添加餐厨废油脂培养酵母进行γ-癸内酯生物转化

王荣霞,朱廷恒*,汪琨

(浙江工业大学 生物工程学院,浙江 杭州,310014)

摘 要 为了降低工业化生产γ-癸内酯(γ-decalactone,GDL)的成本,利用餐厨废弃油脂代替部分培养基成分培养解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),当添加餐厨废弃油脂6 g/L,葡萄糖由20 g/L降为12.5 g/L,酵母提取物由10 g/L降为5 g/L时,培养12 h后获得与完全培养基相当的生物量。在Y.lipolytica中过表达酰基辅酶A氧化酶基因pox2获得工程菌,将蓖麻油酸转化为GDL产量达1.5 g/L,是出发菌株的2.2倍。利用分解油脂活性高的Y.lipolytica菌株(解脂假丝酵母Candida lipolytica CICC31223)与工程菌混菌降解餐厨废弃油脂并转化蓖麻油生产GDL,最佳条件为:当C.lipolyticaY.lipolytica工程菌的接种比例为1∶10(体积比)、接种方式为先接种C.lipolytica,28 ℃,振荡培养(200 r/min)12 h后再接种Y.lipolytica,混菌发酵培养基中GDL产量达0.15 g/L,显著高于工程菌单菌发酵产量0.08 g/L。结果表明,餐厨废弃油脂是廉价的碳源,通过不同菌株的混菌发酵转化生产GDL的方法具有很大的工业化应用前景。

关键词 餐厨废弃油脂;解脂耶氏酵母;解脂假丝酵母;γ-癸内酯;交错式热不对称PCR

γ-癸内酯(γ-decalactone,GDL)是一种天然存在于草莓、桃子等水果中的内酯类香料,具有较低的香气阈值,是国际公认的安全的食品添加剂[1-2]。随着对美味食品、饮料等消费的不断增长,天然食品香料添加剂的需求不断增加。

生物法生产的GDL与天然植物成分更接近,得到了高度的重视[3-4]。GDL的生物转化是以脂肪酸和脂肪酸酯作为底物,利用微生物进行发酵转化生产。微生物有解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)[5-7]、酿酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)[8]Lindnera saturnus[9],这几株菌GDL产量分别为:0.168~1.597、0.954、0.512 g/L,其中解脂耶氏酵母是生产GDL的最主要菌株。

目前报道的解脂耶氏酵母生产GDL都是利用完全培养基[10-11],含酵母提取物(10 g/L)、葡萄糖(20 g/L)等,工业化生产的成本高。已报道的解脂耶氏酵母的不同菌株(又见解脂假丝酵母Candida lipolytica CICC31223)[12-13],产酶活性和GDL差别很大,有的菌株能分泌大量的脂酶和酯酶,可以分解利用脂类物质进行生长,但是不能转化生产GDL。如果能够利用廉价的脂类物质替代完全培养基中部分营养成分,利用不同酵母菌株进行分解,再利用产GDL的解脂耶氏酵母进行GDL转化生产,则可以显著降低工业化生产成本。

我国餐厨废弃油脂的量十分巨大[14-15],开发利用这种废弃资源作为培养基成分进行酵母培养[16]并转化生产GDL,是一种既经济又环保的方法。利用不同菌株混菌发酵协同降解餐厨废油脂,获得一定生物量的解脂耶氏酵母再进行GDL的转化生产,是一条很有生产应用潜力的途径,迄今尚无相关报道。

GDL的生物转化法是对前体物蓖麻油酸经β-氧化生成[17-18]。解脂耶氏酵母中酰基辅酶A氧化酶家族(pox1-6分别编码Aox1-6)是催化GDL生成的限速酶。其中Aox2表现出长链特异性,Aox3是短链特异性[19],增加pox2拷贝比敲除pox3更有利于GDL产量提高[20]

本研究探索添加餐厨废油脂替代培养基中部分葡萄糖和酵母提取物,利用不同菌株混合发酵协同降解油脂,获得较多解脂耶氏酵母生物量后再进行GDL转化。同时构建了过表达pox2基因的工程菌株并进行了转化研究。

1 材料与方法

1.1 菌株

解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)G3菌株:本实验室选育保存的菌株;解脂假丝酵母(C.lipolytica)CICC31223:购自工业微生物菌种保藏中心;大肠杆菌(Escherichia coli)DH 5α:本实验室保存。

1.2 培养基

YPD培养基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母粉10,固体添加20g琼脂。

转化培养基(g/L):蓖麻油酸60,吐温-80 5,KH2PO4 0.55,Na2HPO4 0.31,无水MgSO4 0.16,pH自然。

混菌发酵培养基(g/L):蓖麻油20,餐厨废弃油脂40,吐温-80 5,KH2PO4 0.55,Na2HPO4 0.31,无水MgSO4 0.16,pH自然。

以上所有培养基均121 ℃灭菌20 min。

扩大培养基M1~M6成分及含量如表1:

表1 培养基成分 单位:g/L

Table 1 Medium composition

培养基葡萄糖蛋白胨酵母粉餐厨废油脂吐温-80M112.5205204M212.5205124M312.520564M4-205--M512.5205--M6202010--

注:餐厨废弃油脂由学校食堂废弃油脂分离得到;“-”代表未添加。

1.3 酵母降解酯类及生物量测定

测定不同酵母菌株降解酯类的能力。酯和内酯在碱性条件下与羟胺反应生成异羟肟酸,在酸性条件下异羟肟酸又与Fe络合生成的紫红色络合物在OD506 nm有吸收[21]。挑取酵母单菌落于5 mL YPD液体培养基,28 ℃振荡(200 r/min)培养过夜;转接至30mL液体YPD培养基中,28 ℃振荡(200 r/min)培养12 h, 6 000 r/min,离心3 min,菌体沉淀用山梨醇缓冲液洗涤2次,将菌浓度调至OD600nm=1的菌悬液,以8%的接菌量接种至60 mL/500 mL的转化培养基中。28 ℃ 200 r/min振荡培养,每隔12 h取500 μL发酵液,6 000 r/min,离心3 min,上清液稀释至1.5 mL后测酯含量,菌体沉淀用于测生物量。将1 mL 0.5 mol/L的盐酸羟胺乙醇加入到试管中,再加300 μL 6 mol/L的NaOH,加入1.5 mL已稀释的发酵上清液;剧烈振荡100 s,加入500 μL 4 mol/L的HCl溶液;待溶液变澄清,继续加入150 μL 5 g/L的FeCl3溶液显色,酶标仪测定OD506 nm,每组3个平行样。

分光光度计法测生物量:用1 mL 50%(体积分数)的乙醇悬浮菌体沉淀,6 000 r/min,离心3 min,去上清,重复洗涤1次,去离子水重悬浮。测OD600 nm

1.4 GDL测定方法

1.4.1 样品处理

取200 μL的发酵液,与200 μL 1 g/L的桃醛溶液和500 μL乙酸乙酯溶液混合,振荡混匀,8 000 r/min,离心1 min,将200 μL上清液转移至新的1.5 mL的离心管,精确地取1 μL进样测GDL含量。

1.4.2 高效气相色谱检测条件

HP-INNOWAX毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);柱温180 ℃保持10 min,载气(N2)流速4.3 mL/min,进样1 μL;FID检测器温度280℃;分流比10∶1。

1.5 过表达pox2基因的解脂耶氏酵母工程菌构建

1.5.1 工程菌构建及分子鉴定

为了构建解脂耶氏酵母酰基辅酶A氧化酶基因pox2过表达菌株,合成由解脂耶氏酵母组成型启动子驱动的pox3U-P-hph-T-P-pox2-T-pox3D表达框。pox3U,pox3D分别位于pox3(Gen Bank accession AJ001301)上游1 840-2 261 bp和下游4 247-4 666 bp区域;P是解脂耶氏酵母胞外碱性蛋白酶基因组成型启动子XPR2(Gen Bank accession KF975902);hph是潮霉素抗性基因(Gen Bank accession MG680575);pox2(Gen Bank accession AJ001300)。上述各片段组成的重组表达框通过化学合成并克隆到pUC57空载质粒上(常州基宇生物公司),将质粒转入大肠杆菌中扩大培养,提取质粒经双酶切获得该重组表达框片段,用酵母转化试剂盒(Frozen-EZ Yeast Transformation ⅡTM)通过同源重组转入到解脂耶氏酵母G3中,涂布在含有400 μg/mL潮霉素的平板上进行初筛,待长出单菌落,转接至含有潮霉素的液体YPD中,28 ℃振荡(200 r/min)培养48 h,提取酵母基因组,进行PCR鉴定,通过分子鉴定的转化子,使用TAIL-PCR法[22-23]验证插入位点。分子鉴定引物如表2。

1.5.2 酵母菌株GDL产量的测定

挑取酵母单菌落于5 mL液体YPD培养基,28 ℃振荡(200 r/min)培养过夜;转接至30 mL液体YPD培养基中,28 ℃振荡(200 r/min)培养12 h, 6 000 r/min,3 min离心收集菌体,用山梨醇缓冲液洗涤2次菌体,将菌浓度调至OD600 nm=1的菌悬液,以8%的接菌量接种至30 mL/250 mL的含蓖麻油酸的转化培养基中。28 ℃振荡(200 r/min)培养72 h。利用高效气相色谱检测GDL的产量。

表2 引物列表
Table 2 List of the primers

名称序列5′-3′F15-ATGGGTAAAAAGCCTGAACTCACCG-3R15-TTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3F-SP15-CCAGCAGAACCCTGCTCAGAACCCCCG-3F-SP25-TGGAGTTGTGAGTGTTAGTAGACATG-3F-SP35-GTGACTGGATAACTGACGGTCAGTGG-3LAD15-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCCGC(G/C/A)N(G/C/A)NNNGGAA-3LAD25-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCCGC(G/C/T) N(G/C/T)NNNGGTT-3LAD35-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCCGC(T/A/C)N(A/G/C)NNNCCAC-3LAD45-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCCGC(G/C/A)(G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAA-3LAD55-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCCGC(G/C/T)(G/A/T)N(G/C/T)NNNCGGT-3

1.6 含餐厨废油脂培养基酵母培养及混菌发酵条件的探索

1.6.1 餐厨废油脂培养酵母菌株

挑取酵母单菌落,接种于5 mL的液体YPD培养基中,28 ℃振荡(200 r/min)培养过夜;转接至30 mL/250 mL扩大培养基中,培养12 h,培养条件同上,6 000 r/min,离心3 min,收集菌体,用山梨醇缓冲液洗涤菌体2次,将菌浓度调至OD600 nm=1的菌悬液,以1%的接菌量接种到30 mL/250 mL扩大培养基(M1~M6)中,28 ℃振荡(200 r/min)培养12 h后,将菌液转移到50 mL的离心管,6 000 r/min,3 min离心,弃上清,用无菌水洗涤3次菌体,使用分光光度法测生物量。以上每个试验设置3个平行试验,并重复3次。

1.6.2 混菌发酵转化适宜条件的探索

1.6.2.1 混菌发酵转化适宜的接种方式

将混菌发酵培养基以每瓶30 mL分装于250 mL的锥形瓶中。将适宜扩大培养基培养得到的菌液,调整其浓度,调至OD600 nm=1的菌悬液,以总接种量为8%,分别按以下3种接种方式接入适宜比例的菌悬液。以等量的无菌生理盐水代替菌悬液作空白对照,28 ℃振荡(200 r/min)培养72 h,检测GDL的产量。以上每个试验设置3个平行试验,并重复3次。

按种方式分为3种,分别为:A先接种解脂耶氏酵母菌株,12 h后再接种解脂假丝酵母菌株;B先接种解脂假丝酵母菌株,12 h后再接种解脂耶氏酵母菌株;C同时接种解脂耶氏酵母菌株,解脂假丝酵母菌株。

1.6.2.2 混菌发酵转化适宜的接种比例

将混菌发酵培养基以每瓶30 mL分装于250 mL的锥形瓶中。将适宜扩大培养基培养得到的菌液,调整其浓度,调至OD600 nm=1的菌悬液,以总接种量为8%(分别以V(C.lipolytica)∶V(YL-pox2-12)=1∶10,1∶20、1∶30的比例接入菌液,以等量的无菌生理盐水代替菌悬液作空白对照,28℃振荡(200 r/min)培养72 h,检测GDL的产量。以上每个试验设置3个平行试验,并重复3次。

2 结果与分析

2.1 酵母降解酯类及生物量测定

为了观察解脂耶氏酵母G3与解脂假丝酵母CICC31223转化培养基中酯含量的变化,将2种菌株以相同浓度,接种到相同培养基中,每隔12 h取样测总酯含量。结果发现解脂假丝酵母处理后总酯含量呈下降趋势,而解脂耶氏酵母总酯含量基本不变,说明解脂假丝酵母能够更好地利用油脂(图1),但是该菌株GDL产量很低(结果见下文)。生物量测定结果表明,24 h之前,2株菌的生长速率相同,但是在24 h之后解脂耶氏酵母的生长速率较低(图2),可能是因为解脂耶氏酵母细胞生长受到发酵过程产生的内酯抑制。


图1 转化过程中总酯的变化
Fig.1 Changes in total ester during conversion


图2 转化培养基中酵母菌株生物量的变化
Fig.2 Growth of yeast strain in the fermentation medium

2.2 基因工程菌株的构建

2.2.1 基因工程菌的分子鉴定

构建过表达GDL合成的限速酶酰基辅酶A氧化酶pox2基因的解脂耶氏酵母基因工程菌,获得259株转化子,提取转化子基因组,利用引物对F1/R1通过PCR扩增潮霉素基因片段,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,条带大小与预期相符图3-a。经分子鉴定获得5个解脂耶氏酵母基因工程菌株,编号YL-pox2-10、YL -pox2-11、YL-pox2-12、YL-pox2-13、YL-pox2-136。为了验证转化子同源重组片段的插入位点,利用TAIL-PCR进行鉴定。设计3个特异性嵌套引物与5个简并引物,引物序列(表2),进行3轮PCR,YL-pox2-12工程菌株的TAIL-PCR凝胶电泳结果图3-b,所得到的目的条带切胶回收、测序。结果表明成功构建了解脂耶氏酵母pox2基因过表达菌株。

a-F1/R1引物;b-YL-pox2-12 TAIL-PCR验证结果
图3 转化子验证
Fig.3 Transformants validation注:a图中:M-Marker;1、2-以野生型基因组为模板的阴性对照;3~7-转化子;b图中1、4、7、10、13-特异性引物SP1分别与简并引物LAD1-LAD5的扩增结果;2、5、8、11、14-特异性引物SP2分别与简并引物LAD1-LAD5的扩增结果;3、6、9、12、15-特异性引物SP3分别与简并引物LAD1-LAD5的扩增结果。

2.2.2 酵母菌株单菌发酵转化生产γ-癸内酯的结果

Y.lipolytica G3、C.lipolytica CICC31223菌株以及获得的5株解脂耶氏酵母pox2基因过表达工程菌,以蓖麻油酸作为底物,进行单菌发酵转化生产GDL的研究。工程菌YL-pox2-10、YL-pox2-11、YL-pox2-12、YL-pox2-13、YL-pox2-136的GDL产量均比出发菌株高,其中YL-pox2-12产量最高,达1.5 g/L,较出发菌株GDL产量提高了2.2倍,差异显著(P<0.05)(图4),结果表明pox2基因的过表达能显著提高GDL转化,显示出该基因的应用潜力。

2.3 解脂耶氏酵母培养条件与混合菌株发酵的适宜条件

2.3.1 通过添加餐厨废弃油脂培养解脂耶氏酵母

为了降低工业化生产GDL的成本以及废物再利用,用餐厨废弃油脂代替完全培养基中的部分葡萄糖和酵母提取物,在不同营养物培养基中培养12 h后,观察酵母积累的变化情况。M6为完全培养基,M4中不含葡萄糖。将M6中的葡萄糖从20 g/L降到12.5 g/L,酵母提取物从10 g/L降到5 g/L得到培养基(M5),此时培养酵母生物量为1.02,比M6中略低。在M5的基础上,添加不同浓度的餐厨废弃油脂(餐厨废弃油脂含量M3600 nm平均为1.18,与完全培养基中获得的生物量相当。其中添加废弃油脂的处理M3的酵母生物量显著高于M5(P<0.05,差异显著)(图5)。结果表明,添加餐厨废弃油脂替代部分培养基中的营养成分,可以获得与完全培养基相当的解脂耶氏酵母生物量。因餐厨废弃油脂的成本显著低于葡萄糖和酵母提取物,采用这一配方和策略进行GDL生产,能够大幅降低生产成本,利于工业化规模生产。


图4 酵母菌株转化蓖麻油酸生产γ-癸内酯
Fig.4 Yeast strain transforming ricinoleic acid intoγ-decalactone注:WT-Y.lipolytica G3;CL-C.lipolytica;10-YL-pox2-10;11-YL-pox2-11;12-YL-pox2-12;13-YL-pox2-13;136-YL-pox2-136,是Y.lipolytica过表达pox2基因得到的基因工程菌。*代表差异显著(P<0.05),**代表差异极显著(P<0.05)。下同。


图5 不同培养基对酵母生长的影响
Fig.5 Effect of different media on yeast growth

2.3.2 不同酵母菌株的最适接种方式

为了提高解脂耶氏酵母和解脂假丝酵母混菌发酵GDL产量,研究了2株酵母的接种方式。使用混菌发酵转化培养基,以餐厨废弃油脂代替部分葡萄糖、酵母提取物,蓖麻油作为底物,试验设计了A、B、C三种不同的接种方式,结果表明B为最适的接种方式,即先接种解脂假丝酵母,12 h后再接种解脂耶氏酵母YL-pox2-12,能将油脂降解成能被YL-pox2-12利用的脂肪酸,将其转化为GDL,B的GDL产量显著高于其他2种方式(P<0.05)。当同时接种或先接种YL-pox2-12时,转化生产GDL的产量基本相同(图6)。


图6 不同接种方式对混菌发酵生产γ-癸内酯的影响
Fig.6 Effect of different inoculation methods on theproduction of γ-decalactone by mixed fermentation

2.3.3 混菌发酵转化蓖麻油生产GDL适宜接种比例的确定

研究表明不同解脂耶氏酵母菌株产生的脂肪酶活性不同,可应用于食品、油脂等工业化生产,但有的不能转化生产GDL[13]。为了充分利用2株酵母各自的优势,将高产GDL工程菌株YL-pox2-12和解脂假丝酵母CICC31223进行混菌培养,通过餐厨废油脂的高效利用,产生生物量较多的解脂耶氏酵母再进行GDL转化。在含餐厨废弃油脂和蓖麻油两种碳源的发酵培养基中,利用混合菌株发酵生产GDL。设置了2种菌3个不同比例的试验梯度,相同菌体浓度的解脂假丝酵母和解脂耶氏酵母菌液体积比为 1∶5、1∶10、1∶20,进行同时接种。结果发现当接菌比例为1∶10时,为最适接种比例,转化废油脂生成GDL的产量为0.15 g/L,而工程菌株YL-pox2-12单独在该发酵转化培养基中的生成GDL的产量为0.08 g/L。因此,混菌发酵效果比单菌好,对混菌比例进行差异显著性分析,1∶5与1∶10这两种比例在P值为0.05水平上,差异显著(图7)。结果表明解脂假丝酵母CICC31223能提高底物废弃油脂的分解效率,也获得了足够量的解脂耶氏酵母生物量进行GDL转化。


图7 不同接种比例对混菌发酵生产γ-癸内酯的影响
Fig.7 Effect of different inoculation ratios on the productionof γ-decalactone by mixed fermentation

3 结论

微生物转化法生产天然GDL面临的主要问题是工业化生产的成本高。这可以通过开发廉价的微生物发酵原料、菌种改造、改进发酵及转化工艺等方面进行改善。

本研究探索利用餐厨废弃油脂作为部分碳源,成功培养解脂耶氏酵母菌株并进行GDL转化生产。采用混合菌株发酵有效利用废弃油脂作为微生物生长的碳源,并转化生产GDL。初步发现混菌发酵的最适条件为:解脂假丝酵母G3∶解脂耶氏酵母CICC31223为1∶10,先接种解脂假丝酵母菌株培养12 h后再接种解脂耶氏酵母。本研究获得pox2基因过表达的解脂耶氏酵母工程菌株YL-pox2-12,摇瓶发酵转化生产GDL产量达 1.5 g/L,是原始菌株的2.2倍,显示出良好的应用前景。

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Biotransformation of γ-decalactone from kitchen waste oil by yeasts

WANG Rongxia,ZHU Tingheng*,WANG Kun

(College of Biotechnology and Bioengineering,Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014,China)

ABSTRACT In order to reduce the cost of industrial production of γ-decalactone (GDL), the feasibility of kitchen waste oil as carbon sourcewas studied. Equivalent biomass of Yarrowia lipolytica in complete medium was gained after 12 h cultivation under the optimized medium consisted of 12.5 g/L glucose, 5 g/L yeast extract and 6 g/L kitchen waste oil. Engineered Y. lipolytica overexpressing acetyl-CoA oxidase gene pox2 produced 1.5g/L of GDL from ricinoleic acid was, which was 1.2 times higher than that of parent strain. Y. lipolytica CICC31223 with high lipase-producing ability was co-cultured with the engineered strain for efficient degradation of waste oil and transforming castor oil into GDL. The optimal production conditions were determined as follows: inoculation ratio of Y. lipolytica CICC31223 to Y. lipolytica was 1∶10 (V/V), Y. lipolytica was inoculated after culturing Y. lipolytic CICC31223 for 12 h at 28 ℃ at 200 r/min. It was found that the level of GDL reached 0.15 g/L at above optimal conditions and it was significantly higher than single culture production (0.08 g/L). The results suggested that the kitchen waste oil is an economical carbon source and producing GDL by mixed fermentation of yeasts has great industrial application prospects.

Key words kitchen waste oil; Yarrowia lipolytica; Candida lipolytica; γ-decalactone; TAIL-PCR

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.020676

第一作者:硕士研究生(朱廷恒副教授为通讯作者,E-mail: thzhu@zjut.edu.cn)。

基金项目:浙江省自然科学基金项目(YL18C140005)

收稿日期:2019-03-27,改回日期:2019-05-07