导链,说明滞后链的重组作用优于前导链;其次,当菌株表达RecT时,被成功修复且具有KanR的转化子数量高于-RecT组,并且滞后链+RecT组的重组作用比-RecT组提高了25%。由此可见,RecT可对单链重组起到促进作用。
图5 RecT对单链重组的影响
Fig.5 Effect of RecT on ssDNA recombination
2.4.2 优化ssDNA长度
当发生DSB双链断裂时,可通过同源重组作用将断裂位点修复,且通过增加同源臂长度提高同源重组效率,从而提高细胞存活率。有相关研究采用了长度为59 bp的ssDNA进行了基因编辑[12]。为了更加系统的研究单链长度对重组作用的影响,本文参考上述报道中所使用的单链长度,同时考虑到引物合成成本的因素,将长度范围为30~70 bp的ssDNA(滞后链,DLK+)和切割质粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-Pj23119-crRNADL电转至菌株M-1的感受态细胞(+RecT),涂布含有卡那霉素的BHI平板,统计平板中转化子数量。实验结果如图6所示,被正确编辑的且具有KanR的转化子数量随着ssDNA长度的增加而增加。当ssDNA长度达到70 bp时,ssDNA重组作用最佳。
图6 单链ssDNA长度对基因重组的影响
Fig.6 Effect of ssDNA length on gene recombination
2.4.3 优化ssDNA添加量
当ssDNA被转化进入菌株细胞后,大部分会被细胞自身降解,只有很小一部分ssDNA会发挥重组作用。有相关研究采用了10 μg的ssDNA进行了基因编辑[12]。为了深入研究单链添加量对重组作用的影响,获得最佳添加量,本文参考上述报道中所使用的添加量,同时考虑到引物合成成本的因素,将添加量为2.5~12.5 μg的ssDNA(滞后链,DLK+,70 bp)和切割质粒同时电转至菌株M-1的感受态细胞(+RecT),涂布含有卡那霉素的BHI平板,统计平板中转化子数量。实验结果如图7所示,转化子数量随着ssDNA浓度的增加而增加,当添加量达到12.5 μg时,被正确修复且具有KanR的菌落数达到最高值。说明合理增加ssDNA浓度会促进ssDNA重组作用。
图7 单链ssDNA添加量对基因重组的影响
Fig.7 Effect of ssDNA addition on gene recombination
为了统计RecT介导的ssDNA基因编辑效率,按照2.2节所示的基因编辑流程方法将ssDNA(滞后链DLK+、添加量12.5 μg、长度70 bp)和切割质粒pXMJ19-Ptuf-Cpf1-crRNADL同时电转至单链模式菌M-1的感受态细胞(-RecT/+RecT),涂布含有氯霉素的BHI固体培养基,再对点卡那霉素BHI固体培养基,统计ssDNA基因编辑效率,计算公式如下所示,
基因编辑效率
(1)
如图8所示,当无RecT时,ssDNA编辑效率分别为(15%±2.4)%(按照公式(1)计算3组平行试验的转化子数之比:6/50、8/52、10/60);当有RecT时,编辑效率分别为(80±5.7)%(19/22、18/24、20/25),是无RecT时的5.3倍。由此可见,优化后的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因编辑系统,在Ptuf切割质粒和重组酶RecT的双重作用下,提高了突变菌株的筛选效率。
图8 RecT介导的CRISPR-Cpf1/ssDNA系统基因编辑效率
Fig.8 Gene editing efficiency of RecT-CRISPR-Cpf1/ssDNA system
本研究建立了RecT介导的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因编辑系统,对切割和重组两方面进行了深入研究,通过利用启动子Ptuf优化了切割效率以及对比不同ssDNA长度和添加量优化了重组效率。确定的最佳基因编辑方案为:ssDNA(滞后链)的添加量为12.5 μg,ssDNA的长度为70 bp。优化后的基因编辑效率为(80±5.7)%,可有效地对基因靶点进行编辑修复。可进一步尝试研究该系统的多基因定点编辑,使其在C. glutamicum基因组代谢工程改造中发挥更大的应用价值与潜力。
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