桑椹果酒是以桑椹汁为原料经酵母发酵而成的一种低酒精度饮料[1]，不仅含有丰富的花青素、有机酸和类黄酮等营养物质，还具有补肝益肾、强身补血、抗衰老、抗氧化、降糖降脂等药理作用[2-5]，被称为果酒中的极品。桑椹果酒中含有多种风味物质，其中含量较为丰富的是其发酵副产物——高级醇。高级醇是具有3个及3个以上碳原子一元醇的总称，在桑椹果酒中主要发挥呈香呈味的作用，对桑椹果酒的香气与味道有重要的影响[6-7]。但高级醇含量过高则会使人的神经系统充血，引发头疼，并且高级醇的毒性会因其含量的升高而增大[7-8]。因此，控制好桑椹果酒中高级醇的含量对提高桑椹果酒的品质具有重要意义。
目前，桑椹果酒高级醇研究主要集中在低产高级醇桑椹果酒专用酵母的选育、优化桑椹果酒低产高级醇的发酵条件和桑椹自身的果渣含量对桑椹果酒中高级醇含量的影响等方面，如孙时光等[1]从桑椹自然发酵醪中筛选出了可以取代葡萄酒酵母的低产高级醇桑椹果酒专用酵母；罗惠波等[9]通过响应面法优化了桑椹果酒的发酵工艺，降低了桑椹果酒中高级醇的含量；周青等[10]探究了不同果渣添加量对桑椹果酒中高级醇浓度的影响，确定了果渣的最佳添加量。但以外源添加物来控制桑椹果酒高级醇含量却鲜有报道，本次实验拟向桑椹汁和处于发酵期的桑椹果酒中添加酶制剂(果胶酶、糖化酶、纤维素酶)、金属离子(Mg2+、Ca2+、K+)和可同化氮源(谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、磷酸氢二胺)，分析其对桑椹果酒高级醇含量的影响，并通过响应面法得到最优的复配比，以期为控制桑椹果酒高级醇含量提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
S-2桑椹果酒专用酵母(本实验室选育)[1]；桑椹(品种为无籽大十)，自贡市场；白砂糖，市售一级白砂糖；果胶酶、糖化酶、纤维素酶、MgCl2(分析纯)、NaCl(分析纯)、KCl(分析纯)、(NH4)2HPO4(分析纯)、L-谷氨酸(生化试剂)、L-精氨酸(生化试剂)、L-丙氨酸(生化试剂)，上海源叶生物科技有限公司；正丙醇(分析纯)、异丁醇(分析纯)、异戊醇(分析纯)、乙酸丁酯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 6890N-5975B气相色谱仪，美国Agilent公司；T6新世纪紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；GZ-250-HSⅡ恒温恒湿培养箱，韶关广智科技设备公司；HWS-122电热恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；YXQ-LS-75SII立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桑椹果酒发酵流程[1, 4,11]
操作要点：A：焦亚硫酸钾加入量以桑椹汁中SO2的终浓度达到50 mg/L为准；B：加白砂糖调整糖度至21 Brix。C：接种酵母为预先活化的菌种，接种量为质量分数5%，在25 ℃发酵7 d。
1.3.2 酶制剂添加时间对桑椹果酒高级醇含量的影响
以0.2 g/L的添加量[12]将果胶酶、糖化酶和纤维素酶分别在桑椹果酒发酵0、1、2、3、4、5、6 d的时候加入到发酵液中，并在第7天发酵完成后检测桑椹果酒中高级醇含量，选出酶制剂的最佳添加时间
1.3.3 酶制剂、金属离子和可同化氮源的添加量对桑椹果酒高级醇含量的影响
酶制剂添加量：按照酶制剂的最佳添加时间，在桑椹果酒发酵过程中分别添加0.025、0.05、0.1、0.2、0.3 g/L的果胶酶、糖化酶、纤维素酶，在发酵完成后检测桑椹果酒高级醇含量，探究酶制剂添加量对桑椹果酒酒精度、总酸和高级醇的影响。
金属离子添加量[13-14]：在1.3.1的成分调整阶段分别添加10、20、30、40、50 mg/L的MgCl2、CaCl2、KCl，在发酵完成后检测桑椹果酒高级醇含量，探究金属离子添加量对桑椹果酒酒精度、总酸和高级醇的影响。
可同化氮源添加量[8,13, 15]：在1.3.1的成分调整阶段分别添加20、40、60、80、100 mg/L的谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、(NH4)2HPO4，在发酵完成后检测桑椹果酒中高级醇含量，探究可同化氮源添加量对桑椹果酒酒精度、总酸和高级醇的影响。
1.3.4 采用响应面法优化外源添加物的种类和含量
在1.3.3实验结果的基础上，采用Box-Behnken响应面设计法[16]，以桑椹果酒高级醇含量为响应值，选择对桑椹果酒高级醇含量影响较强的3个外源添加物进行三因素三水平的响应面实验，以获得最佳降醇效果。
1.3.5 理化分析
乙醇体积分数的测定：采用分光光度计法[17]；总酸含量的测定：参照GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法[18]。
1.3.6 气相色谱法测定高级醇
色谱条件：毛细管柱J&W 122-7062DB-WAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度230 ℃，起始温度45 ℃，保留2 min，以4 ℃/min升至120 ℃，保留2 min，以10 ℃/min升至230 ℃，保留3 min；载气He，检测器温度230 ℃，恒流1.0 mL/min；进样量1 μL。
样品处理：取内标液(乙酸正丁酯)100 μL置于10 mL容量瓶中，用待测酒样定容，然后用孔径0.22 μm的滤膜过滤。取1 mL样液加入到自动进样瓶中，上机，进行气相分析[19]。
1.4 数据处理
应用Origin 9.0软件[20]对实验中的柱状图进行绘制；应用SPSS 22软件[21]对实验数据进行相关性和显著性分析；应用Design expert 8.0软件[22]进行Box-Behnken响应面设计。每组实验设3次平行。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中不同酶制剂对高级醇含量的影响
桑椹果酒中的高级醇一般是由蛋白质与糖类物质的代谢产物转化而成[23]，酶在其形成过程中起到关键性作用。本实验从桑椹果酒发酵0 d开始直到发酵结束，每天依次向正在发酵的发酵液中加入酶制剂，探究不同酶制剂的添加时间对桑椹果酒高级醇含量的影响，结果见图1～3。
图1 糖化酶添加时间对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.1 Effect of adding time of saccharification enzyme on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
注：小写英文字母、大写英文字母和小写希腊字母分别表示总高级醇含量、酒精度和总酸的差异显著性；相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
图2 果胶酶添加时间对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.2 Effect of adding time of pectinase on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
图3 纤维素酶添加时间对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.3 Effect of adding time of cellulase on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
由图1～3可以看出，不同时间添加的糖化酶，果胶酶和纤维素酶对桑椹果酒的总酸含量并无显著影响，对酒精度虽有影响但酒精度均处于11% vol以上，属于正常范围。而酶制剂的不同添加时间对桑椹果酒高级醇含量产生了较大影响，在桑椹果酒发酵第1天后加入的3种酶制剂，均能显著降低桑椹果酒高级醇的含量，阻碍高级醇的形成。故而选择发酵第1天作为3种酶制剂的最佳添加时间。
2.2 酶制剂、金属离子和可同化氮源的添加量对桑椹果酒高级醇含量的影响
2.2.1 酶制剂添加量对桑椹果酒高级醇含量的影响
酶制剂不但可以提高桑椹果酒的出汁率，加速桑椹果酒澄清，提高桑椹果酒发酵速率，而且可以在桑椹果酒发酵过程中控制高级醇的生成量，如糖化酶和纤维素酶可以提高桑椹果酒中被酵母直接利用的葡萄糖浓度，加速对糖分的代谢，减少对氨基酸的降解代谢，从而降低高级醇的生成量[24-25]；果胶酶不仅可以促进桑椹果酒澄清，还能控制高级醇的生成[26]。本次实验探究了不同酶制剂的含量对桑椹果酒高级醇的影响。
由图4可知，糖化酶添加量对总酸含量无显著影响，酒精度随着糖化酶添加量的增加而显著升高，高级醇含量随着糖化酶添加量的不断增加呈现先下降后回升的趋势，且糖化酶添加量为0.2 g/L时桑椹果酒高级醇含量最低，为310.53 mg/L，与未添加糖化酶相比高级醇降低了5.95%。这是因为糖化酶可以将淀粉转化为酵母可以直接利用的葡萄糖，使酵母对糖分进行代谢从而减少对氨基酸的分解代谢，从而升高酒精度，降低高级醇含量。然而随着糖化酶添加量的不断增加，酵母可利用的糖分超过一定浓度后会通过糖合成代谢途径合成异丁醇等高级醇，使总高级醇含量上升。
图4 糖化酶添加量对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.4 Effect of adding amount of saccharifying enzyme on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
由图5可知，果胶酶添加量对桑椹果酒的酒精度与总酸含量无显著影响，但添加果胶酶可以降低桑椹果酒高级醇含量，且呈现先上升后下降的趋势。当添加量为0.05～0.2 g/L时可以有效降低桑椹果酒高级醇的含量，高级醇含量最低为303.55 mg/L，与未添加果胶酶相比，高级醇降低了6.74%，这可能是由于适量的果胶酶可以促进桑椹中糖浸提，促进酵母对糖的利用，减少氨基酸的降解，从而阻碍高级醇生成。然而果胶酶超过一定量会造成桑椹果酒中蛋白质含量增加，在发酵后期转化为氨基酸，通过氨基酸降解途径生成高级醇，使高级醇含量增加。
图5 果胶酶添加量对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.5 Effect of adding amount of pectinase on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
由图6可知，纤维素酶添加量对桑椹果酒的酒精度与总酸含量无显著影响。当纤维素酶添加量为0.2 g/L时降低桑椹果酒高级醇效果最佳，为296.14 mg/L，与未添加纤维素酶的对照组相比，高级醇含量降低了9.01%。纤维素酶降低桑椹果酒高级醇的机理与糖化酶类似，都是通过增加酵母可利用的糖浓度和减少氨基酸的降解代谢。且与糖化酶与果胶酶相比，纤维素酶对于桑椹果酒高级醇的抑制效果最好。
图6 纤维素酶添加量对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.6 Effect of adding amount of cellulase on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
2.2.2 金属离子添加量对桑椹果酒高级醇含量的影响
金属离子在桑椹果酒发酵过程中可以起到促进氧化、酯化、水解等作用，一定量的金属离子可以提升桑椹果酒的品质。不同的金属离子对桑椹果酒的作用也不同，如Mg2+是糖酵解途径重要的辅助因子，是微生物体内多种酶的激活剂[27]；K+可以维持细胞内外渗透压[28]；Ca2+对保护细胞膜结构和功能完整，稳定细胞壁结构，调节酶的活性等方面有着重要作用[29]。
图7 Mg2+添加量对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.7 Effect of adding amount of Mg2+on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
由图7可知，随着Mg2+含量的增加，总酸含量呈现缓慢上升的趋势，高级醇含量呈现先下降后上升的趋势，而酒精度呈现了先升高再降低的趋势。这说明较低的Mg2+浓度对桑椹果酒中酒精的生成有一定的促进作用，但却阻碍了高级醇的生成，当Mg2+浓度为20 mg/L时高级醇含量最低，为292.37 mg/L，与对照组相比高级醇降低了10.17%，随着Mg2+浓度的上升，高级醇含量也会增加，这可能是由于适量浓度的Mg2+能激活糖酵解途径相关酶活性，促进酵母代谢的正常进行，而过量的Mg2+会抑制酵母生长，不利于正常发酵，导致发酵副产物含量升高。
由图8可知，随着K+含量的增加，总酸含量呈现缓慢上升的趋势，高级醇含量呈现先下降后上升的趋势，而酒精度呈现了先升高再降低的趋势，这与Mg2+对3种指标的影响相似。当K+添加量在20 mg/L时高级醇含量最低，为297.3 mg/L，与对照组相比高级醇降低了8.66%，可见较低浓度的K+可以维持酵母细胞内外的渗透压，保证桑椹果酒正常发酵，而过高的K+浓度会导致细胞渗透压失衡，影响酵母正常的生长繁殖，从而使高级醇含量升高。
图8 K+添加量对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.8 Effect of adding amount of K+ on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
由图9可知，Ca2+添加量对桑椹果酒酒精度与总酸含量的影响较小，对高级醇含量的影响较为显著，当Ca2+添加量在40 mg/L时高级醇含量最低，为311.09 mg/L，与对照组相比高级醇降低了4.42%，但与其他2种金属离子相比，其对桑椹果酒高级醇的降低效果并不明显。原因可能是Ca2+可以改变高级醇代谢途径中相关酶活性，使高级醇的生成量降低，但效果不如其他2种金属离子。
图9 Ca2+添加量对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.9 Effect of adding amount of Ca2+on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
2.2.3 可同化氮源添加量对桑椹果酒高级醇含量的影响
高级醇通过2种途径合成，其中一种为埃里希[30]途径，主要是氨基酸在转氨、脱羧、还原作用下形成相应的高级醇[31]。李智慧等[32]研究表明,可同化氮源对桑椹果酒高级醇含量有重要的影响，故而本次实验通过添加(NH4)2HPO4、谷氨酸、丙氨酸和精氨酸等可同化氮源，探究其对桑椹果酒高级醇含量的影响。
由图10～13可知，可同化氮源的添加量对桑椹果酒酒精度的影响不显著，对总酸含量有影响但总酸含量处于正常水平，本次实验重点研究高级醇含量，故主要讨论可同化氮源对高级醇含量的影响。
图10 (NH4)2HPO4添加量对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.10 Effect of adding amount of diammonium hydrogen phosphate on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
添加谷氨酸对桑椹果酒高级醇含量并无显著影响(图11)；添加磷酸二氢铵和丙氨酸对桑椹果酒高级醇含量有显著性降低，但其添加量之间并无显著性差异(图10、图13)，高级醇含量与对照组相比分别降低了7.46%和6.73%；精氨酸添加量为40 mg/L,对桑椹果酒高级醇含量有显著性降低，且与对照组相比降低了6.33%。其原因可能是高级醇可以通过氨基酸分解途径合成，有些特定氨基酸(如天冬氨酸、亮氨酸)可以直接分解成为相应的高级醇，而上述4种可同化氮源不能直接生成高级醇，且在发酵过程中会影响酵母对其他氨基酸的分解作用，从而阻碍高级醇的生成。此结果与李智慧等[30]研究不同种类可同化氮素对黄酒高级醇含量影响的结果一致。
图11 谷氨酸添加量对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.11 Effect of adding amount of glutamic acid on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
图12 精氨酸添加量对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.12 Effect of adding amount of arginine on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
图13 丙氨酸添加量对桑椹果酒高级醇含量、酒精度与总酸含量的影响
Fig.13 Effect of adding amount of alanine on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine
2.2 酶制剂、金属离子和可同化氮源的添加量对桑椹果酒高级醇含量的影响
选取对降低桑椹果酒高级醇效果最好的纤维素酶、KCl、MgCl2及各自最优添加量区间，进行三因素三水平的响应面实验。响应面实验结果如表1所示，用Design expert 8.0软件对响应面结果进行分析，得到回归模型方差分析见表2。
表1 响应面实验设计及结果
Table 1 Experimental design and results for response surface analysis
试验编号纤维素酶添加量(A)/(g·L-1)KCl添加量(B)/(mg·L-1)MgCl2添加量(C)/(mg·L-1)总高级醇含量/(mg·L-1)10.42010303.6420.22020285.846302030303.1440.43020308.2450.22020284.04660.21010292.9870.22020286.847803020303.5490.42030308.271001020303.67110.23010294.19120.21030295.37130.22020287.047140.22020289.5471502010308.04160.23030293.07170.41020308.24
表2 回归模型方差分析
Table 2 Analysis of variance of regression model
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型1 234.499137.1737.59<0.000 1∗∗X112.5112.53.430.106 6X20.1910.190.0510.827 8X30.1310.130.0340.858 4X1X24.23E-0314.23E-031.16E-030.973 8X1X322.71122.716.220.041 3∗X2X33.0813.080.840.388 8X211 019.8111 019.81279.48<0.000 1∗∗X2257.42157.4215.740.005 4∗∗X2352.85152.8514.480.006 7∗∗残差25.5473.65失拟9.5333.180.557 9不显著误差16.0144总和1 260.0316R2=0.979 7R2adj=0.953 7
注： *(P<0.05)表示差异显著； **(P<0.01)表示差异极显著
软件分析结果得到二次多项式回归方程为：
由表2可知，该二次回归模型P<0.000 1，表示该模型为极显著。模型中失拟项P=0.115 5>0.05，差异不显著，表示模型预测值与实际值相差较小[22]。通过分析模型中各个系数的P值可知，
项的差异显著(P<0.05)，说明纤维素酶、KCl、MgCl2的二次项及纤维素酶和MgCl2的交互作用对降低桑椹果酒高级醇含量有显著性影响。该模型相关系数R2=0.979 7，表示预测值与实测值之间具有很高的相关性；调整系数
表明该模型的拟合度良好，可以描述外源添加物对桑椹果酒高级醇含量的影响，能较好地优化方案[22,33]。
由图14可知，纤维素酶和MgCl2对桑椹果酒高级醇的影响并非简单的线性关系，而是具有交互作用。由Design expert 8.0软件分析得到有效降低桑椹果酒高级醇的外源添加物最佳配比为纤维素酶0.2 g/L、KCl 20.02 mg/L、MgCl2 20.17 mg/L，此时桑椹果酒高级醇含量理论值为286.64 mg/L。按此条件进行验证实验，得出桑椹果酒高级醇含量为282.34 mg/L，与理论值的相对误差为1.5%，说明此模型可以较好地模拟和预测外源添加物对桑椹果酒高级醇含量的影响。通过对此次实验的桑椹果酒进行理化分析和感官品评可知，此桑椹果酒酒精度为12.49±0.36% vol、还原糖为3±0.19 g/L、总酸含量为6.64±0.37 g/L，且颜色为紫红色、光泽感强、果香适中、酒香馥郁、酒体丰满、柔和爽口、风味明显、典型良好，是一款品质优良且高级醇较低的桑椹果酒。
a-纤维素酶和MgCl2交互作用对桑椹果酒高级醇含量影响的响应面图；b-纤维素酶和MgCl2交互作用对桑椹果酒高级醇含量影响的等高线图
图14 纤维素酶和MgCl2交互作用对桑椹果酒高级醇含量影响的等高线和响应面图
Fig.14 Contour and response surface of the effect of the interaction between cellulase and MgCl2 on the content of higher alcohols in mulberry wine
3 结论
在桑椹果酒发酵1 d后加入酶制剂能显著降低桑椹果酒高级醇含量，且酶制剂(糖化酶、果胶酶、纤维素酶)、金属离子(Mg2+、Ca2+、K+)、可同化氮源(精氨酸、丙氨酸、(NH4)2HPO4)在一定添加量范围内均能显著性降低桑椹果酒高级醇含量，谷氨酸对桑椹果酒高级醇的影响不大。对外源添加物的降醇效果进行对比可知，纤维素酶、Mg2+和K+降低桑椹果酒高级醇的效果最佳，对其进行响应面实验，得到最优复配比为纤维素酶0.2 g/L、KCl 20.02 mg/L、MgCl2 20.17 mg/L，优化后的桑椹果酒高级醇含量可降低到282.34 mg/L，高级醇的降低率为13.26%。并且对响应面结果分析可知，纤维素酶和MgCl2对桑椹果酒高级醇的影响具有交互作用，两者配合使用可以显著降低桑椹果酒高级醇含量。
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