乳杆菌不仅能够通过发酵提高食品的营养价值,改善食品风味[1-2],而且能够调节肠道菌群、保持微生态平衡、增强机体免疫作用[3-4]。目前乳杆菌的研究大多关注宿主的生理、疾病以及菌群等的变化,对于其在胃肠道中的分布、数量、运动及它们的定植情况缺乏系统性、针对性的机理研究。王晶等[5]的研究表明,无法真正区分进入肠道的菌属于内源菌还是外源菌,因此这在一定程度上限制了对作用机理的深入研究。
关于菌株定植能力的研究,一般选择小鼠、人体、模拟反应器等实验模型[6-8],灌胃或饮食的方式摄入,收集粪便或肠道内容物后通过平板培养[9]、荧光原位杂交[10]和实时荧光定量PCR[11],但这些技术存在着操作繁琐、准确度低或费用高等缺陷。近年来,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为一种理想的活体荧光标记分子,越来越多地被用于活细胞或微生物的定位、结构和动力学的研究[12]。GFP已经在许多细菌中完成了转化,王晶等[13]利用GFP追踪了乳酸乳球菌WH-C1在小鼠肠道内的定植情况;YU等[14]通过GFP标记发现德氏乳杆菌D17嵌入在黏液层中,局部接近肠道的上皮细胞;GEOFFROY等[15]构建了含有GFP的组成型和Nisin诱导型的质粒并导入植物乳杆菌WCFS1中,用来研究WCFS1在肠道内的定植与分布。
本实验室从发酵食品中分离得到1株有明显益生作用的植物乳杆菌CCFM8610,动物实验发现CCFM8610处理可有效降低肠道镉的吸收,减少组织中镉的积累,减轻肾脏和肝脏的氧化应激[16]。为进一步研究该菌株在肠道内的定植规律,本实验室成功对包括CCFM8610在内的4株植物乳杆菌进行GFP荧光标记。本研究对这4株植物乳杆菌的出发菌株和重组菌株的生物学特性进行了比较研究,为植物乳杆菌在肠道中分布和定植规律的研究奠定基础。
试验用植物乳杆菌分离自发酵食品和健康人粪便,保藏于江南大学食品生物技术菌种保藏中心;所用菌株、质粒及引物见表1。
MRS培养基:蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母粉5 g,葡萄糖20 g,K2HPO4 2 g,柠檬酸二铵2 g,乙酸钠2 g,吐温80 1 mL,MgSO4·7H2O 0.5 g,MnSO4·4H2O 0.25 g,蒸馏水1 000 mL,pH 6.2~6.4,固体培养基添加1.5%的琼脂粉,在115℃灭菌20 min。培养重组菌株的培养基中,添加终质量浓度为10 μg/mL的氯霉素,以0.22 μm无菌滤膜过滤。
TIAN prep Mini Plasmid kit聚合酶、TaqDNA聚合酶,上海科晴生物科技有限公司;所有抗生素类试剂、胃蛋白酶,生工生物工程(上海)股份有限公司;胆盐,英国Oxoid公司;其他实验用化学试剂,国药集团化学试剂有限公司。
表1 本研究所用菌株、质粒及引物
Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study
名称文中缩写描述参考菌株8-3P1从粪便中分离的野生型菌株本实验室JS-NJ-PK-4-G-1P2从粪便中分离的野生型菌株本实验室HuBei-32-L-1P3从粪便中分离的野生型菌株本实验室CCFM 8610P4从发酵食品中分离的野生型菌株本实验室8-3-GP1GGFP基因标记的重组菌株本实验JS-NJ-PK-4-G-1-GP2GGFP基因标记的重组菌株本实验HuBei-32-L-1-GP3GGFP基因标记的重组菌株本实验CCFM 8610-GP4GGFP基因标记的重组菌株本实验质粒PCD4033-GFP无GFP在plhd下游作为报告基因[17]引物GRGRACTCTGCAGATGAGCAAAGGAGAAGAAC[18]GFGFGGTATCGATAAGCTTGATATCGAAT[18]
PBS缓冲液:Na2HPO4 2.13 g,NaCl 0.8 g,KCl 0.2 g,KH2PO4 0.2 g,搅拌溶解后,调pH值到7.4,定容至1 L,在115℃ 灭菌20 min,配方参考文献[18]。
乳杆菌感受态细胞制备和电转化溶液:溶液I:136.7 g山梨醇,0.1 g甘氨酸,用MRS培养基定容至1 L,115℃灭菌20 min;溶液Ⅱ:342.3 g蔗糖,0.711 g MgCl2·6H2O,去离子水定容至1 L,115℃灭菌20 min;复苏液(SMRS):136.7 g山梨醇,1.11 g CaCl2,9.52 g MgCl2,用MRS培养基定容至1 L,115℃灭菌20 min,配方参考文献[18]。
模拟胃液(simulated gastric fluid,SGF)和模拟肠液(simulated intestinal fluid,SIF):SGF∶将胃蛋白酶(1∶10 000)溶于灭菌的生理盐水(9 g/L,HCl调pH值至3.0)中,使终质量浓度为3 g/L。以0.22 μm无菌滤膜过滤,现配现用;SIF∶将胰蛋白酶(1∶250)溶于灭菌的生理盐水(9 g/L,NaOH调pH值至8.0)中,使终质量浓度为1 g/L,并加入胆盐使终质量浓度为3 g/L,以0.22 μm无菌滤膜过滤,现配现用,配方参考文献[19-20]。
隔水式恒温培养箱,上海森信实验仪器有限公司;振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司; UV1800紫外可见分光光度计,日本岛津;ZHJH-C1115B超净工作台,上海智诚分析仪器制造有限公司;DM 2000荧光显微镜,徕卡仪器(德国)有限公司;T100 Thermal Cycler PCR仪、Universal Hood 2凝胶成像仪,美国伯乐BIO-RAD;多功能微孔板读数仪,美国赛默飞世尔科技公司;电转化仪,德国Eppendorf。
按照范璟等[21]先前描述的方法,将活化好的植物乳杆菌,按照1%的接种量接种到新鲜的MRS液体培养基中,37℃ 培养过夜;按照2%的接种量接种到10 mL溶液I中,37℃ 培养3 h左右,至OD600≈0.5;5 000×g,4 ℃离心2 min,收集菌体细胞;用2 mL预冷的溶液Ⅱ洗涤细胞,5 000×g,4 ℃离心2 min,去除上清液,反复洗涤2次;最后用1 mL冰浴的溶液Ⅱ重悬菌体细胞,用于电转化植物乳杆菌。
方法参考文献[22],将无菌电转化杯从-20 ℃的冰箱取出后,于冰上预冷;取50 μL冰浴的感受态细胞,加入5 μL质粒溶液,轻轻吹吸混匀,于冰上静置10 min;将上述混合液转移至电转化杯,冰浴10 min;设置参数:电压2 000 V,电容为25 μF,电阻为400 Ω。电转化杯迅速擦干后,放入电击槽中,进行电击;迅速向转化后的电转化杯中加入950 μL预冷的SMRS溶液,冰上静置5 min;将上述液体转移进无菌的1.5 mL离心管中,37 ℃静止培养3 h左右,将培养液涂布到含有10 μg/mL氯霉素的MRS固体平板上,37℃ 培养48 h,长出的菌落即为转化子。
菌株按照5 000×g 1%的接种量,培养到稳定期,取1 mL培养液5 000×g,离心2 min,去除上清,用无菌水洗2遍,再用500 μL无菌水重悬,作为模板。以重组菌株和阴性菌株的菌落为模板,利用引物GF、GR扩增GFP基因片段,PCR体系20 μL:2×Taq Mix 10 μL;ddH2O 8 μL;上游引物(25 μmol/L) 0.5 μL;下游引物(25 μmol/L) 0.5 μL;模板DNA 1 μL。PCR扩增条件为:95℃预变性5 min;95℃变性10 s;48℃退火30 s;72℃延伸1 min;72℃延伸5 min,2~4步进行30个循环,PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
按照曹春蕾等[23]描述的方法,挑取重组菌株接种于含10 μg/mL氯霉素的MRS液体培养基中,37℃培养过夜;按照1%的接种量接种到新鲜的培养基中,37℃培养18 h;5 000×g离心2 min,收集菌体细胞,用PBS洗涤2遍,重悬在PBS中;制片后,用荧光显微镜观察。
方法参考文献[18],同样按照1.7的方法收集菌体细胞,将菌体细胞重悬于PBS中,取200 μL重悬液加入96 孔酶标板中,测定488 nm激发、535 nm发射下的荧光值。
将标记前后的菌株,按照1%的接种量接种到新鲜培养基中,37 ℃培养过夜;将培养液按照1%的接种量接种到新的MRS液体培养中,混匀后分装到提前灭过菌的试管中,于37 ℃恒温静置培养,每隔1 h取出1根试管测定OD600的吸光值和荧光强度,以培养时间为横坐标,分别以OD600值、荧光强度为纵坐标绘制曲线。
按照RANADHEERA等[19]先前描述的方法对标记前后的植物乳杆菌进行模拟胃液(SGF)和模拟肠液(SIF)。将活化好的菌株按照1%的接种量接种到新鲜的培养基中,于37℃恒温静置培养至OD600≈2.5,8 000×g,离心5 min收集菌体细胞;将样品暴露于模拟胃液2 h,取样进行一式两份的连续稀释和倾注计数,以确定总活菌数;然后将样品暴露于模拟肠液4 h,同样进行计数,以确定总活菌数,以活菌数和存活率为纵坐标,以不同处理方式为横坐标作图。
按照方法1.7收集菌体细胞,并将细胞重悬于300 g/L的蔗糖的溶液中,放置于-80℃;隔1周取1次样,进行一式两份的连续稀释和倾注计数,以确定总活菌数,以活菌数和荧光强度为纵坐标,以时间为横坐标作图。
按照方法1.7收集菌体细胞,重悬于PBS中。用灭菌后的牙签蘸取少量的菌液,分别轻轻点在葡萄糖作为唯一碳源的MRS平板和低聚果糖(fructooligosaccharide,FOS)作为唯一碳源的平板上,与于37℃恒温静置培养20 h后,观察颜色变化。本次试验,培养基中添加质量浓度为5 g/L的溴甲酚紫溶液做为指示剂,添加量为15 mL/L。
方法参考国际标准ISO 10932∶2010(IDF 223∶2010)。无菌操作,将倍比稀释后不同浓度的抗生素溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中,第2~11孔按照浓度由低到高加抗生素稀释液,每孔100 μL,第12孔不加抗生素作为生长对照。按照规范将培养到稳定期的菌液稀释到105~106 CFU/mL,吸取100 μL菌液加到96孔板中。37℃厌氧培养48 h后,酶标仪测定OD625,计算结果。
本研究所有数据分析均由GraphPad Prism 6、SPSS 19.0以及Origin 9处理完成;2组之间的显著性差异通过卡方检验进行判断(SPSS 19.0 软件),P<0.05 则认为差异显著。
通过电转化的方法将质粒PCD4033-GFP导入到植物乳杆菌感受态受体中,获得GFP标记的菌株,并进一步对转化子进行筛选鉴定及荧光检测。
2.1.1 质粒PCD4033-GFP电转化后重组菌株的筛选
将质粒PCD4033-GFP通过电转化的方法导入植物乳杆菌感受态受体细胞后,添加氯霉素的MRS中筛选转化子。阴性对照在MRS平板上长出菌落,在氯霉素平板上没有长出菌落,转化成功的转化子在氯霉素的平板上长出菌落。初筛的结果表明,质粒PCD4033-GFP已成功转入4株植物乳杆菌中。
2.1.2 重组菌株验证
以重组菌株和阴性菌株的菌泥为模板,利用引物GF、GR扩增GFP基因片段,PCR产物电泳结果如图1所示,阴性对照均没有条带,所有重组菌株在700 bp附近有1条很明显的条带,GFP基因片段714 bp,条带与目的片段大小吻合,所以验证结果表明GFP已成功标记4株植物乳杆菌。
图1 PCR产物电泳结果
Fig.1 Electrophoresis result of PCR products注:M-marker;Y-无菌水阴性对照;1、2、3、4-P1、P2、P3、P4的标记后的菌株;5、6、7、8-P1、P2、P3、P4阴性对照。
2.1.3 荧光显微镜观察
将上述转化菌株用荧光显微镜观察,自然光下即可见微弱的绿色荧光,在紫外灯下转化菌株菌体发出明亮的绿色荧光,细菌形状成杆状。表明质粒PCD4033-GFP已成功转入植物乳杆菌中,且GFP成功表达。
2.2.1 生长曲线及不同生长阶段荧光强度的测定
标记前后菌株的生长曲线如图2所示。在相同的生长环境下,所有菌株标记前后的生长曲线的变化趋势基本相同。P1和P1G的生长曲线几乎吻合,OD600最终均达到7.2左右;P3和P3G的生长曲线完全一致,OD600最终均达到4.2左右;P2G和P4G的生长速度比标记前略有滞后,但P2和P2G的OD600最终稳定在4.0左右,P4和P4G稳定在7.4左右。在王晶等[24]的研究中也发现标记后的菌株出现生长略微滞后的现象。综上,GFP基因标记对植物乳杆菌生长几乎不影响。
对于荧光强度,转化后的这4株植物乳杆菌的荧光强度随着时间变化的趋势基本一致(图2)。指数期前期荧光强度随着吸光度的增加而显著增加,当吸光度在2.5~3.0,荧光强度达到最大值。随后,荧光强度随着吸光度的增加显著降低至一个稳定的水平;对于荧光强度的最高水平,不同的菌株之间存在一定的差异,其中荧光强度相对较高的是P4G,大约为25。
a-P1、P1G;b-P2、P2G;c-P3、P3G;d-P4、P4G
图2 标记前后菌株的生长动力学曲线及不同生长阶段的荧光强度
Fig.2 Growth curve of wild strains and labeled strains and fluorescence intensity at different growth stages
2.2.2 胃酸耐受性和胆盐耐受性的测定
乳酸菌经口服进入机体后,只有能够抵抗较强的胃酸和胆盐,才能在肠道中存活继而发挥其益生功效[25]。图3可以看出, P1、P2、P4标记前后的菌株在模拟胃液3 h后,依然保持85%~100%的高存活率,表现出良好的胃酸耐受性;P3标记前后的菌株在模拟胃液3 h后存活率均显著降低。但在模拟肠液4 h后,所有的菌株存活率显著降低,其中存活率相对较高的P1、P2、P3标记前后的菌株,存活率也只有5%~10%,所有菌株对胆盐的耐受性都比较弱,但是,所有菌株标记前后对胃酸和胆盐的耐受性没有显著差别(P>0.05)。
a-P1;b-P2;c-P3;d-P4
图3 标记前后菌株的酸耐受性和胆盐耐受性的结果
Fig.3 The tolerance to acid and bile salts of wild strains and labeled strains
2.2.3 冻存前后的活菌数及荧光强度的变化
由图4可知,被GFP标记前和标记后的菌株在冻存的2周内,活菌数和荧光强度均没有显著性变化(P>0.05)。对于活菌数,冻存期间所有菌株基本维持在10.5 lgCFU/mL左右。对于荧光强度,P2G、P3G、P4G均维持在一个稳定的水平,冻存前后没有明显的变化;P1G的荧光强度在第2周时有轻微的上调,但与冻存前和冻存1周的结果比较并没有显著的差异(P>0.05)。所以-80℃冻存2周对于标记前后植物乳杆菌的活菌数和荧光强度没有影响。
a-P1;b-P2;c-P3;d-P4
图4 冻存期间活菌数及荧光强度的变化
Fig.4 Results of viable cell count and fluorescence intensity after cryopreservation
2.2.4 对低聚果糖(FOS)利用能力的测定
标记前后的菌株对FOS利用情况如表2所示。P1、P2、P4标记前后的菌株接种到葡萄糖平板和FOS平板,培养20 h后,平板均由紫色变成了黄色,所以P1、P2、P4标记前后均可以利用葡萄糖和FOS。P3标记前后的菌株接种到葡萄糖平板上,培养20 h后紫色变成了黄色;接种到FOS平板上培养,没有黄色产生,综上可知,P3标记前后都不具备利用FOS的能力。综上可知,GFP基因标记植物乳杆菌后不影响菌株对FOS的利用能力。
表2 标记前后的菌株对FOS利用情况
Table 2 The use of FOS by wild strains and labeled strains
菌株碳源- FOS 碳源-葡萄糖P1++P1G++P2++P2G++P3-+P3G-+P4++P4G++
注:+表示可以利用;-表示不能利用。
2.2.5 抗生素最低抑制浓度(MIC)测定
由表3可知除了氯霉素外,转化前和转化后菌株的各种抗生素的MIC基本相同,所以转化几乎不影响菌株对抗生素的耐受性。氯霉素存在显著差异的原因是,表达载体里的选择标记基因是氯霉素的抗性基因,所以标记后的菌株都具备氯霉素的抗性。结果表明,除氯霉素外,GFP基因标记植物乳杆菌,不影响菌株对抗生素的敏感性。
通过荧光显微镜观察,发现4株菌在紫外灯下发出明亮的绿色荧光,表明用GFP基因成功标记了4株植物乳杆菌,而且GFP的表达量在不同的植物乳杆菌中存在差异,在P4G中的表达量最高(≈25)。标记前后,P1和P3的生长曲线几乎吻合,P2和P4被GFP标记后生长略有滞后,但趋势基本相同,表明GFP标记不影响植物乳杆菌的生长情况,GORY等[26]发现Lactobacillus sake被GFP标记后,生长略有滞后,正常生长不受影响。P1、P2、P4这3株植物乳杆菌标记 前后的菌株,经过3 h模拟胃液存活率均高于85%,P3和P3G的存活率分别是65%和61%,所有菌株经过4 h的模拟肠液后存活率均低于11%,结果表明GFP标记不影响植物乳杆菌对胃酸和胆盐的耐受性(P>0.05),此结果与王晶等[27]的研究结果一致。在-80℃冻存的2周内,所有植物乳杆菌的活菌数均没有显著性变化(P>0.05),表明GFP标记不影响植物乳杆菌对低温的耐受性,可以一次性制备菌体冻存于-80℃供动物实验用。FOS利用能力的实验发现,P1、P2、P4标记前后均可以利用FOS,但是P3和P3G均不具备FOS利用的能力,表明GFP标记不影响植物乳杆菌对FOS的利用能力。从抗生素最低抑制浓度的实验结果可以看出,标记后4株植物乳杆菌对氯霉素具有抗性,对其他抗生素的敏感性几乎没有变化,这是因为在重组过程中带入了氯霉素抗性基因作为标记基因[18-19],所以GFP标记不影响植物乳杆菌对抗生素的敏感性,王晶等[27]发现GFP标记不改变植物乳杆菌对除红霉素外其他药物的耐药性,表达载体的标记基因选择的是红霉素。
表3 抗生素对微生物生长的最低抑制浓度 单位:μg/mL
Table 3 Minimum inhibitory concentration of antibiotics on microbial growth
抗生素 P1P1GP2P2GP3P3GP4P4G万古霉素 RRRRRRRR环丙沙星 RR12832RRRR氨苄青霉素 3232323232323232庆大霉素 2561283216128641616氯霉素 64R32R128R8R阿莫西林 1111110.50.5新霉素 641283216641283232四环素 641286464128646464克林霉素 1618832444利福平 323284163284甲氧苄氨嘧啶128128128128128641616卡那霉素 25612812864256128128128红霉素 8844161644链霉素 3232163264326464
注:R表示耐受,数字表示最低耐受浓度。
综上,植物乳杆菌被GFP标记后的生物学特性具有稳定性,为利用GFP基因标记植物乳杆菌评价其定植能力和作用机理解析奠定了基础。
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