纳豆多糖的理化性质及结构分析

杨文丽,杨波*,杨光

(上海理工大学 医疗器械与食品学院,上海, 200093)

摘 要 对纳豆多糖各理化成分的含量进行测定,采用高效液相色谱及气-质联用色谱分析分子质量和单糖组成,并经傅立叶红外光谱测定纳豆多糖的官能团以及刚果红实验检测其空间结构。结果表明,纳豆多糖中总糖66.01%,蛋白质1.12%;糖醛酸及分别占2.79%、1.57%;纯化后发现,纳豆多糖为单一组分,分子质量为11.53 kDa,单糖组成及摩尔比为岩藻糖∶木糖醇∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.04∶1.53∶1.57∶1.19∶4.68;红外光谱分析出其具有多糖的特征吸收峰,刚果红实验表明纳豆多糖具有三股螺旋结构。

关键词 纳豆多糖;理化性质;分离纯化;单糖组成;结构分析

纳豆中含有丰富的营养物质,也具有较高的药用价值,不仅氨基酸组成与液态奶类似[1],其中含有的低聚糖和粗多糖对肿瘤、肝炎、心血管、抗衰老等也有独特的生物活性。多糖特殊的生物活性源自于其复杂的空间结构,例如糖醛酸是体现多糖活性的重要部分[2],也是构成肝素、硫酸软骨素、透明质酸等高活性物质的成分;而硫酸根含量不同的多糖其抗病毒和抗凝活性也有区别[3]。近年来关于纳豆的研究主要集中在纳豆激酶等蛋白质方面,而纳豆多糖的抗氧化、改善免疫学机制以及提高免疫力的作用虽然已经被证实[4-6],但其组成成分及分子结构却尚未被研究。即使多糖具有较高的生理活性及功能作用,若没有对其结构、作用机理及毒理作用进行探究,便不能被加工利用。本研究对纳豆中提取的纳豆多糖的结构类型进行分析,既可以避免纳豆的不良风味,还能保留其对人体有益的功能性成分,旨在为制作保健品或药品原料的筛选供给多种结构类型的化合物,也为植物多糖的进一步开发利用提供一定的实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料

纳豆多糖:本实验室提取[4]

NH4HCO3、CuSO4、K2SO4,国药化学试剂有限公司;咔唑,上海展云化工有限公司;半乳糖醛酸、三氯乙酸,国药化学试剂有限公司;BaCl2、甲醇,宜兴市第化学试剂厂;Sephadex G-75凝胶,上海维塔;KBr(光谱纯),天津天光光学仪器有限公司;刚果红,Macklin;HCl、四硼酸钠、明胶等,均为分析纯。

1.2 仪器

WFJ 7200可见分光光度计,优尼柯仪器有限公司;KDN-1凯氏定氮仪,上海雷磁创益仪器仪表有限公司;DHG-9203A鼓风干燥机,上海一恒科学仪器有限公司;Waters 2659高效液相凝胶色谱仪,ThermFisher;LCQDECAXPMAX型质谱仪,美国Thermo Finigan;I3X酶标仪,美谷分子仪器有限公司;NICOLET5700红外光谱仪,美国热电公司。

1.3 方法

1.3.1 总糖含量测定

采用苯酚-硫酸法[7]

1.3.2 蛋白质含量测定

采用凯氏定氮法[8]

1.3.3 糖醛酸含量测定

参照赵鹤鹏等[9]的方法:

标准曲线制作:分别取质量浓度为1×10-4 g/L的半乳糖醛酸溶液(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL)加入洗净并烘干的试管中,补蒸馏水至1 mL。将各试管在冰水浴中加入四硼酸钠-硫酸溶液(0.717 g四硼酸钠溶解于150 mL浓H2SO4)5 mL,摇匀,沸水浴10 min,冷却后加入0.2 mL的0.15%的咔唑溶液,继续沸水浴10 min并冷却,在最大吸收波长处测定吸光度值,以半乳糖醛酸浓度为纵坐标,吸光度值为横坐标绘制标准曲线。样品测定同标曲。

最大吸收波长的确定:以上述不加半乳糖醛酸溶液的试管做空白,并利用加入0.5 mL半乳糖醛酸溶液的试管在340~700 nm进行紫外扫描,绘制其吸光度值曲线,其中吸光度值最大者为糖醛酸的最大吸收波长。

含量测定

样品中提取[10]:准确称取样品0.05 g,加入1 mol/L的HCl 2 mL,摇匀后密封,105℃高温提取3 h。冷却后用1 mol/L的HCl溶液定容至50 mL,测定方法同标曲。

标准曲线绘制[11]:分别取不同体积的K2SO4-HCl溶液于试管中,并补充HCl溶液至200 μL。向各试管中加入3.8 mL 30 g/L的三氯乙酸溶液及1 mL氯化钡-明胶溶液。摇匀后静置15~20 min,在360 nm处测定吸光值。对照组中为明胶溶液替换为氯化钡-明胶溶液。以K2SO4质量浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.5 纳豆多糖的凝胶过滤层析

通过改良王龙艳[12]的层析方法,采用Sephadex G-75凝胶层析柱(1.5 cm×90 cm)对纳豆多糖进行分离纯化。连接蠕动泵和收集器,将凝胶进行溶胀、装柱、平衡24 h,以0.2 mol/L NH4HCO3为洗脱液[13],纳豆多糖浓度为10 g/L,经0.45 μm微孔滤膜过滤后上样。洗脱条件为上样体积5 mL,流速0.3 mL/min,每10 min收集1管。洗脱结束后,将收集到的多糖溶液进行浓缩、透析、冻干可得纯品纳豆多糖。

1.3.6 纳豆多糖分子质量的测定

采用高效液相色谱法[14]测定纳豆多糖的重均分子量,检测器为示差折光仪。不同分子质量的右旋糖酐(5.3、9.8、13.1、36.8、64.7 kDa)为标准品,以保留时间为横坐标,以lg Mw为纵坐标,绘制标准曲线[15]

色谱条件:Shodex OHpak SB-804HQ色谱柱;以0.1 mol/L NaNO3,含0.03% NaN3溶液为流动相,样品浓度为1 g/L;流速为0.5 mL/min,进样量20 μL,检测时间为60 min,柱温为室温。

1.3.7 单糖组成的测定

采用气-质联用色谱法检测纳豆多糖单糖组成。

多糖的水解[16]:精密称取纳豆多糖0.003 0 g置于梨形瓶中,加入0.7 mL蒸馏水和0.3 mL TFA溶液,密封梨形瓶口并剧烈振荡使溶液充分混匀,120 ℃下水解6 h,冷却后加入1 mL甲醇在60 ℃下减压旋干,并反复3次。

水解物的衍生:向水解后的样品中加入30 mg盐酸羟胺和0.5 mL吡啶,振荡溶解后90 ℃氧化30 min,冷却后再加入1 mL乙酸酐,再次90 ℃氧化30 min。向溶液中加入1 mL的二氯甲烷和3 mL蒸馏水并剧烈振荡。离心分层除去上层水相,反复3次。除去溶液中水分,吸取上层清液,过0.22 μm有机滤膜后待测。以7种纯品单糖作为对照。

1.3.8 红外光谱

参考马小双等[17]的测定方法,取2 mg纳豆多糖样品及200 mg干燥的KBr放入玛瑙研钵中,在高温干燥条件下将其混匀并研细。将混合物压成0.3~0.5 mm的透明薄片,在400~4 000 cm-1红外波长范围内进行扫描,观察并分析谱峰情况。

1.3.9 刚果红实验

采用改良后曾婷等[18]的实验方法,称取纳豆多糖样品20 mg于试管中,再加入1 mL蒸馏水和80 μmol/L刚果红溶液1 mL,充分混匀后加入NaOH,使各管中NaOH终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L,并用紫外全波段扫描,记录在不同NaOH浓度下的最大吸收波长。

2 结果与分析

2.1 纳豆多糖理化性质的分析

2.1.1 总糖

以葡萄糖含量为横坐标,吸光度值(490 nm)为纵坐标回执标准曲线,所得回归方程为Y=5.009 8X+0.016 3,且相关系数R2=0.998 8,表明葡萄糖含量与其吸光度值有良好的线性关系,可用于纳豆多糖样品总糖含量的计算。纳豆多糖溶液所得吸光度值平均值为0.347,代入回归方程并计算得纳豆多糖总糖含量约为66.01%。李宏睿等[19]利用超声波辅助提取大豆多糖,所提取的大豆多糖纯度为96.58%,与此相比较,实验所得纳豆总糖的含量较低,原因可能是超声波的空化作用及高振动频率会加速植物多糖的溶出以及蛋白质结构的伸展,提高了蛋白质的去除率及大豆多糖的提取率;另一方面是因为发酵过程中纳豆菌的生长繁殖对总糖的消耗,降低了纳豆多糖的含量。

2.1.2 蛋白质含量

称取纳豆多糖样品1.00 g,经消化和蒸馏后,滴定消耗0.1 mol/L HCl体积的平均值为1.67 mL,计算得蛋白质含量为1.12%。

2.1.3 糖醛酸含量

半乳糖醛酸与咔唑试剂在H2SO4中的反应物呈紫红色,颜色深浅与半乳糖醛酸的含量成正比,可通过紫外分光光度计进行比色定量。用不同的仪器与试剂测定半乳糖醛酸时,可能会导致最大吸光值的不同。由图1可知,咔唑-硫酸法检测半乳糖醛酸吸光度值的最大波长为510 nm。以半乳糖醛酸浓度为横坐标,吸光度值(510 nm)为纵坐标进行线性回归,所得回归方程为Y=4.926 4X-0.007 7,且相关系数R2=0.998 8。纳豆多糖样品经平行测定得吸光度值平均值为0.451,计算纳豆多糖中糖醛酸的含量约为2.79%。夏永刚等[20]探究麻黄多糖中的糖醛酸含量时发现,咔唑-硫酸法操作简便、灵敏度高,可用于多糖的构效关系和生物学活性研究。


图1 半乳糖醛酸标准品最大吸收波长测定曲线
Fig.1 The maximum absorption wavelength ofGalacturonic acid standard

不同浓度梯度的半乳糖醛酸所测得标准曲线如图3所示。

含量

带有的多糖具有良好的抗病毒、抗肿瘤、提高免疫力及抗凝活性作用,且的含量也在一方面决定了多糖生理功能的强弱[21]。多糖经盐酸高温水解后,游离出的与加入的Ba2+在明胶溶液中合成的悬浮液,悬浮液的混浊程度与硫酸盐含量成正比,用比浊法即可测定多糖中的含量。以K2SO4含量为横坐标,吸光度值(360 nm)为纵坐标绘制标准曲线,所得回归方程为Y=1.870 6X+0.008 2,相关系数R2=0.998 9,可用于测定纳豆多糖的含量。经计算,纳豆多糖中含量为1.57%。纳豆多糖经纳豆菌发酵降解,游离的增多,在提取过程中将会损失一部分。徐述明等[22]对猪苓多糖和燕航等[23]对香菇多糖的硫酸酯化的研究中发现,多糖中硫酸基团含量增加,其抗氧化及非特异性免疫能力也大大增强。

2.2 纳豆多糖的纯化

纳豆多糖经缓冲液的溶解后进入层析柱,在流动相0.2 mol/L NH4HCO3的带动下根据分子质量的大小依次流出色谱柱来进行分级分离。洗脱液经收集器收集后,用苯酚-硫酸法检测其吸光度值,并绘出洗脱曲线。当洗脱曲线峰形较好且对称时,说明多糖经洗脱分离后纯度较高。由图2可知,纳豆多糖在凝胶柱的分离中呈现一个较对称的峰,说明纳豆多糖为单组分。收集出峰管中的多糖溶液进行浓缩、透析、冻干,可得纯品纳豆多糖。石浩等[24]用DEAE-纤维素对水溶性大豆多糖进行梯度洗脱,得出水溶性大豆多糖有3个主要组分,说明大豆多糖中较大分子的糖类经纳豆菌发酵后成为了分子质量较小且单一的组分。采用Sephadex G-75凝胶柱纯化的纳豆多糖洗脱曲线如图2所示。


图2 纳豆多糖在Sephadex G-75凝胶柱上的洗脱曲线
Fig.2 The elution curve of natto polysaccharideson Sephadex G-75 column

2.3 纳豆多糖的分子质量分析

根据凝胶色谱柱的尺寸排阻特性,多糖经色谱柱洗脱时的保留时间与分子质量的对数呈负相关。用已知分子质量的标准多糖在合适的色谱条件下测出对应的保留时间,并做出其与分子质量对数的标准曲线,在相同条件下测出多糖的保留时间,则可根据标准曲线计算出多糖的分子质量。右旋糖酐标准曲线方程为Y=-0.025 42X+12.836,且相关系数为R2=0.993 5,保留时间与分子质量对数有良好的对应关系。由图3可知,纳豆多糖检测到了3个对称峰,中间是一个很好的对称峰形,保留时间为34.516 7 min。主峰前后2个峰形强度较弱,说明2种分子质量的多糖浓度较低。根据标准曲线方程,代入纳豆多糖的保留时间计算得纳豆多糖主要组分分子质量量为11.53 kDa。何喜珍等[25]在对大豆多糖不同的降解条件下得到分子质量在21~550 kDa的大豆多糖,纳豆多糖组分单一且分子质量较小,是因为纳豆菌在发酵过程中对大豆多糖的分解转化,使多糖部分糖苷键断裂,发生降解,导致分子质量变小。

在相同条件下,纳豆多糖所测得的保留时间曲线如图3所示。


图3 纳豆多糖的保留时间曲线
Fig.3 Retention time curve of natto polysaccharide

2.4 单糖组成分析

气相色谱法可以对化合物进行有效的定性分析,但不适用于复杂的有机物,而质谱法可以对有机化合物进行定量分析,两者结合则能对复杂有机化合物进行高效的定量和定性分析。单糖标准品图谱如图4所示,纳豆多糖单糖组成的气-质联用色谱分析图见图5。由图5可知,纳豆多糖中单糖已完全分开。相比于标准品图谱,纳豆多糖中已知单糖为岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,编号为h的单糖出峰时间在木糖与甘露糖之间,为木糖醇[26],各单糖摩尔比为岩藻糖∶木糖醇∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.04∶ 1.53∶ 1.57∶ 1.19∶ 4.68。赖富饶等[27]采用糖醇乙酸酯衍生法测定豆皮多糖和豆渣多糖的单糖组成发现,豆皮多糖以甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖为主,豆渣多糖以半乳糖和阿拉伯糖为主,其他种类的单糖皆有,但含量较低。由此可知,纳豆菌可能会作用于单糖官能团,使其结构改变。

a-鼠李糖;b-岩藻糖;c-阿拉伯糖;d-木糖;e-甘露糖;f-葡萄糖;g-半乳糖
图4 单糖标准品色谱图
Fig.4 The GC-MS chromatogram of monosaccharide standard


图5 纳豆多糖中单糖组成色谱图
Fig.5 Chromatogram of monosaccharide compositionin natto polysaccharide

2.5 红外光谱分析

多糖等大分子有机物中,官能团的振动频率与红外光相当。当多糖被红外光照射时,各官能团在红外光谱图上会出现不同的吸收峰,根据吸收峰所处的红外光波段,可推测出多糖具有的官能团种类。如图6所示的红外光谱图中,3 393.56 cm-1宽峰是O—H伸缩振动峰;2 931.70 cm-1的一组峰是糖类C—H键伸缩振动;1 636.52 cm-1为—COOH中的CO吸收峰;1 419.65 cm-1为C—H的弯曲振动峰;1 260.95 cm-1为C—H的变角振动;1 061.74 cm-1是C—O的伸缩振动峰;927.44 cm-1α-吡喃环的弯曲振动特征峰;766.6 cm-1处是D-葡萄糖吡喃糖环C—O—C的振动吸收峰;688.58 cm-1峰为醇或酚O—H键的面外弯曲振动。在3 393.56、2 931.70、1 419.65 cm-1处即可初步判断所测化合物为糖类化合物。对比何喜珍所得不同分子质量大豆多糖的红外光谱图,纳豆菌发酵大豆多糖后,纳豆多糖中官能团的种类基本没有发生变化;尹艳[28]利用微波提取的水溶性大豆多糖在3 437 cm-1处出现单独吸收峰,为N—H的伸缩振动峰,由此推测大豆多糖中含有游离氨基,而纳豆多糖中没有。


图6 纳豆多糖红外光谱图
Fig.6 IR speetra of the natto polysaeeharid

2.6 空间结构的分析

刚果红是一种生物染色剂,能够与多糖中的单股螺旋结构结合,结合成的复合物的最大吸收波长将随着单股螺旋结构浓度的升高而变大。在一定的碱性体系中,多糖中的三股螺旋结构发生解聚,使单股螺旋结构的浓度增大,反应溶液的最大吸收波长也会发生变化[29]。由图7可知,相比于刚果红本身平缓的变化趋势而言,纳豆多糖络合物的最大吸收波长随着NaOH浓度的增大而降低,并且在NaOH浓度为0.3 mol/L时急剧下降,说明纳豆多糖中的单股螺旋结构增多,与刚果红形成的络合物的最大吸收波长的特殊变化证明纳豆多糖具有三股螺旋结构。


图7 纳豆多糖与刚果红混合碱溶液最大吸收波长的变化
Fig.7 Changes in absorption wavelength maximum of mixtureof Congo red and natto polysaeeharid

3 结论

近年来,多糖在生物学上的重要意义,尤其是在医药学上的重要意义决定了多糖研究的迅速发展。本研究结果表明,纳豆多糖中总糖含量66.01%,蛋白质含量1.12%(质量分数),对糖醛酸含量(2.79%,质量分数)和含量(1.57%,质量分数)的测定也可为纳豆多糖进一步增强其抗氧化、提高免疫力的改性研究提供理论基础。Sephadex G-75凝胶柱层析发现纳豆多糖为单组分,高效液相色谱法测定纳豆多糖主要组分分子质量为11.53 kDa;气相色谱-质谱联用分析出单组分的单糖组成及摩尔比为岩藻糖∶木糖醇∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.04∶ 1.53∶ 1.57∶ 1.19∶ 4.68;傅立叶红外光谱鉴定其具有糖类化合物的特征吸收峰;刚果红实验得出纳豆多糖具有三股螺旋结构。本研究发现纳豆菌发酵纳豆多糖,可以降解大分子糖类,甚至改变单糖官能团,为未来对于人为诱导微生物、改善大分子物质的结构组成,提供可能的研究方向。

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Physicochemical properties and structural analysis of natto polysaccharides

YNAG Wenli, YNAG Bo*, YANG Guang

(Shcool of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

ABSTRACT Natto polysaccharide is one of the main functional substances in natto. The content of physicochemical components of natto polysaccharides were determined. Meanwhile, the molecular weight and monosaccharide composition were analyzed by high performance liquid chromatography and gas chromatography-mass spectrometry. The functional groups and spatial structure were determined by Fourier transform infrared spectroscopy and the Congo red test. The results showed that percentage of each component in natto polysaccharides was 66.01% of total sugar, 1.12% of protein, 2.79% of uronic acid and 1.57% of sulfate. After purification, natto polysaccharides was found to be a single component, with molecular weight of 11.53 kDa. The molar ratio of fucose∶xylitol∶mannose∶glucose∶galactose was 1.04∶1.53∶1.57∶1.19∶4.68. In addition, infrared spectrum analysis showed that natto polysaccharides had characteristic absorption peak of polysaccharides, and the Congo red experiment revealed that natto polysaccharides had triple helix structure. The in-depth analysis of the physicochemical properties and structure of natto polysaccharides can provide a theoretical basis for the selection of functional plant polysaccharides.

Key words natto polysaccharide;physicochemical properties; separation and purification; monosaccharide composition; structural analysis

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.020681

第一作者:硕士研究生(杨波副教授为通讯作者,E-mail: yangbo6899@126.com)。

收稿日期:2019-03-27,改回日期:2019-06-13