羊乳富含蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质、维生素以及多种生物活性物质，营养组成更接近母乳，是一种易被人体消化吸收的天然营养食品。由于羊乳的蛋白质组成与牛乳有较大差别，在加工过程中存在一定难度，尤其是在超高温瞬时灭菌(ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT)处理过程中，蛋白质稳定性差，易出现蛋白质沉淀现象[1]。为了提高羊乳的热稳定性，通常采用添加稳定性盐[2]、调节蛋白质组成[3]等方法进行处理，这些方法虽然对羊乳热稳定性有明显改善，但也会存在一定的安全隐患。随着生物技术的发展，人们发现谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase, TGase)处理也可有效提高羊乳的热稳定性。
TGase是一种能催化蛋白质间酰基转移反应的酶，在蛋白质间形成共价键，促进蛋白质的交联[4]，可改善蛋白质食品的保水性、黏弹性、稳定性等功能特性，已在肉制品、乳制品、水产品、大豆制品等富含蛋白食品中广泛应用[5-6]。乳中蛋白是TGase的良好底物[7]，通过TGase交联可有效改善乳制品的热稳定性、凝胶化、持水性、黏度、乳化性等功能性质[8]。TGase交联作用受乳成分的影响较大，乳中的蛋白质主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，酪蛋白由于其开放结构，易被TGase交联，而乳清蛋白的球状结构不易被交联，但对乳清蛋白适当的变性处理，可显著提高TGase的交联作用[9]。同时乳中还存在天然TGase抑制剂[10-11]，能够抑制TGase的活性，这种抑制剂对热敏感，通过热处理可有效清除。热处理是目前乳制品加工的必经过程，不但可杀灭食品中有害微生物，保障食品安全，同时可使乳中乳清蛋白变性，灭活乳中的天然抑制剂。因此，本文通过研究羊乳的预热处理促进TGase对羊乳蛋白的交联，提高羊乳的热稳定性，进而为液态羊乳产品的开发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊乳，西北农林科技大学试验农场新鲜羊乳；谷氨酰胺转氨酶(活性100 u/g)，江苏一鸣生物科技有限公司；Nα-CBZ-Gln-Gly和L-谷氨酸-γ-单羟氧肟酸，美国Sigma公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，Solarbio公司。
1.2 仪器与设备
HH-S4型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；Z206A台式离心机，西安中团生物科技有限公司；BI-90Plus激光粒度分析仪，美国布鲁克海文仪器公司；EYEL4真空冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；MULTISKAN GO全波长酶标仪，美国热电公司；Power PacTM基础电泳仪电源和Mini-Protean®Tetra Cell电泳槽，美国BIO-RAD公司；ChemiDoc-It®510化学发光成像仪，美国UVP公司。
1.3 羊乳热稳定性的测定
羊乳热稳定性的测定采用Fox[12]毛细管法，用热凝固时间(heat coagulation time，HCT)表示。将羊乳在3 500×g下离心20 min去除脂肪。取60 μL的样品密封于玻璃毛细管中，浸入140 ℃恒温油浴中加热，并不时旋转玻璃毛细管，记录从开始加热到羊乳沉淀出现挂壁现象所需的时间，即为羊乳的热凝固时间。
1.4 TGase活性的测定
TGase活性的测定采用Crossowicz比色法[13]。以Nα-CBZ-Gln-Gly为作用底物，L-谷氨酸-γ-单羟氧肟酸绘制标准曲线(y = 0.061 3x + 0.046 8，R2 = 0.999 2)。TGase酶活定义为37 ℃时每分钟催化生产1 μmol的L-谷氨酸-γ-单羟氧肟酸所需的酶量。
将预热处理的羊乳用3 mol/L HCl调pH至4.2[14]，在15 000×g下离心15 min，去除沉淀的酪蛋白，将上清液用10 kDa滤膜(Amicon)超滤后，除去乳清蛋白[15]，得到无乳蛋白的上清液，用于TGase活性的测定。
将试剂A(称100 mg Nα-CBZ-Gln-Gly溶于2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液中，加入2 mL 0.1 mol/L盐酸羟胺、2 mL 0.01 mol/L还原型谷胱甘肽、4 mL 0.2 mol/L pH 6.0 Tris-HCl缓冲液)、试剂B(3 mol/L HCl、12% 三氯乙酸、5% FeCl3·6H2O按1∶1∶1体积比混合)在37 ℃下保温15 min。取0.4 mL无乳蛋白上清液，配制成0.01 g/mL的TGase液，添加1 mL试剂A在37 ℃下反应10 min，然后加0.4 mL试剂B终止反应5 min，4 000×g离心5 min，取上清液，在525 nm处比色，测定吸光值。用TGase酶活标准曲线计算TGase活性及残留酶活百分率。
(1)
式中：U，酶活，μmol/min；A，525 nm处的吸光度值；N，酶稀释倍数；10，反应时间，min；V，参加反应的酶体积，mL。
残留酶活百分率
(2)
式中：U0，预处理前的TGase酶活，μmol/min；Ui，预处理后的TGase酶活，μmol/min。
1.5 酪蛋白胶束粒径的测定
将处理后的乳样在3 500×g下离心去除上层脂肪，取10 mL脱脂乳，用去离子水进行1∶10稀释，用BI-90Plus激光粒度分析仪在25 ℃下测定乳样中的胶束粒径。仪器参数设置为：分散介质：水；黏度：0.890 mPa·s；折光系数：1.330。
1.6 乳清蛋白变性率的测定
参照赵丽丽[16]的方法，将预热处理的乳样用1 mol/L HCl调整pH至4.2，在室温下静置10 min，然后在15 000×g下离心15 min去除酪蛋白，上清液为无酪蛋白液。在无酪蛋白液中加入15%的三氯乙酸(质量浓度)，使三氯乙酸最终浓度为12%，在3 500×g下离心使其乳清蛋白沉淀，上清液为非蛋白氮液。用自动凯氏定氮仪分别测定处理后的非酪蛋白氮(NCN)和非蛋白氮(NPN)的含量，然后计算乳清蛋白氮(WPN)和乳清蛋白变性率。
WPN=NCN-NPN
(3)
乳清蛋白变性率
(4)
1.7 SDS-PAGE
参照LAEMMLI[17]的方法，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析羊乳蛋白质的交联程度。将羊乳样品用双蒸水稀释15倍，取1份上样缓冲液与3份样品稀释液混合均匀，在沸水浴中加热3～5 min使蛋白质变性，在12 000×g下离心5 min，取上层溶液为上样液。配制13.5%的分离胶(2.25 mL 30%丙烯酰胺(质量浓度)、1.25 mL pH 8.8 三(羟甲基)氨基甲烷(tris-HCl)、50 μL 10%十二烷基硫酸钠(SDS)(质量浓度)、50 μL 10%过硫酸铵(APS)(质量浓度)、5 μL四甲基乙二胺(TEMED)和1.4 mL双蒸水)和3.75%浓缩胶(0.313 mL 30%丙烯酰胺(质量浓度)、0.313 mL pH 6.8 tris-HCl、25 μL 10% SDS(质量浓度)、37.5 μL 10% APS(质量浓度)、3.75 μL TEMED和1.813 mL双蒸水)，完成制胶阶段。在电泳槽内加入电极缓冲液(3.03 g tris、18.7 g甘氨酸、1 g SDS定容至1 L)。取7 μL上样液添加到上样孔中进行电泳，开始电泳电压为75 V，当溴酚蓝进入分离胶后将电压调至200 V，电泳40 min。将凝胶从玻璃板取下，在水平摇床中用染色液(1 g考马斯亮蓝R-250、450 mL甲醇、100 mL冰乙酸定容至1 L)染色2 h。染色后的凝胶用脱色液(甲醇:冰乙酸:双蒸水的体积比为1∶1∶8)摇床脱色，至蛋白质条带清晰为止，最后用Chemi Doc-It化学成像系统扫描进行灰度分析。
1.8 数据处理方法
采用Excel 2016对试验数据进行整理和图表编辑；采用DPS 9.50统计分析软件对试验数据进行显著性分析。
2 结果与讨论
2.1 预热处理对羊乳热稳定性的影响
将羊乳在60、70、80、90 ℃下分别处理10～60 min，添加TGase使羊乳中TGase浓度达到3 u/g蛋白质，在40 ℃保温2 h，测定其热凝固时间(HCT)，结果见图1。
图1 预热处理对羊乳HCT的影响
Fig.1 Effect of preheat treatment on HCT of goat milk
由图1可知，用TGase催化羊乳蛋白交联提高其热稳定性与预热处理条件密切相关，随着预热处理温度的提高和处理时间的延长，羊乳HCT值逐渐增加，热稳定性提高。但预热处理条件对羊乳的热稳定性影响较大，在60～70 ℃预热处理时，羊乳的HCT缓慢上升；而当预热处理温度高于80 ℃时，羊乳的HCT显著提高，表明预热处理可有效地提高羊乳的热稳定性。大量研究表明，乳的热稳定性与TGase对乳蛋白的交联度有关，乳蛋白交联程度越大，乳的热稳定性越高[18]。但乳蛋白交联程度与乳蛋白存在状态有关，尤其是乳中天然存在的球状乳清蛋白，通常不易被TGase交联[7]。同时乳中存在天然的TGase抑制剂[19-20]，影响TGase对乳蛋白的交联效果，预热处理提高羊乳的热稳定性可能与TGase抑制剂和乳清蛋白变性有关。
2.2 预热处理对羊乳中TGase抑制剂的影响
将羊乳在60、70、80、90 ℃分别处理5、10、20、30、60 min后，在羊乳中添加0.01 g/mL的TGase，在37 ℃下保温15 min，测定羊乳中TGase的活性，计算残留酶活百分率，并以未经预热处理的羊乳为对照，结果如图2。
由图2可知，当羊乳未经预热处理时，羊乳中残留TGase的活性仅为所添加TGase活性的37.4%，表明羊乳中存在天然的TGase抑制剂，抑制TGase对乳蛋白的交联。然而羊乳经预热处理后，残留的酶活性显著提高，当羊乳在60、70、80、90 ℃下预热处理5 min后，羊乳中残留酶活百分率分别达到56.55%、61.27%、78.35%、83.75%，与未经预热处理的对照组相比，残留TGase活性分别提高了19.15%、23.87%、40.95%、46.35%，表明羊乳预热处理可有效灭活羊乳中TGase抑制剂。同时可以看出，羊乳中TGase活性与预热处理温度和时间有关，当羊乳在80～90 ℃处理30 min时，羊乳中残留TGase活性几乎达到100%，而在60～70 ℃预热处理60 min时，羊乳中残留TGase活性才能达到100%，这表明羊乳在80～90 ℃处理30 min或在60～70 ℃处理60 min才完全使羊乳中TGase抑制剂失活。DE JONG [10]报道，牛乳中TGase抑制剂对热处理敏感，在80 ℃以上热处理即可使TGase抑制剂灭活，这与本研究结果一致。
图2 预热处理对羊乳中TGase残留酶活的影响
Fig.2 Effect of preheat treatment on residual TGase activity in goat milk
2.3 预热处理对羊乳乳清蛋白变性率的影响
将羊乳在60、70、80、90 ℃下分别预热处理30 min，测定其乳清蛋白变性率，结果见图3。
图3 预热处理对羊乳乳清蛋白变性率的影响
Fig.3 Effect of preheat on the denaturation of whey protein in goat milk
由图3可知，预热处理温度对羊乳乳清蛋白变性率有显著的影响，随着预热温度的升高，乳清蛋白变性程度显著提高(P<0.05)。羊乳经60 ℃预热处理后有12.77%的乳清蛋白变性，而在80 ℃预热处理后有68.1%的乳清蛋白变性，80～90 ℃处理乳清蛋白变性程度变化不大(P>0.05)。乳中的乳清蛋白是一种热敏性蛋白质，在80 ℃以上热处理时极易变性，同时变性的乳清蛋白会与酪蛋白胶束结合，加速乳清蛋白的变性，这种变性的乳清蛋白更有利于TGase的交联[21]，提高羊乳的热稳定性。
2.4 预热处理对羊乳酪蛋白胶束粒径的影响
将羊乳分别在60、70、80、90 ℃下预热处理30 min后立即冷却至40 ℃，添加TGase使其浓度达到3 u/g蛋白质，在40 ℃下保温2 h，测定羊乳中酪蛋白胶束粒径，结果如图4所示。
图4 预热处理对羊乳酪蛋白胶束粒径的影响
Fig.4 Effect of preheat on the size of casein micelles of goat milk
由图4可以看出，未经TGase处理的羊乳酪蛋白胶束平均为117.6 nm，且不受预热处理的影响(P>0.05)，但羊乳经60～90 ℃预热处理后，TGase对羊乳中酪蛋白胶束粒径影响较大，且随着预热处理温度的升高，酪蛋白胶束粒径逐渐增大(P<0.05)，MARTIN[22]研究表明，乳中酪蛋白在TGase交联时，仅发生分子内交联，酪蛋白胶束粒径无明显变化，而羊乳经预热处理时，由于乳清蛋白变性与酪蛋白胶束结合会形成较大的胶束[23]，使TGase交联后酪蛋白粒径增大。
2.5 预热处理对羊乳蛋白质交联的影响
将羊乳在60、70、80、90 ℃下分别预热5 min和30 min，添加TGase使其浓度为3 u/g蛋白质，40 ℃保温2 h，用还原性SDS-PAGE电泳分析预热处理对TGase催化羊乳蛋白质交联的影响。
乳的热稳定性与乳中酪蛋白胶束状态有关，酪蛋白胶束是由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白构成的复合物，其中κ-酪蛋白位于胶束表面，对胶束稳定性起关键作用[24]，当乳经热处理时，位于表面的κ-酪蛋白易解离，使乳的稳定性降低[21]，但当酪蛋白胶束经TGase交联后，可使κ-酪蛋白胶束在受热时稳定，不易从胶束表面脱离，从而提高乳的热稳定性。SDS-PAGE电泳是将交联后的酪蛋白胶束解离成单体酪蛋白，反映乳蛋白的交联程度。羊乳蛋白质在TGase作用下的交联情况见图5。
a-SDS-PAGE电泳图；b-预热温度对单体蛋白质相对含量的影响
图5 预热处理对TGase交联羊乳蛋白质的影响
Fig.5 Effect of preheat treatment on cross-linked goat milk protein with TGase
注：M为标准分子质量，范围是14.4～116 kDa；1为未经预热处理和未经TGase处理的脱脂羊乳；2为未预热处理，但经过3 u/g TGase在40 ℃下处理2 h的羊乳；3为未经TGase处理，但经过80 ℃ 30 min预热处理的羊乳；4、5分别为60 ℃预热5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下处理2 h的羊乳；6、7分别为70 ℃预热5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下处理2 h的羊乳；8、9分别为80 ℃预热5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下处理2 h的羊乳；10、11分别为90 ℃预热5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下处理2 h的羊乳。
由图5可以看出，羊乳中的4种酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白)和2种乳清蛋白(α-乳白蛋白、β-乳球蛋白)在SDS-PAGE电泳中，可明显分离，形成清晰的条带。同时可以看出，经预热处理后，TGase交联形成的高分子质量蛋白条带。未经预热处理和未经TGase处理的羊乳(条带1)与未经预热处理、但经TGase处理的羊乳(条带2)相比，其4种酪蛋白和2种乳清蛋白条带的色度无明显变化，也未见高分子质量蛋白条带的形成，同时未经TGase处理、但经预热处理的羊乳(条带3)同样没有高分子质量蛋白条带的形成，这进一步证实羊乳中存在天然的TGase抑制剂，抑制TGase对乳蛋白的交联。但经预热和TGase同时处理的羊乳中蛋白质组成和高分子质量蛋白条带有一定变化，表明预热处理可促进乳蛋白的交联。
当羊乳经预热处理后，TGase对羊乳中蛋白的交联程度有一定的差别，尤其是当羊乳经80 ℃以上预热处理后(条带8、9、10、11)，κ-酪蛋白条带色度明显降低，同时发现形成的高分子质量条带明显增多，而αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白条带色度变化不大。同时发现乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的色度有不同程度的降低，经条带灰度分析，羊乳经80 ℃预热处理30 min时，κ-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分别降低44.86%、31.33%和21.39%，这表明TGase对羊乳中蛋白交联是有选择性的，主要交联羊乳酪蛋白中的κ-酪蛋白和乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。RODRIGUEZ-NOGALES[25]研究表明，乳中酪蛋白对TGase交联敏感性不同，其中κ-酪蛋白处于酪蛋白胶束表面，易被TGase交联，而位于酪蛋白胶束内部的αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白交联程度较低，这与本研究结果一致。关于乳清蛋白，由于其球状结构，通常不易被TGase交联，但经热处理时乳清蛋白变性，TGase可使其交联[26]。RODRIGUEZNOGALES[9]研究表明，当乳经热处理后，变性的α-乳白蛋白会与β-乳球蛋白形成复合物，然后再与κ-酪蛋白形成聚合物，TGase作用于κ-酪蛋白时，同时也稳定了酪蛋白胶束，提高羊乳的热稳定性。
3 结论
羊乳经预热处理后，用TGase对乳蛋白交联，可显著提高羊乳的热稳定性，羊乳中存在天然的TGase抑制剂，在60～70 ℃预热处理60 min或80～90 ℃预热处理30 min可使羊乳中TGase抑制剂完全失活，同时，预热处理可使羊乳中乳清蛋白变性，促使乳蛋白的交联，提高羊乳的热稳定性。SDS-PAGE电泳结果显示，预热处理可促进TGase与羊乳中κ-酪蛋白的交联，使κ-酪蛋白在热处理时不易从酪蛋白胶束表面解离，从而提高羊乳的热稳定性。
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