根瘤菌胞外多糖(extracellcer polysaccharides of Rhizobium，REPS)[1-3]是根瘤菌属在生长过程中分泌的胞外多糖，是由一定数目的重复单位聚合而成的不均一微生物多糖。微生物多糖具有广泛的免疫调节功能，如具有促进S180荷瘤小鼠的白细胞和淋巴细胞增生的作用[4]、抗氧化作用[5-7]和免疫活性[8-11]等。但是跟大多数微生物多糖一样，产量低依然是根瘤菌多糖应用受限的因素之一。近年来，国内外学者对微生物多糖的发酵优化做了大量研究[12-16]，单因素实验和正交实验是优化发酵工艺的基础方法，适用于碳氮源和发酵条件的优化，而对于多因素多水平的大批量实验，通常采用数理统计优化法[17]，如Plackett-Burman设计法、全因子实验法、响应面优化设计法、随机平衡法、正交设计法、均匀设计法等和非数理统计优化法，而众多实验表明Plackett-Burman设计法是最为准确和有效的，实用性强[18-19]。Plackett-Burman法[20]是一种以不完全平衡块为原理的部分析因实验设计法，适用于从众多的考察因素中筛选出最为重要的几个因素，并且快速有效。本研究中，采用Plackett-Burman设计，在众多因素中筛选影响产量的关键因素，进而采用Box-Behnken实验[21]得到最优添加量组合，得到根瘤菌多糖的最适发酵条件，并探究其抗肿瘤活性，为根瘤菌多糖的开发与利用提供理论依据和指导。
1 材料与方法
1.1 实验菌种
Rhizobium NG10 (中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC 10579)，保藏于天津科技大学微生物制药研究室。
1.2 培养基
斜面培养基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 5，琼脂20。种子培养基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 5，pH 6.8～7.0。发酵培养基(g/L)：甘露醇 10，K2HPO4 0.25， MgSO4·7H2O 0.2，酵母提取物 1，NaCl 0.1，pH 6.8～7.0。DMEM培养基：DMEM复合培养基粉末，青霉素100 U/mL，链霉素 100 U/mL，胎牛血清10 %，PBS缓冲液配制，pH 7.4。
1.3 仪器与设备
TGL-16 G台式高速离心机，上海医用分析仪器厂；754 PC紫外-可见光分光光度计，上海菁花科技有限公司；Alpha 2-4 LD plus快速冷冻干燥机，德国chirst公司；HH.CP-T型01A CO2细胞培养箱，上海一恒科技有限公司；SYNEK GY4多功能酶标仪，美国BioTek。
1.4 主要试剂
酵母提取物，英国DXOID公司；胰蛋白胨，英国DXOID公司；酵母膏、酵母浸粉、大豆蛋白胨、蛋白胨(均为分析纯)，北京奥博星生物技术有限责任公司；H3PO4、乙醇、NaCl、KH2PO4、苯酚、浓H2SO4(均为分析纯)：天津化学试剂二厂；葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、果糖、蔗糖、MgSO4·7H2O(均为分析纯)，天津市耀华化工厂；三氯甲烷(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂；正丁醇(分析纯)，天津津东天正精细化学试剂厂；人肝癌细胞株Hep G2，中国科学院上海细胞库；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(均为分析纯)，北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清，美国GIBCO公司。
1.5 实验方法
1.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制
精密称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品10 mg，去离子水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得质量浓度为0.1 g/L得葡萄糖标准溶液。精密量取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL,分别置于具塞试管中加水至1.0 mL，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，置冰水浴中加浓H2SO4 5 mL，摇匀，置30 ℃水浴中保温30 min，取出后冷却至室温，于490 nm测吸光度，绘制标准曲线。
1.5.2 多糖的提取及含量测定
将发酵培养至稳定期的根瘤菌发酵液离心除去菌体，浓缩至一定体积后加入4倍体积无水乙醇于4℃过夜醇沉，取沉淀部分加水复溶，用Sevage法除蛋白，Sevage试剂与多糖溶液的体积比为1∶4，反复除蛋白数次后，分离Sevage试剂，再经乙醇洗涤后，加水复溶，用去离子水透析48 h，然后将多糖溶液在200～400 nm进行全波长扫描，经鉴定260和280 nm处无吸收峰后表明蛋白已除净，收集多糖溶液，采用苯酚-硫酸法测定发酵液中多糖含量。
1.6 发酵培养基的优化
1.6.1 单因素实验
分别以麦芽糖、乳糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇为碳源，质量浓度为10 g/L，其他成分与基础发酵培养基相同，于100 mL/250 mL摇瓶中接种对数期根瘤菌菌液1 %，置于28 ℃ 180 r/min培养箱中振荡培养72 h，按苯酚硫酸法测定多糖含量，每种碳源做3组平行。
在碳源优化的基础上，分别以大豆蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、胰蛋白胨、硫酸铵、酵母提取物为氮源，质量浓度为1 g/L，其余条件相同，发酵结束后测定多糖含量，每种氮源做3组平行。
1.6.2 Plackett-Burman设计实验
根据碳氮源的单因素实验结果，采用SAS Version 8.0.2 软件设计8因素2水平实验方案，采用该方案进行实验，并采用SAS Version 8.0.2 对结果进行分析处理，以筛选培养基各成分中对多糖产量影响最为显著的若干因子。
1.6.3 Box-Behnken设计实验
在PB实验结果基础上，采用SAS Version 8.0.2 软件设计Box-Behnken实验方案，获得最优组合，根据该方案进行实验，针对结果进行分析以获得最优培养基配方。
1.7 体外抗肿瘤[22]实验
将人肝癌细胞Hep G2于DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养至对数生长期。用胰蛋白酶消化处于对数生长期的肝癌细胞Hep G2，稀释细胞浓度至1.0×105个/mL，分别移取150 μL细胞悬液于96孔板中，贴壁培养4 h，加入50 μL不同浓度的多糖溶液(质量浓度分别为20，50，100，200，500和1 000 μg/mL)，分别在培养24和48 h后，加入20 μL MTT试剂(5 g/L)，混匀，于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养4 h，移除孔板中液体，每孔加入200 μL DMSO振荡培养10 min，溶解结晶，于570 nm测吸光值。空白对照组为DMEM培养基，每组实验组均有8个复孔。多糖对肝癌细胞Hep G2的抑制率计算公式(1)如下：
抑制率
(1)
式中：A0为空白组在570 nm处的吸光值，A1为实验组在570 nm处的吸光值。
2 结果与分析
2.1 多糖提取及含量测定
以标准葡萄糖浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，建立的线性回归方程为:y=0.077 3+5.67x(R2=0.995 6)。初始发酵培养基条件下，发酵至稳定期(48 h)时，根瘤菌胞外多糖产量为3.46 g/L。
2.2 发酵培养基优化
2.2.1 单因素实验
对于碳氮源筛选的单因素实验结果如图1和图2所示，不同碳源对多糖产量均有显著性影响(P<0.05)，碳源为麦芽糖时，胞外多糖产量最高为3.62 g/L；大豆蛋白胨、酵母浸粉和酵母膏对多糖产量影响显著(P<0.05)，以大豆蛋白胨作氮源时，胞外多糖产量为4.23 g/L。显然，麦芽糖和大豆蛋白胨为最优碳氮源。
图1 不同碳源条件下根瘤菌产胞外多糖含量
Fig.1 Content of extracellular polysaccharides producedby Rhizobium NG10 with different carbon sources注：与初始发酵培养基相比，*代表P<0.05。下同。
图2 不同氮源条件下根瘤菌产胞外多糖含量
Fig.2 Content of extracellular polysaccharides producedby Rhizobium NG10 with different nitrogen sources
2.2.2 Plackett-Burman设计实验结果
采用PB实验(麦芽糖、大豆蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl和CaCl2 7个因素分别以X1～X7表示，及一个X8虚拟项)，筛选出对根瘤菌发酵所得期望值(Y值)影响显著的因素。其中，各个因素的水平设置及结果如表1所示，对所有实验结果进行一元线性回归分析得多元一次方程： Y=3.89+0.17×X1-0.38×X2+0.23×X3-0.03×X4+0.11×X5+0.14×X6-0.047×X7+0.095×X8。
评价模型的拟合度需要参考决定系数(R2)，R2值越接近1，模型就越能用来预测响应值。该模型的相关系数R2 = 0.973 5(表2)，说明97.35 %的期望值变化可以用这一模型解释，模型拟合度较好。采用常规的F检验方法对模型再次进行分析，可知其线性模型的P值为0.026 9<0.05，说明模型显著可靠，能很好地描述实验因素与响应值间的关系。软件分析得到的回归分析结果如表2所示。可见，各考察因素的重要性依次为X2> X3> X1> X6> X5> X8> X7> X4。其中最显著的3个因素为大豆蛋白胨(X2)，K2HPO4(X3) 和麦芽糖(X1)。
表1 Plackett-Burman实验方案及结果
Table 1 The design matrix and the results of Plackett-Burman design
组别X1X2X3X4X5X6X7X8Y11(30)-1(5)1(0.5)-1(0)-1(0.1)-1(0)1(1.5)14.4321(30)1(15)-1(0)1(0.5)-1(0.1)-1(0)-1(0.5)13.213-1(10)1(15)1(0.5)-1(0)1(0.5)-1(0)-1(0.5)-13.4341 (30)-1(5)1(0.5)1(0.5)-1(0.1)1(0.2)-1(0.5)-14.6851 (30)1(15)-1(0)1(0.5)1(0.5)-1(0)1(1.5)-13.3661 (30)1(15)1(0.5)-1(0)1(0.5)1(0.2)-1(0.5)14.437-1(10)1(15)1(0.5)1(0.5)-1(0.1)1(0.2)1(1.5)-13.368-1(10)-1(5)1(0.5)1(0.5)1(0.5)-1(0)1(1.5)14.399-1(10)-1(5)-1(0)1(0.5)1(0.5)1(0.2)-1(0.5)14.18101(30)-1(5)-1(0)-1(0)1(0.5)1(0.2)1(1.5)-14.2511-1(10)1(15)-1(0)-1(0)-1(0.1)1(0.2)1(1.5)13.2912-1(10)-1(5)-1(0)-1(0)-1(0.1)-1(0)-1(0.5)-13.71
表2 Plackett-Burman设计实验回归分析结果
Table 2 Regression analysis results of Plackett-Burman design experiment
方差来源自由度平方和均方F值P值X110.333 30.333 311.441 60.043 0X211.732 81.732 859.478 20.004 5X310.616 50.616 521.162 40.019 3X410.010 80.010 80.370 70.585 6X510.154 10.154 15.290 60.104 9X610.229 60.229 67.882 10.067 4X710.026 10.026 10.897 00.413 4X810.108 30.108 33.717 30.149 4模型83.211 60.401 413.780 00.026 9误差30.087 40.029 1总离差113.299 0
2.2.3 Box-Behnken设计实验结果
以PB实验设定值为中心点，采用SAS Version 8.0.2软件设计Box-Behnken实验，实验方案如表3所示，进一步优化麦芽糖、大豆蛋白胨、KH2PO4添加量的水平，获得最佳培养基配方。根据该方案进行实验，针对结果进行分析以获得最优培养基配方。采用SAS Version 8.0.2对实验方案及结果进行回归分析，得到多元二次回归方程：Y=4.98+0.13×U1-0.09×U2+0.08×U3-0.25×U1×U1+0.11×U1×U2-0.002×U1×U3-0.71×U2×U2-0.007×U2×U3-0.06×U3×U3。
采用t检验对模型的各项系数进行显著性分析，结果如表4所示。模型决定系数R2为0.980 1，说明98.01 %的期望值变化可以用这一多项式解释。此外，该分析模型P<0.001证明了二次回归模型高度显著。模型的失拟项的F值和P值分别为7.23和0.123 8，证明失拟项不显著。一次项(U1、U2)，二次项(U1U1、U2U2)对响应值的影响高度显著，P<0.05。软件得出最大响应值及其对应U1、U2、U3的编码值，可得根瘤菌(Rhizobium NG10, CICC 10579)最佳培养基配方(g/L)为：麦芽糖22.5，大豆蛋白胨9.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO4 0.41，NaCl 0.1，在此条件下，胞外多糖产量为5.05 g/L，比原始提高了45.95 %。
表3 Box-Behnken实验方案及结果
Table 3 The design matrix and the results of Box-Behnken design
组别U1(麦芽糖)U2(大豆蛋白胨)U3(KH2PO4)Y1-1(10)-1(5)0(0.25)4.042-1(10)1(15)0(0.25)3.7231(30)-1(5)0(0.25)4.0941(30)1(15)0(0.25)4.2150(20)-1(5)-1(0)4.3160(20)-1(5)1(0.5)4.3770(20)1(15)-1(0)4.0580(20)1(15)1(0.5)4.089-1(10)0(10)-1(0)4.39101(30)0(10)-1(0)4.6611-1(10)0(10)1(0.5)4.68121(30)0(10)1(0.5)4.94130(20)0(10)0(0.25)4.94140(20)0(10)0(0.25)4.87150(20)0(10)0(0.25)4.99
2.3 体外抗肿瘤实验
通过体外细胞实验，考察不同给药剂量分别在24与48 h对Hep G2细胞增值抑制的效果，结果如图3所示。
图3 不同浓度根瘤菌多糖对肝癌细胞Hep G2的抑制作用
Fig.3 Antitumor activity(Hep G2) of Rhizobiumpolysaccharide with different concentrations注：与对照组相比，**代表P<0.01；***代表P<0.001。
由图3可知，REPS显示出良好的抗肿瘤活性，在给药浓度≥50 μg/mL时，与空白对照组相比，多糖对肝癌细胞有显著的抑制作用。在一定范围内，REPS对肝癌细胞Hep G2的抑制作用随着多糖浓度的升高而增大，随着剂量、给药时间的增加，细胞增殖能力逐渐降低；在多糖质量浓度达到1 000 μg/mL时，抑制率达到56.74 %。采用MTT法计算IC50值，结果显示给药24 h，REPS对Hep G2的IC50值为624.2 μg/mL，给药48 h，REPS对Hep G2的IC50值为393.3 μg/mL，发现REPS具有良好的抗肿瘤活性。
表4 Box-Behnken设计实验回归分析结果
Table 4 Regression analysis results of Box-Behnken design
方差来源自由度平方和均方F值P值U110.143 10.143 114.848 20.011 9U210.070 30.070 37.295 00.042 7U310.054 40.054 45.649 30.063 4U1U110.236 90.236 924.585 50.004 2U1U210.048 40.048 45.021 60.075 1U1U31<0.000 1<0.000 10.002 50.961 3U2U211.905 21.905 2197.673 30.000 1U2U310.000 20.000 20.023 30.884 5U3U310.016 00.016 01.660 30.253 9模型92.367 50.263 027.293 10.000 9失拟项30.044 10.014 77.233 70.123 8纯误差50.048 10.009 6总离差142.415 7
3 结论
根据单因素实验、Plackett-Burman实验和Box-Behnken实验，得到优化的培养基配方为麦芽糖22.5 g/L，大豆蛋白胨9.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO4 0.41 g/L，NaCl 0.1g/L，在此条件下，最高胞外多糖产量5.05 g/L；在此基础上进行根瘤菌胞外多糖的抗肿瘤活性评价，从体外实验可以看出，根瘤菌胞外多糖REPS对肝癌细胞Hep G2有良好的抑制作用，并且一定范围内存在量效关系。
本文虽然较大程度上提高了根瘤菌NG 10(CICC 10579)的胞外多糖产量，但影响其产量的因素还有很多，对其产糖能力还有待进一步挖掘。近20年来，人们对植物与真菌活性多糖进行了大量研究，并取得较大进展，然而对于细菌活性多糖的研究却较少。根瘤菌胞外多糖的研究前景十分广阔，包括其信号功能，免疫调节功能以及抗肿瘤功能，可以说根瘤菌多糖的价值很高。希望未来对根瘤菌胞外多糖的研究能更进一步，发挥出它在生产及生活中的价值。
[1] GHOSH A C, GHOSH S,BASU P S, et al. Production of extracellular polysaccharide by a rhizobium species from root nodules of the leguminous tree Dalbergia lanceolaria[J]. Engineering in Life Sciences, 2010, 5(4):378-382.
[2] 冯永君,宋未. 根瘤菌胞外多糖的结构与信号功能[J]. 生命的化学, 2000,20(1):33-35.
[3] 钱世钧,雨村明伦,原田笃也. 根瘤菌TISTR386胞外酸性多糖的结构研究[J]. 微生物学报, 1984，24(4):45-54.
[4] CHENG H B, HAN Y, REN S, et al. Studies on isolation and anti-S180 activity of exopolysaccharide from Rhizobium sp.N613[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2008, 43(4):268-272.
[5] WANG X, SHAO C, LIU L, et al. Optimization, partial characterization and antioxidant activity of an exopolysaccharide from, Lactobacillus plantarum KX041[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2017,103:1 173-1 184.
[6] PRIYANKA P, ARUN A B, ASHWINI P, et al. Versatile properties of an exopolysaccharide R-PS18 produced by Rhizobium sp. PRIM-18[J]. Carbohyd Polym, 2015,126:215-221.
[7] 陈艳丽,任盛,魏国琴,等. Rhizobium sp.N613胞外多糖的抗氧化活性[J]. 微生物学通报, 2010, 37(2):234-238.
[8] PAN D, LIU J, ZENG X, et al. Immunomodulatory activity of selenium exopolysaccharide produced by Lactococcus lactis subsp. Lactis[J]. Food and Agricultural Immunology, 2015, 26(2):248-259.
[9] 龙寒,陈盛峰,陈佳,等. 一株产胞外多糖海洋弧菌的分离鉴定及其多糖抗肿瘤活性初步研究[J]. 生物技术通报, 2016,32(12):166-171.
[10] 黄晓波,张建国,韩勇,等. 一种根瘤菌胞外多糖对小鼠免疫功能的影响[J]. 免疫学杂志, 2006, 22(S1):149-150.
[11] 韩勇,黄晓波,董岳峰,等. 根瘤菌N613胞外多糖发酵条件及抗肿瘤作用研究[J]. 微生物学通报, 2007, 34(5):909-913.
[12] GHOSH A C, GHOSH S， BASU, P S. Production of extracellular polysaccharide by a Rhizobium species from root nodules of the leguminous tree Dalbergia lanceolaria[J]. Engineering in Life Sciences, 2010, 5(4):378-382.
[13] 吴迪,袁峰,王国瑞,等. 基于通气量调控的灵芝菌丝体胞内多糖发酵工艺优化[J]. 食用菌学报,2019,26(1):35-40.
[14] 王萧玉竹,董晋军,许国超,等. 可得然胶生产菌种的筛选及发酵条件优化[J]. 食品与生物技术学报，2018,37(7):732-738.
[15] CHAMBON R, PRADEAU S, FORT S, et al. High yield production of Rhizobium NodB chitin deacetylase and its use for in vitro synthesis of lipo-chitinoligosaccharide precursors[J]. Carbohydrate Research, 2017, 442:25-30.
[16] 戎蓉,欧杰. 响应面法优化普鲁兰多糖发酵工艺条件[J]. 山东农业大学学报(自然科学版), 2016, 47(5):659-663.
[17] 褚以文. 微生物培养基优化方法及其OPTI优化软件[J]. 国外医药(抗生素分册), 1999,20(2):58-60.
[18] 赵刚,刘振华,辛明杨,等. Plackett-Burman设计及响应面优化蓝莓中总黄酮的超声提取工艺[J]. 食品工业, 2017,38(10):22-27.
[19] 王云龙,刘松,堵国成,等. 基于人工神经网络的L-天冬酰胺酶发酵培养基优化[J]. 食品与发酵工业, 2018, 44(8):27-33.
[20] CHIEF E I, DEMAIN A L, ESITORS J E D, et al. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology[M]. Washington DC: American Society for Microbiology, 1986.
[21] BORKOWSKI J J. Minimum, maximum, and average spherical prediction variances for central composite and Box-Behnken designs[J]. Communications in Statistics-Theory and Methods, 1995, 24(10):2 581-2 600.
[22] 于士军. 蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖活性和结构的研究[D].合肥： 安徽农业大学, 2012.