西藏传统酿造青稞酒是以青藏高原特色作物青稞为主要原料，以藏曲为糖化发酵剂酿制而成的一种发酵酒，具有风味独特，酒度低，营养丰富的特点[1-2]，在藏族人民文化生活中扮演着十分重要的角色，是西藏文化的典型代表[2]。
西藏传统酿造青稞酒的酿造方法独特，主要原材料为青稞，藏曲和饮用水。传统生产方式是将青稞浸泡24 h后煮熟，摊凉后拌入藏曲粉，装在容器里保温发酵3 d左右加水浸泡后过滤即得西藏传统酿造青稞酒[2]。
除了青藏高原特有的谷物青稞，藏曲的使用也是酿造青稞酒的关键所在。藏曲是对西藏人民按自己的传统自然接种方式制作而成的酿酒糖化发酵剂的统称[3]，西藏各地生产青稞酒的藏曲均为自然培养而成，其中微生物种类复杂，含有根霉、毛霉、曲霉、酵母和产酸菌及其他杂菌[4]。但由于地理环境与自然气候条件的差异，不同地区的藏曲中所包含的微生物有所不同[5]。西藏传统酿造青稞酒的酿造过程主要依赖于藏曲中的微生物自然繁殖和发酵。
随着西藏地区社会经济的发展，青稞酒酿造生产逐步从传统手工酿造方式向工业化大规模酿造转变。但由于在西藏青稞酒生产过程中由于藏曲来源的不同，其微生物组成差异对青稞酒的酿造过程和产品风味的影响目前并不清晰。使得传统酿造青稞酒工业化生产中一直存在风味品质不可控的问题。因此科学研究藏曲对西藏传统酿造青稞酒风味品质的影响对于优化生产工艺，提高产品品质具有重要意义。
本文以不同藏曲酿造的西藏传统青稞酒为研究对象，系统地分析了其基础理化指标，有机酸种类及含量，采用顶空固相微萃取(headspace solid phase micro-extraction, HS-SPME)与GC-MS相结合的方法分析了西藏传统酿造青稞酒的挥发性香气组分，丰富了西藏传统酿造青稞酒风味化学的研究，同时也为藏曲选择提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 主要仪器
GC 6890N-MSD 5975气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦公司；Gerstel多功能自动进样器，德国Gerstel公司；L-8900全自动氨基酸分析仪，日本Hitachi公司；Acquity超高效液相色谱仪，美国Waters公司、SB-25-12D超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；Millipore-Q超纯水系统，美国密理博公司；pH仪，Mettler Toledo公司。
1.1.2 主要试剂
三氯乙酸(色谱纯，上海国药集团)，无水乙醇(色谱纯，上海安谱科学仪器公司)，C5～C30烷烃标准品(色谱纯，天津光复精细化工研究所)，化合物定性及定量时所用标准品(色谱纯，Sigma-Aldrich公司)，无水Na2SO4、NaCl(分析纯，上海国药集团)，2 mol/L硫酸溶液，10%碳酸氢钠溶液，0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液。实验用水均为煮沸 5 min后冷却至室温的超纯水。
1.1.3 实验材料
藏曲：分别采购生产于拉萨、林芝、日喀则及山南地区的5种不同形态藏曲样品。分别记为：拉萨、林芝、日喀则、山南1号、山南2号。碾碎储存于4 ℃冰箱备用。
青稞：由西藏天佑德青稞酒业有限责任公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 西藏传统青稞酒的酿造
称取200 g青稞用自来水常温浸泡24 h，沥干水分后在蒸锅上蒸40 min，以清水冲淋至30 ℃，添加3 g粉碎好的藏曲并拌匀，装入1 L广口瓶中盖上8层纱布，置于30 ℃培养箱中进行发酵，约48 h后加入400 mL纯净水，继续发酵72 h后进行过滤离心，得到西藏传统酿造青稞酒样品用于后续分析。每种藏曲分别进行3次平行酿造实验。
1.2.2 不同藏曲酿造青稞酒的理化指标的测定
1.2.2.1 还原糖，酒精度，总酸，pH值的测定
参照黄酒国标方法[6]对西藏传统酿造青稞酒的还原糖含量，酒精度，总酸含量及pH值进行测定。每个样品重复测定3次，结果取3次测定平均值。
1.2.2.2 游离态氨基酸的测定
参照国标[7]的方法测定游离氨基酸的含量，吸取样品1 mL与三氯乙酸溶液1∶1混合，沉淀1 h后，用0.22 μm有机相滤头过膜入液相小瓶。使用L-8900 全自动氨基酸分析仪检测处理后的样品中游离态氨基酸含量。每个样品重复测定3次，结果取3次测定平均值。
1.2.3 有机酸的测定
采用王琳等[8]报道的方法进行有机酸的测定。以0.02 mol/L的NaH2PO4溶液为流动相，取2 mL样品经SCX固相萃取小柱处理后用超高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为ZORBAX柱SBC18柱(250×4.6 mm)，检测波长为215 nm，进样量为5 μL，有机酸的定量采用峰面积外标标准曲线法进行定量。每个样品重复测定3次，结果取3次测定平均值。
1.2.4 不同地区藏曲酿造青稞酒中香气化合物组分分析
青稞酒样品中香气化合物组分的分析参照陈双等[9]报道的方法进行了部分调整。具体分析过程如下：
顶空固相微萃取(HS-SPME)提取样品中挥发性风味组分：称取2.5 g的NaCl，量取4 mL青稞酒样品、4 mL超纯水及10 μL的2-辛醇内标(60 mg/L，溶解于乙醇中)于顶空瓶中，用带PTFE/蓝色硅胶隔垫的空心磁性金属盖密封。使用自动进样系统(MPS 2)进行顶空固相微萃取。萃取过程如下：采用2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取头，萃取温度50 ℃，样品平衡时间5 min，萃取时间50 min，乳化器转速500 r/min。萃取结束后将萃取头置于GC进样口在250 ℃下解吸附5 min，进行GC-MS检测分析。
气相色谱-质谱联用仪分析(GC-MS分析)：GC条件：进样口、检测器温度均为250 ℃，载气为高纯He，流速为1 mL/min，进样模式为不分流进样，色谱柱采用DB-FFAP (60 m×0.32 mm×0.25 μm，Agilent)。升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min后，以5 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持10 min。
MS条件：以EI电离源为离子源，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描范围35.00～350.00 amu。
香气化合物定性分析：通过与NIST 08(Agilent Technologies Inc.)质谱库中标准谱图及文献中报道的保留指数对比匹配鉴定出青稞酒中的挥发性化合物。再参照文献确定出具有香气特征的化合物得到最终香气化合物鉴定结果。
香气化合物半定量分析：采用内标法对这些香气化合物进行半定量，按公式(1)进行计算。
(1)
式中：ρ，待测化合物质量浓度，μg/L；S，待测化合物峰面积；ρ内，内标物峰面积；ρ内，内标化合物终质量浓度，μg/L。每个样品重复测定3次，结果取3次测定平均值。
2 结果与讨论
2.1 不同藏曲酿造青稞酒理化指标分析
为了研究不同来源藏曲对青稞酒酿造的影响，分别使用拉萨、林芝、日喀则、山南1号、山南2号藏曲进行实验室规模青稞酒酿造实验，分析酿造所得青稞酒基本理化指标如表1所示：
表1 不同藏曲发酵青稞酒理化指标
Table 1 Physical and chemical indicators for “Qingke” wine made from different “Zangqu”
注：a:测定结果进行单因素方差分析；ns表示无显著性差异；*，**分别表示在P<0.05和P<0.01水平有显著性差异。下同。
由表1可以看出不同藏曲发酵青稞酒样品中还原糖含量均低于5 g/L，表明发酵较为彻底。发酵结束青稞酒中酒精度含量在8.42%～9.48%(体积分数)，不同藏曲酿造青稞酒酒精含量差异也不大。同时5种不同藏曲酿造青稞酒中所含的游离氨基酸含量也都较接近。这些结果反映出不同地区的藏曲具有较高的糖化发酵活力，均能够顺利地完成青稞酒的发酵过程。但比较发酵结束青稞酒中总酸和pH指标可以看出，不同藏曲发酵青稞酒中总酸的含量差异显著，含量范围在5.96～18.52 g/L，拉萨地区青稞酒中总酸含量最高，可能是由于拉萨地区藏曲中产酸杂菌较多，林芝和山南地区藏曲总酸含量相对较低。酸是酒精饮料中重要的重要协调成分和呈味物质，可以与其他物质共同作用生成芳香物质[10]，适量的酸有助于酒体的放香舒适性，适量的酸可对酒起缓冲作用[11]，但酸度过高会影响青稞酒口感与品质[12]。本研究表明藏曲的选用对于调节青稞酒的酸度具有重要影响。
2.2 不同藏曲酿造青稞酒有机酸分析
“无酸不成酒”有机酸的种类和含量对酒精饮料的风味品质具有重要影响，但目前还很少有关于西藏传统酿造青稞酒中有机酸种类含量的报道。由于不同藏曲酿造的青稞酒中总酸含量差异显著，本研究进一步采用高效液相色谱法对青稞酒中有机酸的种类和含量进行了分析，结果如表2所示：
表2 不同藏曲酿造青稞酒有机酸种类与含量 单位：g/L
Table 2 Content of organic acids in “Qingke” wine made from different “Zangqu”
注：b：nd，低于定量限。
结果显示西藏传统发酵青稞酒中所检测到的有机酸主要有乳酸、乙酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、草酸、酒石酸。分析不同藏曲发酵青稞酒中有机酸含量可知：青稞酒中主要有机酸为乳酸和乙酸，乳酸含量最高，其在不同地区藏曲酿造的青稞酒中有机酸含量的占比为83.97%～56.10%，拉萨和日喀则藏曲发酵青稞酒乳酸含量相对较高，分别达到14.88和9.84 g/L， 各自在其有机酸含量中的占比分别为83.97% 和78.65%，直接导致其总有机酸含量高于其他3种藏曲发酵青稞酒总有机酸含量2～3倍。酿造过程中乳酸主要来源于乳酸菌的代谢[13]，藏曲生产过程中采用自然发酵的加工方式，其中含有种类较多的乳酸菌[5]，乳酸菌的差异可能是造成不同青稞酒中有机酸含量差异的主要原因。
2.3 不同藏曲酿造青稞酒香气化合物分析
通过对酿造青稞酒的感官分析发现不同藏曲酿造的青稞酒香气特征存在明显的差异。为了明晰藏曲青稞酒中的香气特征，采用HS-SPME-GC-MS技术分析了青稞酒中挥发性组分特征。本研究在西藏传统发酵青稞酒中共检测出挥发性风味物质66种，如表3所示，其中酯类物质19种、芳香族化合物9种，醇类物质11种、酸类物质9种、醛酮类物质10种、其他类8种，其中山南2号藏曲酿造的青稞酒的HS-SPME-GC-MS分析色谱图如图1所示。
图1 山南2号藏曲酿造青稞酒HS-SPME-GC-MS分析总离子流色谱图色谱图
Fig.1 HS-SPME-GC-MS total ion chromatogram of “Qingke” wine fermented from Shannan No.2
注：图中编号所代表的物质与表3相对应
相对定量分析比较发现不同藏曲发酵青稞酒中所含的风味物质含量有所不同，各类物质的含量分布情况对比如图2所示。
图2 不同藏曲酿造青稞酒香气化合物分布比例
Fig.2 Relative content of aroma compounds of “Qingke” wine fermented from different “Zangqu”
表3 不同藏曲发酵青稞酒香气化合物及含量单位：μg/L
Table 3 Volatile aroma compounds identified in“Qingke” wine fermented from different “Zangqu”
续表1
注：a:保留指数为DB-FFAP色谱柱测定结果；b：MS，质谱谱图检索鉴定，RI，保留指数比对鉴定，SD，标准品比对鉴定。
从表3定量分析结果可以看出不同地区藏曲发酵的青稞酒在香气成分种类上差异不大，但这些香气成分在5种青稞酒中的相对含量却存在较为显著的差异，这种香气组分结构比例的差异可能是造成不同藏曲酿造青稞酒香气感官特征差异的主要原因。由图2可看出西藏传统发酵青稞酒中醇类物质含量最多，芳香族化合物含量次之，其次是酯类物质，醛酮类物质和其他类物质含量较少。青稞酒中的主要风味物质有苯乙醇、3-甲基丁醇、乳酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等。而不同的藏曲发酵的青稞酒中各类物质具体含量也有差异。山南2号和日喀则藏曲酿造的青稞酒挥发性风味物质总量高于其他几种藏曲酿造的青稞酒。
2.3.1 酯类香气化合物
酯类化合物是西藏传统酿造青稞酒中种类最多、含量最高的挥发性化合物，共检测出19种，检测到的化合物有乙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸-2-甲基丙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、丙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸庚酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、乳酸异戊酯、丁二酸二乙酯、十四酸乙酯，其中杜木英[1]在2008年检测到的青稞酒中的酯类物质有乙酸乙酯和乳酸乙酯，其余的物质在青稞酒中都是首次被检测到。5种藏曲酿造的青稞酒中总酯含量分别为拉萨627.73 μg/L、林芝276.91 μg/L、日喀则972.68 μg/L、山南1号892.17 μg/L、山南2号840.91 μg/L，日喀则、山南1号、2号藏曲酿造的青稞酒中酯类物质含量较高，拉萨、林芝藏曲酿造的青稞酒中酯类物质含量较少。其中主要的酯类物质是乳酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸异戊酯。在不同藏曲酿造青稞酒中含量最多的酯类化合物是乳酸乙酯，乳酸乙酯在酒体中起到助香的作用；其次是乙酸乙酯，其在酒体中呈现水果香，在46%vol酒精-水溶液中的嗅觉阈值为32 551.60 μg/L，是酒精饮料中主要的酯类物质。其他酯类化合物大部分呈现水果香、花香，且简单直链酯类的嗅觉阈值随着碳链的增长而减小[14]，给青稞酒带来水果的香气骨架，很大程度上决定了西藏传统青稞酒的风格特征。
2.3.2 芳香族香气化合物
通过本研究共检测到芳香族化合物9种，其中有7种化合物首次在西藏传统酿造青稞酒中检测到，分别为：苯甲醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲醇、2-甲基丁酸苯乙酯、肉桂酸乙酯、苯甲酸。含量较高的为β-苯乙醇，在5种青稞酒中的含量分别为：483.61、893.87、705.30、556.59、816.02 μg/L，林芝藏曲和山南2号藏曲酿造的青稞酒中β-苯乙醇的含量最高。β-苯乙醇又称2-苯乙醇，是一种呈甜香、玫瑰花香、蜜香的芳香高级醇，是酒精饮料中重要的高沸点香气成分，广泛存在于各种酒精饮料中[15]，其在黄酒中含量为40～180 mg/L，在10%vol酒精水溶液中阈值为14 mg/L[16]，是发酵酒中的重要香气成分。
2.3.3 醇类香气化合物
本次研究共检测出西藏传统青稞酒中醇类化合物11种，且在5种不同藏曲发酵的青稞酒中均有检测到。较杜木英等[1]检测出了8种新的物质，分别为：1-丁醇、3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基-1-己醇、2-壬醇、1-辛醇、1-壬醇、3-甲硫基-1-丙醇。醇类化合物是酒中重要的风味化合物，是酒精发酵、氨基酸转化及亚麻酸降解物氧化的主要产物，在酒中起到呈香的作用，同时也是重要的风味前体物质[11]。从含量多少来看，主要的醇类物质有3-甲基丁醇，在5种藏曲发酵的青稞酒中所占总醇含量的比例分别为：拉萨74.41%、林芝78.67%、日喀则78.64%、山南1号70.65%、山南2号75.87%。3-甲基丁醇属于支链脂肪醇，具有溶剂和杂油醇的香气特征，主要是通过发酵过程中亮氨酸和缬氨酸的降解产生的[17]。1-辛烯-3-醇又名蘑菇烯，是一种具有蘑菇气息的脂肪族不饱和醇，阈值为6.12 μg/L[18-19]，而5种藏曲酿造的青稞酒中1-辛烯-3-醇的含量均高于其阈值，对青稞酒的香气特征具有重要贡献。
2.3.4 酸类香气化合物
在西藏传统酿造青稞酒中共检测到9种挥发性酸类物质，分别为：乙酸、2-甲基丙酸、丁酸、2-甲基丁酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸，其中除乙酸外剩下8种物质是首次检测到。黄酒中酸类化合物大部分是在发酵过程中由酵母代谢生成，其次来自原料米、曲和添加浆水以及醇、醛氧化而来。酸是黄酒的重要呈味物质，含酸量少的酒，酒味寡淡；如酸味过大，会影响酒的质量和风味[11]。这些物质在西藏传统酿造青稞酒的含量不是很高，都在2 μg/L左右，乙酸含量较高，乙酸呈刺激性酸味，其在黄酒中的识别阈值为8.21 μg/L[20]。
2.3.5 其他微量化合物
在西藏传统酿造青稞酒中还检测到一些微量的醛酮类10种，其他类8种，这些物质含量都很少，但由于很多香气组分具有较低的香气阈值，这些组分可能对青稞酒的香气也具有重要贡献。例如本研究在青稞酒中首次鉴定出的β-大马酮，它具有怡人的蜂蜜、玫瑰香，在葡萄酒中的阈值为0.05 μg/L[21]，在白酒中的阈值为0.07 μg/L，给青稞酒带来很明显的蜂蜜香。
3 结论
本文以不同藏曲发酵而成的青稞酒为研究对象，对其进行还原糖、酒精度、总酸、总游离氨基酸、pH值的理化指标分析，发现不同藏曲酿造的青稞酒的总酸含量具有很大的差异。接着采用高效液相色谱法对青稞酒的有机酸进行分析，发现青稞酒中的有机酸主要为乳酸和乙酸，乳酸含量最高。最后利用HS-SPME-GC-MS方法检测出挥发性风味物质共66种，其中酯类物质19种、芳香族化合物9种，醇类物质11种、酸类物质9种、醛酮类物质10种、其他类8种。分析各物质含量可知青稞酒的风味主要由酯类物质、醇类物质和芳香族化合物构成，主要风味物质有苯乙醇、3-甲基丁醇、乳酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等。同时也检测出不同藏曲酿造而成的青稞酒的风味物质含量的差异，山南1号、2号和日喀则藏曲发酵青稞酒所含挥发性风味物质较多，总酸含量较低，适合用于西藏传统酿造青稞酒的发酵。
本实验研究结果科学解析了西藏传统酿造青稞酒风味化学本质，丰富了西藏传统酿造青稞酒风味化学的研究，同时也为西藏传统青稞酒酿造所用藏曲的选择提供了科学依据。
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