香菇(Lentinus edodes)属于多孔菌目(Polyporales)、香菇科(Lentinaceae)[1]，是世界第二大食用菌，我国特产之一，民间素有“山珍”之称。香菇具有抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性，也具有提高免疫力等功能[2-3]。硒(Selenium，Se) 是一种保障机体持久健康的必不可少的微量元素，人体无法合成，须从外界摄取。硒能有效缓解人体内汞、镉、铊、砷等元素的毒性作用，对钼、铬、铜、硫等元素有拮抗作用，还有预防心血管疾病、抗衰老、抗病毒、抗氧化、防癌等作用，与人体健康密切相关[4-7]。实践证明，适当补硒对因缺硒引起的地方病可取得良好的改善效果[8-10]。我国国土面积的72%属于低硒或缺硒土壤，这些地区的居民硒摄入量普遍偏低，制约着中国食物硒营养状况[11]。香菇可以将无机硒转化为人体所需的有机硒，而促进人体的吸收和利用[12]。因此，通过施用外源硒把非生物活性和毒性较高的无机硒转化为毒性低、安全性高且具有活性的有机硒，是改善和满足食物链中硒水平不足的廉价且可行的方法。由此，用生物转化法生产富硒香菇成为国内外研究的热点[13]。目前对富硒香菇多糖[14-17]研究的较多，而对其蛋白质研究较少，特别是对其富硒香菇子实体蛋白质进行营养价值评价未见报道。本文以富硒香菇为材料，考察硒在香菇子实体中的分布规律，并根据氨基酸平衡理论对富硒香菇蛋白质营养价值进行评价，为富硒香菇开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验供试材料为香菇808，配方为：水分含量65%左右；干物质中木屑78%、麸皮20%、石膏2%；硒浓度分别为20、40、60、80、100 mg/kg，并以未加硒做空白对照，在辽宁省大连宝野农业发展有限公司香菇栽培基地以香菇代料栽培方式进行栽培。
1.2 试剂
亚硒酸钠：湖南奥驰生物科技有限公司；HNO3、H2O2、浓HNO3、浓H2SO4、(NH4)2SO4、浓HCl、95%乙醇、无水乙醇、NaOH、正丁醇、氯仿：天津市科密欧化学试剂有限公司
1.3 仪器与设备
GSB-090微波消解仪，美国培安有限公司；GSB-076电感耦合等离子质谱仪，Agilent；LC-E109S电磁炉，广州顺德忠臣有限公司；A11BS25粉碎机，IKA公司；T18 digital匀浆机，IKA公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;SCIENTZ-12N真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；DH-9053A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；HH-ZK4数显恒温水二列四孔智能水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司；AL204电子精密天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；H-2050R台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。
1.4 方法
1.4.1 香菇子实体硒含量测定
按照GB 5009.268—2016《食品安全国家标准食品中多无素的测定》电感耦合等离子体质谱法测定硒含量
1.4.2 香菇子实体蛋白质硒含量测定
取1g样品加100 mL的NaOH溶液(pH为10)，50 ℃水浴提取4 h，加(NH4)2SO4至95%饱和度，冰箱中静置过夜，离心后得蛋白质沉淀，沉淀加一定量的水溶解，倒入透析袋中，将其封口，再放在水中进行持续透析，48 h后取出透析袋，将透析袋中的样品进行离心，离心后取沉淀，进行冷冻干燥，干燥后为粗蛋白质，并称量质量。将干燥后的蛋白质加入到消解罐中，再加入1 mLH2O2溶液，3 mL浓HNO3溶液，微波消化后加水定容至25 mL，放置后用电感耦合等离子体质谱仪测定其硒含量。
1.4.3 香菇子实体多糖硒含量测定
取2 g样品加60 mL水，放入超声波发生器中(超声25 min，超声温度为80 ℃)，拿出放入90 ℃水浴锅1 h，过滤、浓缩、加入3倍体积95%乙醇，静置后离心，取出沉淀物加8 mL水，4 mL Sevage试剂(V(氯仿)∶V(正丁醇)=5∶1)，Sevage法去除蛋白，萃取30 min后分层，上层液体加3倍体积95%乙醇后离心，沉淀真空冷冻干燥，得粗多糖，称量质量，将干燥后的样品按1.4.2方法继续测定。
1.4.4 香菇子实体核酸硒含量测定
取2 g样品加30 mL 12% NaCl溶液，90 ℃水浴提取2 h，抽滤，滤渣重复提取1次，合并上清液，Sevage试剂(V(氯仿)∶V(正丁醇)=5∶1)去除蛋白后，用6mol/L HCl调节pH至2.5，4 ℃静置12 h，10 000转离心8 min，沉淀真空冷冻干燥后，取干燥后的样品按1.4.2方法继续测定。
1.4.5 香菇子实体有机硒含量测定
取0.5 g左右菌粉记录质量，加一定量的水溶解，倒入透析袋中，将其封口，再放在水中进行持续透析，48 h后取出透析袋，将透析袋中的样品进行离心，离心后取沉淀，进行冷冻干燥，取干燥后的样品按1.4.2方法继续测定。
1.4.6 香菇子实体氨基酸种类及含量测定
待测样品置于6 mol/L HCl于110 ℃水解24 h，用全自动氨基酸分析仪S-433D检测，由赛卡姆(北京)科学仪器有限公司完成。
氨基酸含量分析采用氨基酸比值系数(ratio coefficient of amino acid， RCAA)，氨基酸比值系数分(score of amino of amino acid， SRCAA)，化学评分(chemical score，CS)按FAO的方法[18-19]计算，氨基酸评分(amino acid score，AAS)、必需氨基酸指数(essential amino acid index，EAAI)、生物价(biological value，BV)和营养指数(nutrient index，NI)按BANO等的方法[20]进行计算。
1.4.7 数据分析处理
采用Excel 2010和SPSS 18.0软件进行数据整理及统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同添加外源硒浓度对香菇子实体硒含量的影响
由图1可以看出，随着添加外源硒浓度的增加，香菇的硒浓度有显著的提高，当添加亚硒酸钠浓度为100 mg/kg时，栽培出的香菇硒浓度可以达到225.13 mg/kg，与未富硒栽培的香菇相比含量显著增加，提高了81.16倍(P<0.05)，高于其他一些富硒食用菌，如俞涛等[21]对秀珍菇进行富硒培养，发现随着栽培料中硒处理浓度的增大，其子实体中硒含量呈线性增长，在硒浓度为100 mg/kg时子实体硒含量可达114.56 μg/g。牛林茹[22]对黄白侧耳进行富硒培养，发现在处理硒浓度为0.8 g/kg时栽培出的黄白侧耳子实体硒含量最高，达到11.43 μg/g。茆广华[23]发现当富硒浓度达到57.134 mg/kg时，灰树花子实体总硒含量最大为33.10 μg/g。李玲飞[24]研究发现当培养基中硒浓度为2.85 μg/g和5.71 μg/g时，花菇子实体硒含量可达54.5 μg/g和48.6 μg/g。
图1 香菇子实体中硒含量
Fig.1 The content of selencum in Lentinus edodes
2.2 硒在香菇中的分布规律
硒的化学形态主要分为无机态和有机态。硒在生态链中可以更有效地将无机硒转化为有机硒，有机态硒主要是硒代谢过程中产生的一些有机小分子如R-Se-R形式的氨基酸及大分子产物如含硒多肽、含硒多糖和含硒RNA等[25]。如表1所示。
表1 硒在香菇中的分布情况
Table 1 The distribution of selenium in Lentinus edodes
注：富硒香菇是在添加亚硒酸钠浓度为60 mg/kg时栽培的香菇
富硒香菇与未富硒香菇相比，总硒含量提高了111.97 mg/kg，有机硒含量提高了64.97 mg/kg，富硒栽培可极大提高香菇中总硒与有机硒含量。富硒香菇中蛋白质硒含量分别为多糖硒与核酸硒含量的19倍和20倍，蛋白硒占有机硒比率为89.95%，远高于多糖硒与核酸硒所占有机硒比率，由此可见，蛋白硒是有机硒中最主要的组成成分。因此，可以说明蛋白质是硒在香菇中最主要的有机载体。硒的功能不仅取决于硒的含量，也取决于硒的形态，固体栽培时子实体中的硒是经生物转化的有机硒化合物。
2.3 富硒栽培对香菇子实体氨基酸组成的影响
由表2可以看出，在20 mg/kg到60 mg/kg硒浓度下栽培，可以提高香菇蛋白质的含量，在硒浓度为20 mg/kg时，使富硒香菇蛋白质含量增加5.13%，在硒浓度为60 mg/kg时，富硒香菇蛋白质含量增加1.94%。当硒浓度增大到80 mg/kg和100 mg/kg时，不利于香菇蛋白质的合成，蛋白质含量下降。
本实验对不同富硒浓度的香菇氨基酸进行了测定。如表3所示，香菇中被检测出含有16 种氨基酸，其中包括除色氨酸以外的7种必需氨基酸。
表2 不同富硒浓度香菇子实体蛋白质含量比较
Table 2 Protein contents in different concentrations of selenium-enriched Lentinus edodes
注：Se20、Se40、Se60、Se80、Se100，添加亚硒酸钠浓度分别为20、40、60、80、100mg/kg；表中数据后相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，下表同。
表3 不同富硒浓度香菇子实体氨基酸含量比较
Table 3 Amino acid contents in different concentrations of selenium-enriched Lentinus edodes
注：EAA必需氨基酸(essential amino acids)；TAA氨基酸总量(amount of total amino acid)；NEAA非必需氨基酸(non-essential amino acids)。
香菇中氨基酸总含量为39.13%，其中必需氨基酸含量占总氨基酸含量的25.8%，EAA/NEAA(E/N)为0.531，低于FAO/WHO标准规定的必需氨基酸含量40%和E/N值0.6[19]。添加浓度分别为20、40、80 mg/kg的亚硒酸钠时，香菇氨基酸总量分别降低4.93%、6.01%、19.01%，当添加亚硒酸钠浓度为60、100 mg/kg时，香菇子实体内必需氨基酸含量比空白组分别升高了5.49%、3.02%。香菇中含量最高的氨基酸为谷氨酸，它能与氯化钠发生反应，生成食物鲜味物质，呈味性强，广泛用于烹饪和食品加工。除此之外，在医药、化工、农业等方面也都有着广泛的用途。
2.4 富硒香菇蛋白质营养价值的评价
2.4.1 香菇子实体蛋白质的化学评分结果
表4为香菇子实体蛋白质的化学评分计算结果。
表4 富硒栽培对香菇子实体中蛋白质化学评分的影响
Table 4 Effects of different concentrations of selenium treatment on the chemical score(CS)of protein in Lentinus edodes
香菇未富硒空白组苯丙氨酸的化学评分为53.37，添加亚硒酸钠浓度为20、40、60、100 mg/kg时香菇化学评分均升高，分别比未富硒组提高了 6.22%、0.41%、1.78%、7.74%。当添加亚硒酸钠浓度为80 mg/kg时化学评分比未富硒组降低了6.76%。
2.4.2 香菇子实体必需氨基酸指数、生物价及营养指数结果
由表5可知，添加亚硒酸钠浓度为60、100 mg/kg时必需氨基酸指数、生物价、营养指数均升高，必需氨基酸指数比未富硒组分别提高了4.59%、6.10%；生物价分别提高了5.41%、8.42%；营养指数分别提高了6.51%、5.14%。当添加亚硒酸钠浓度为20、40、80 mg/kg时，必需氨基酸指数、生物价、营养指数均降低，必需氨基酸指数比未富硒组分别降低了6.74%、8.38%、5.28%；生物价分别降低7.85%、10.65%、5.14%，营养指数分别降低了1.71%、5.93%、21.50%。
表5 富硒栽培对香菇子实体中必需氨基酸指数、生物价及营养指数的影响
Table 5 Effects of different concentrations of selenium treatment on the essential amino acid index(EAAI)、biological valence(BV)、nutritional index(NI)of protein in Lentinus edodes
2.4.3 香菇子实体氨基酸比值系数评分结果
若某种蛋白质氨基酸种类齐全，比例合理，越接近FAO/WHO氨基酸模式要求，则说明该蛋白质营养价值越高，能满足人体营养需求。按照公式分别计算不同硒富集浓度香菇的RAA、RCAA、SRCAA。根据氨基酸比值系数法计算出的RCAA值越接近1，说明该食品蛋白质氨基酸组成比例越接近FAO/WHO模式蛋白氨基酸。当RCAA>1表示该必需氨基酸相对过剩，RCAA<1则相反，说明该必需氨基酸相对不足，RCAA值最小者为该蛋白第一限制氨基酸。由表6可知，香菇的第一限制氨基酸是苯丙氨酸。现代研究认为不仅氨基酸不足影响蛋白质营养价值，氨基酸过剩同样也限制蛋白质营养价值[26]。香菇蛋白的氨基酸组成中，苏氨酸含量较高。因此，可根据蛋白质互补理论[27]将香菇蛋白作为食品强化剂，与其他蛋白互补，提高各种食品的营养价值。
如果食物蛋白质的氨基酸组成与氨基酸模式一致，则SRC为100；若SRC越大，食物蛋白质的RC越分散，表示这些氨基酸在氮基酸平衡上做的负贡献越大；若SRC越小，表示蛋自质的营养价值越差。由表6还可以看出添加亚硒酸钠浓度为20 mg/kg和100 mg/kg时，氨基酸比值系数评分有所升高，分别高于未富硒组3.3%和2.64%，与未富硒组差异均不显著(P>0.05)这说明此浓度下香菇蛋白质的氨基酸组成与模式氨基酸更接近，对氨基酸平衡所做的贡献也较大，且香菇与猪肉、牛肉[28]营养价值接近，具有较高的利用价值。
表6 富硒香菇氨基酸比值系数分比较 单位：mg/100 g
Table 6 Effects of different concentrations of Se treatment on the amino acid ratio in Lentinus edodes
3 结论
食用菌主要通过菌丝体对微量元素进行吸收[29]，与绿色植物相比，食用菌更能积累高浓度的微量元素[30]。实验表明结果，蛋白质是硒在香菇子实体中最主要的有机载体。随着添加外源硒浓度的增加，香菇的硒浓度有显著的提高(P<0.05)。香菇子实体内含有16种氨基酸，其中包括除色氨酸以外的7种必需氨基酸，香菇子实体中含量最高的为谷氨酸。添加亚硒酸钠的适宜浓度为60mg/kg，富硒栽培香菇中必需氨基酸含量、化学评分、必需氨基酸指数、生物价、营养指数分别比未富硒组提高了5.49%、1.78%、4.59%、5.41%和6.51%，说明富硒栽培可提高香菇子实体的蛋白质营养价值，并可作为富硒食品营养强化剂。
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