唾液酸(sialic acid，SA)是指一系列含9个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的统称，目前为止已发现其有40多种衍生物[1-3]。唾液酸结构特征在于5号碳上的氨基以及 1号碳上的羧基给唾液酸分子授予了1个负电荷使得唾液酸表现为酸性，其主要存在形式为氨基被乙酰化的N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid(Neu5AC)，多用于修饰神经细胞黏附分子。它对生物神经细胞连接、调节细胞聚合以及细胞运动起着重要的作用[4-5]，同时Neu5AC还参与了人体内特异性生物功能的调节，包括细胞识别，细胞黏附，细胞信号传导和免疫功能调节等。它在抑制唾液酸转移酶和抗癌转移、促进神经细胞增长与抗老年痴呆症、抑制唾液酸酶与抗病毒、抑制白细胞黏附与抗炎等方面具有很大作用[6]。因此近年来，关于Neu5AC的研究受到极大的关注[7-12]。
常用的测定糖类的方法包括分光光度法、气相色谱(GC)法和高效液相色谱(HPLC)法。分光光度法的主要缺点是选择性差，难以区分与唾液酸相似结构的杂质干扰[13]。GC是一种较灵敏的分析方法，但样本需要衍生化，耗时费力[14]。HPLC方法也广泛用于分离确定唾液酸[15]，但唾液酸属于糖类化合物且没有发色基团，所以采用HPLC分析需要对唾液酸进行衍生后测定，因而增加了实验的复杂性和可能的干扰因素[16]。已有研究报道采用超高效液相色谱—串联四级杆质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry，UHPLC-MS-MS)测定唾液酸[17]，但是串联四级杆检测器存在碎片离子分辨率低、定性能力弱等缺点。串联四级杆飞行时间质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF-MS)是一种高分辨质谱，通过UHPLC超高的分离能力结合QTOF-MS高分辨率、高灵敏度等特点，利用保留时间、一级质谱及二级碎片的准确质量数、离子丰度和标准品等能同时对化合物进行准确定性、定量分析[18-19]。
母乳中尤其是初乳唾液酸水平和婴儿早期智能发育密切相关，提高唾液酸摄人量有益于婴儿早期发育。国内外配方奶粉已将Neu5AC作为奶粉营养强化的一个重要参数，使其更接近母乳的自然标准。因此，需要寻找一种简单、可靠方法来测定母乳中Neu5AC含量，为配方奶粉的生产提供参考。目前国内外，还未见应用UHPLC-QTOF-MS方法测定奶粉中Neu5AC的相关报道。本文采用UHPLC-QTOF-MS对奶粉中Neu5AC进行测定，为配方奶粉工艺优化、标准提升等提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
奶粉样品，本地超市；三氯乙酸(分析纯)，成都市科隆化学品有限公司；N-乙酰神经氨酸标品(纯度：99.49%)，Sigma公司；乙腈(色谱纯级)，Sigma公司；乙酸铵(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸(分析纯)，成都市科隆化学品有限公司。
1.2 主要仪器与设备
超高效液相色谱仪，日本岛津仪器有限公司；X500飞行时间质谱，美国SCIEX公司；BT-25S分析天平，成都世纪方舟科技有限公司；SB-5200DTN超声清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；VORYEX 3涡旋混匀器，德国IKA公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司。
1.3 实验方法
1.3.1 Neu5AC储备液的制备
精确称量Neu5AC标准品1.00 mg，用V(甲醇)∶V(水)=1∶1配制成1 mg/mL标准对照品储备液，于-20 ℃下储备备用。
1.3.2 Neu5AC工作液的制备
准确移取适量标准储备液，用体积分数50%甲醇逐级稀释为质量浓度50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 μg/mL系列Neu5AC标准溶液，于4 ℃下储存备用。
1.3.3 样品制备
精确称取2.0 g奶粉样品于15 mL离心管中，加入5 mL 5%三氯乙酸溶液，旋涡振荡，超声波处理5 min，加入体积分数0.1%盐酸溶液5 mL，旋涡混匀转移至50 mL容量瓶中 80 ℃水浴加热水解2 h，水解完成后冰浴冷却到室温，15 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液于1.5 mL离心管中，于真空旋转浓缩至干，加入1 mL 50%(体积分数)甲醇复溶，过0.22 μm有机滤膜，上机待测。
1.3.4 色谱分析条件
色谱柱：采用C18色谱柱(1.9 μm粒径，2.1 mm×100 mm)；色谱柱温度：40 ℃；流动相A为甲醇，流动相B为体积分数0.01%乙酸铵-水溶液；进样量：5 μL，流速0.25 mL/min，梯度洗脱程序如下：0～2 min，20%A；2～4 min，50%A；4～5 min，50%A； 5～6 min，20%A。
1.3.5 质谱分析条件
离子源：电喷雾离子源(electron spray ionization，ESI)，负离子模式；扫描方式：多重反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)；气帘气(curtain gas，CUR)35 psi，离子化压力(ionization pressure，IS)4 500 V，温度300 ℃，喷雾气(spray gas，GS1)45 psi，辅助加热气(auxiliary heating gas，GS2)55 psi，去簇电压(de-clustered voltage，DP)60 V，碰撞能量(collision energy，CE)10 V，质量扫描范围m/z 100～500。
1.3.6 数据处理
绘图以及统计分析均采用Origin 9.6软件进行处理分析。
1.3.7 方法学验证
检出限、定量限和精密度的测定：将质量浓度为1.56 μg/mL的标准溶液逐级稀释，计算检出限(S/N=3)与定量限(S/N=10)[20]。
回收率的测定：在已知Neu5AC含量的老年奶粉样品中分别添加低(0.5 μg/mL)、中(5 μg/mL)、高(50 μg/mL)3个浓度Neu5AC标品溶液，放置2 h，按照已优化的样品处理方法进行前处理[21]，加标样品平行测定6次。
基质效应：采用样品提取溶液直接溶解Neu5AC标准品，然后用样品提取溶液对其进行连续梯度稀释，进样检测，得到基质校准曲线，以相同物质在基质溶液中标准曲线斜率与纯溶剂中标准曲线斜率来评价基质效应。
2 结果与讨论
2.1 Neu5AC的裂解机制及定性、定量离子对选择
以往对Neu5AC在Q-TOF中的裂解机制研究尚不完善，所以本实验选择Neu5AC标准溶液(25 μg/mL)分别在ESI-和ESI+条件下对母离子进行全扫描，结果表明Neu5AC在ESI-条件下其母离子丰度高于ESI+，与前人研究一致[22]。表1为Neu5AC母离子及其定性、定量离子高分辨质谱信息，由表1得，采用Q-TOF方法检测Neu5AC时，其理论值与实验值误差较小，表明该方法对Neu5AC定性精确度较高。由图1可知，Neu5AC在进入质谱过后，由于失去1个水分子得到m/z 290的分子，m/z 290可能发生逆狄尔斯-阿尔德反应(retro-Diels-Alder reaction，RDA)，裂解成为m/z 170和m/z 119 两个分子，另外，Neu5AC在质谱分析中，还可能发生α断裂，经过电荷转移，发生重排，形成m/z 220和m/z 87 两个互补离子。其中，m/z 87的碎片离子在质谱中响应最高，m/z 170次之，所以选择m/z 87的离子作为Neu5AC的定量离子，m/z 170作为辅助定性离子。
表1 Neu5AC母离子与定性、定量离子质谱信息
Table 1 Neu5AC parent ion and qualitative and quantitative ion mass spectrometry information
名称分子式离子模式m/z理论值实验值误差(10-4)定性、定量离子Neu5ACC11H19NO9[M-H]-308.098 7308.070 70.90m/z 170、m/z 87
图1 奶粉中Neu5AC的二级质谱图及裂解机制
Fig.1 Neu5AC secondary mass spectrum in the sample
2.2 提取溶剂的选择
研究表明，在80 ℃条件下用0.1%(体积分数)HCl溶液水解1 h能够使所有的唾液酸链断裂并使这些残基脱酰、脱羧化、能保证唾液酸的完全水解[23]。此外，样品在不同比例溶剂中其定量峰面积存在差异[24]。因而，本实验采用标准溶液(1.56 μg/mL)为研究对象，考察不同浓度甲醇-水溶液作为溶剂时，对Neu5AC定量离子峰面积的影响，确定最佳的溶剂。图2为不同比例甲醇作为复溶溶剂时对定量离子响应强度的影响。
图2 不同甲醇浓度对定量离子峰面积影响
Fig.2 Effect of different methanol concentration on quantitative ion peak area
由图2可知，随着甲醇比例的增加，峰面积呈现先增加后减小的趋势，当50%(体积分数)甲醇作为溶剂时，Neu5AC的定量峰离子峰面积最高，因此选择50%(体积分数)甲醇-水溶液作为样品复溶时最佳溶剂。
2.3 方法学验证
2.3.1 线性关系考察
将质量浓度为1.56、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL的系列标准溶液按照优化的液相、质谱条件上机进行分析，得到Neu5AC的线性回归方程为y=12 078.257x-14 476.865，R2=0.999。结果表明，质量浓度在1.56～50 μg/mL，Neu5AC线性良好。
2.3.2 回收率、重复性、检出限与定量限
由表2可知，本方法的平均回收率在86.79%～93.64%，平均回收率的RSD在3.78%～6.42%，表明用该方法测定Neu5AC准确可行，分析得到Neu5AC的定量限为0.30 μg/mL，检出限为0.05 μg/mL，表明该方法具有较好的重复性和较高的灵敏度。
表2 回收率、重复性检出限及定量限(n=6)
Table 2 Recovery rate, repeatability detection limit and limit of quantitation
原有量/(μg·mL-1)添加量/(μg·mL-1)平均回收率/%精密度/%检出限/(μg·g-1)定量限/(μg·g-1)3.213.1256.2512.589.1593.6486.796.336.423.780.050.30
2.3.3 基质效应
基质效应是指样品中目标物以外的组分，与目标物共同洗脱出的样品基质对目标物的离子化过程产生影响[25]。根据研究表明[26-27]，当|基质效应|<20%,可认为基质对目标化合物响应值影响很小，可认为无基质效应；当20%≤|基质效应|<50%,被认为具有中等基质效应；当|基质效应|≥50%，被认为具有较强的基质效应。由表3可知，Neu5AC的基质效应为-14.14%，说明奶粉基质对Neu5AC的离子化具有抑制作用，又因为|基质效应|<20%，说明奶粉基质对Neu5AC的定量分析影响较小，可忽略不计。
表3 基质效应与校准曲线
Table 3 Matrix effect and calibration curve
样品基质校准曲线R2基质效应/%老年奶粉y=10 369.975x-5 761.801 30.967-14.14
2.4 样品测定
应用建立的分析方法对4种奶粉中Neu5AC进行检测，检测结果如表4所示。由表4可得，在4种奶粉中均检测出Neu5AC，但是含量差异显著，其中老年奶粉中含量最高，为3.14 mg/100 g，低脂奶粉中含量最低为2.02 mg/100 g。
表4 样品中Neu5AC含量 单位：mg/100 g
Table 4 Neu5AC content in the sample
样品Neu5AC含量/(mg·100g-1)低脂奶粉2.02±0.21全脂奶粉2.73±0.09老年奶粉3.14±0.24牦牛奶粉2.21±0.08
3 结论
本文建立了超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱测定奶粉中Neu5AC含量的检测方法，避免了复杂的衍生化过程。通过分析Neu5AC的二级质谱信息，为Neu5AC的定性、定量提供了依据。通过方法学验证，Neu5AC的加标回收率在82.83%～88.42%，检出限和定量限分别为0.05 μg/g和0.30 μg/g，基质效应为-14.14%，在1.56～50 μg/mL，Neu5AC线性良好，表明本研究建立的方法具有较好的准确性，可广泛应用于奶粉及其他奶制品Neu5AC的定性、定量分析。
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