绿色荧光蛋白标记植物乳杆菌及其生物学特性分析

陈彩玲,毛丙永,崔树茂,赵建新*

(江南大学 食品学院,江苏 无锡,214122)

摘 要 为探究绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记对植物乳杆菌生物学特性的影响,采用GFP对4株植物乳杆菌进行标记,并比较标记前后菌株的生物学特性。结果显示,标记前后菌株生长情况基本相同,其中P2和P4被GFP标记后生长略有滞后;标记前后的菌株对胃酸和胆盐的耐受趋势基本一致,无显著差别;在-80℃冻存2周内,标记前后所有菌株的活菌数无显著变化;对低聚果糖利用能力无变化;标记后所有菌株对氯霉素有抗性,标记前菌株对氯霉素敏感,对其他13种抗生素的敏感性无变化。说明GFP标记不影响植物乳杆菌的生物学特性,为可视化研究植物乳杆菌在小鼠肠道内的定植和分布提供了理论依据。

关键词 植物乳杆菌;绿色荧光蛋白;重组菌株;生物学特性

乳杆菌不仅能够通过发酵提高食品的营养价值,改善食品风味[1-2],而且能够调节肠道菌群、保持微生态平衡、增强机体免疫作用[3-4]。目前乳杆菌的研究大多关注宿主的生理、疾病以及菌群等的变化,对于其在胃肠道中的分布、数量、运动及它们的定植情况缺乏系统性、针对性的机理研究。王晶等[5]的研究表明,无法真正区分进入肠道的菌属于内源菌还是外源菌,因此这在一定程度上限制了对作用机理的深入研究。

关于菌株定植能力的研究,一般选择小鼠、人体、模拟反应器等实验模型[6-8],灌胃或饮食的方式摄入,收集粪便或肠道内容物后通过平板培养[9]、荧光原位杂交[10]和实时荧光定量PCR[11],但这些技术存在着操作繁琐、准确度低或费用高等缺陷。近年来,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为一种理想的活体荧光标记分子,越来越多地被用于活细胞或微生物的定位、结构和动力学的研究[12]。GFP已经在许多细菌中完成了转化,王晶等[13]利用GFP追踪了乳酸乳球菌WH-C1在小鼠肠道内的定植情况;YU等[14]通过GFP标记发现德氏乳杆菌D17嵌入在黏液层中,局部接近肠道的上皮细胞;GEOFFROY等[15]构建了含有GFP的组成型和Nisin诱导型的质粒并导入植物乳杆菌WCFS1中,用来研究WCFS1在肠道内的定植与分布。

本实验室从发酵食品中分离得到1株有明显益生作用的植物乳杆菌CCFM8610,动物实验发现CCFM8610处理可有效降低肠道镉的吸收,减少组织中镉的积累,减轻肾脏和肝脏的氧化应激[16]。为进一步研究该菌株在肠道内的定植规律,本实验室成功对包括CCFM8610在内的4株植物乳杆菌进行GFP荧光标记。本研究对这4株植物乳杆菌的出发菌株和重组菌株的生物学特性进行了比较研究,为植物乳杆菌在肠道中分布和定植规律的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

试验用植物乳杆菌分离自发酵食品和健康人粪便,保藏于江南大学食品生物技术菌种保藏中心;所用菌株、质粒及引物见表1。

1.2 培养基及试剂

MRS培养基:蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母粉5 g,葡萄糖20 g,K2HPO4 2 g,柠檬酸二铵2 g,乙酸钠2 g,吐温80 1 mL,MgSO4·7H2O 0.5 g,MnSO4·4H2O 0.25 g,蒸馏水1 000 mL,pH 6.2~6.4,固体培养基添加1.5%的琼脂粉,在115℃灭菌20 min。培养重组菌株的培养基中,添加终质量浓度为10 μg/mL的氯霉素,以0.22 μm无菌滤膜过滤。

TIAN prep Mini Plasmid kit聚合酶、TaqDNA聚合酶,上海科晴生物科技有限公司;所有抗生素类试剂、胃蛋白酶,生工生物工程(上海)股份有限公司;胆盐,英国Oxoid公司;其他实验用化学试剂,国药集团化学试剂有限公司。

表1 本研究所用菌株、质粒及引物
Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study

名称文中缩写描述参考菌株8-3P1从粪便中分离的野生型菌株本实验室JS-NJ-PK-4-G-1P2从粪便中分离的野生型菌株本实验室HuBei-32-L-1P3从粪便中分离的野生型菌株本实验室CCFM 8610P4从发酵食品中分离的野生型菌株本实验室8-3-GP1GGFP基因标记的重组菌株本实验JS-NJ-PK-4-G-1-GP2GGFP基因标记的重组菌株本实验HuBei-32-L-1-GP3GGFP基因标记的重组菌株本实验CCFM 8610-GP4GGFP基因标记的重组菌株本实验质粒PCD4033-GFP无GFP在plhd下游作为报告基因[17]引物GRGRACTCTGCAGATGAGCAAAGGAGAAGAAC[18]GFGFGGTATCGATAAGCTTGATATCGAAT[18]

PBS缓冲液:Na2HPO4 2.13 g,NaCl 0.8 g,KCl 0.2 g,KH2PO4 0.2 g,搅拌溶解后,调pH值到7.4,定容至1 L,在115℃ 灭菌20 min,配方参考文献[18]。

乳杆菌感受态细胞制备和电转化溶液:溶液I:136.7 g山梨醇,0.1 g甘氨酸,用MRS培养基定容至1 L,115℃灭菌20 min;溶液Ⅱ:342.3 g蔗糖,0.711 g MgCl2·6H2O,去离子水定容至1 L,115℃灭菌20 min;复苏液(SMRS):136.7 g山梨醇,1.11 g CaCl2,9.52 g MgCl2,用MRS培养基定容至1 L,115℃灭菌20 min,配方参考文献[18]。

模拟胃液(simulated gastric fluid,SGF)和模拟肠液(simulated intestinal fluid,SIF):SGF∶将胃蛋白酶(1∶10 000)溶于灭菌的生理盐水(9 g/L,HCl调pH值至3.0)中,使终质量浓度为3 g/L。以0.22 μm无菌滤膜过滤,现配现用;SIF∶将胰蛋白酶(1∶250)溶于灭菌的生理盐水(9 g/L,NaOH调pH值至8.0)中,使终质量浓度为1 g/L,并加入胆盐使终质量浓度为3 g/L,以0.22 μm无菌滤膜过滤,现配现用,配方参考文献[19-20]。

1.3 仪器与设备

隔水式恒温培养箱,上海森信实验仪器有限公司;振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司; UV1800紫外可见分光光度计,日本岛津;ZHJH-C1115B超净工作台,上海智诚分析仪器制造有限公司;DM 2000荧光显微镜,徕卡仪器(德国)有限公司;T100 Thermal Cycler PCR仪、Universal Hood 2凝胶成像仪,美国伯乐BIO-RAD;多功能微孔板读数仪,美国赛默飞世尔科技公司;电转化仪,德国Eppendorf。

1.4 植物乳杆菌感受态细胞制备

按照范璟等[21]先前描述的方法,将活化好的植物乳杆菌,按照1%的接种量接种到新鲜的MRS液体培养基中,37℃ 培养过夜;按照2%的接种量接种到10 mL溶液I中,37℃ 培养3 h左右,至OD600≈0.5;5 000×g,4 ℃离心2 min,收集菌体细胞;用2 mL预冷的溶液Ⅱ洗涤细胞,5 000×g,4 ℃离心2 min,去除上清液,反复洗涤2次;最后用1 mL冰浴的溶液Ⅱ重悬菌体细胞,用于电转化植物乳杆菌。

1.5 植物乳杆菌电转化方法

方法参考文献[22],将无菌电转化杯从-20 ℃的冰箱取出后,于冰上预冷;取50 μL冰浴的感受态细胞,加入5 μL质粒溶液,轻轻吹吸混匀,于冰上静置10 min;将上述混合液转移至电转化杯,冰浴10 min;设置参数:电压2 000 V,电容为25 μF,电阻为400 Ω。电转化杯迅速擦干后,放入电击槽中,进行电击;迅速向转化后的电转化杯中加入950 μL预冷的SMRS溶液,冰上静置5 min;将上述液体转移进无菌的1.5 mL离心管中,37 ℃静止培养3 h左右,将培养液涂布到含有10 μg/mL氯霉素的MRS固体平板上,37℃ 培养48 h,长出的菌落即为转化子。

1.6 PCR验证

菌株按照5 000×g 1%的接种量,培养到稳定期,取1 mL培养液5 000×g,离心2 min,去除上清,用无菌水洗2遍,再用500 μL无菌水重悬,作为模板。以重组菌株和阴性菌株的菌落为模板,利用引物GF、GR扩增GFP基因片段,PCR体系20 μL:2×Taq Mix 10 μL;ddH2O 8 μL;上游引物(25 μmol/L) 0.5 μL;下游引物(25 μmol/L) 0.5 μL;模板DNA 1 μL。PCR扩增条件为:95℃预变性5 min;95℃变性10 s;48℃退火30 s;72℃延伸1 min;72℃延伸5 min,2~4步进行30个循环,PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

1.7 倒置荧光显微镜观察

按照曹春蕾等[23]描述的方法,挑取重组菌株接种于含10 μg/mL氯霉素的MRS液体培养基中,37℃培养过夜;按照1%的接种量接种到新鲜的培养基中,37℃培养18 h;5 000×g离心2 min,收集菌体细胞,用PBS洗涤2遍,重悬在PBS中;制片后,用荧光显微镜观察。

1.8 荧光强度测定

方法参考文献[18],同样按照1.7的方法收集菌体细胞,将菌体细胞重悬于PBS中,取200 μL重悬液加入96 孔酶标板中,测定488 nm激发、535 nm发射下的荧光值。

1.9 生长曲线测定

将标记前后的菌株,按照1%的接种量接种到新鲜培养基中,37 ℃培养过夜;将培养液按照1%的接种量接种到新的MRS液体培养中,混匀后分装到提前灭过菌的试管中,于37 ℃恒温静置培养,每隔1 h取出1根试管测定OD600的吸光值和荧光强度,以培养时间为横坐标,分别以OD600值、荧光强度为纵坐标绘制曲线。

1.10 胃酸和胆盐耐受性试验

按照RANADHEERA等[19]先前描述的方法对标记前后的植物乳杆菌进行模拟胃液(SGF)和模拟肠液(SIF)。将活化好的菌株按照1%的接种量接种到新鲜的培养基中,于37℃恒温静置培养至OD600≈2.5,8 000×g,离心5 min收集菌体细胞;将样品暴露于模拟胃液2 h,取样进行一式两份的连续稀释和倾注计数,以确定总活菌数;然后将样品暴露于模拟肠液4 h,同样进行计数,以确定总活菌数,以活菌数和存活率为纵坐标,以不同处理方式为横坐标作图。

1.11 -80℃冻存2周活菌计数

按照方法1.7收集菌体细胞,并将细胞重悬于300 g/L的蔗糖的溶液中,放置于-80℃;隔1周取1次样,进行一式两份的连续稀释和倾注计数,以确定总活菌数,以活菌数和荧光强度为纵坐标,以时间为横坐标作图。

1.12 低聚果糖利用能力的测定

按照方法1.7收集菌体细胞,重悬于PBS中。用灭菌后的牙签蘸取少量的菌液,分别轻轻点在葡萄糖作为唯一碳源的MRS平板和低聚果糖(fructooligosaccharide,FOS)作为唯一碳源的平板上,与于37℃恒温静置培养20 h后,观察颜色变化。本次试验,培养基中添加质量浓度为5 g/L的溴甲酚紫溶液做为指示剂,添加量为15 mL/L。

1.13 抗生素对微生物生长的最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)

方法参考国际标准ISO 10932∶2010(IDF 223∶2010)。无菌操作,将倍比稀释后不同浓度的抗生素溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中,第2~11孔按照浓度由低到高加抗生素稀释液,每孔100 μL,第12孔不加抗生素作为生长对照。按照规范将培养到稳定期的菌液稀释到105~106 CFU/mL,吸取100 μL菌液加到96孔板中。37℃厌氧培养48 h后,酶标仪测定OD625,计算结果。

1.14 数据分析

本研究所有数据分析均由GraphPad Prism 6、SPSS 19.0以及Origin 9处理完成;2组之间的显著性差异通过卡方检验进行判断(SPSS 19.0 软件),P<0.05 则认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 GFP标记植物乳杆菌

通过电转化的方法将质粒PCD4033-GFP导入到植物乳杆菌感受态受体中,获得GFP标记的菌株,并进一步对转化子进行筛选鉴定及荧光检测。

2.1.1 质粒PCD4033-GFP电转化后重组菌株的筛选

将质粒PCD4033-GFP通过电转化的方法导入植物乳杆菌感受态受体细胞后,添加氯霉素的MRS中筛选转化子。阴性对照在MRS平板上长出菌落,在氯霉素平板上没有长出菌落,转化成功的转化子在氯霉素的平板上长出菌落。初筛的结果表明,质粒PCD4033-GFP已成功转入4株植物乳杆菌中。

2.1.2 重组菌株验证

以重组菌株和阴性菌株的菌泥为模板,利用引物GF、GR扩增GFP基因片段,PCR产物电泳结果如图1所示,阴性对照均没有条带,所有重组菌株在700 bp附近有1条很明显的条带,GFP基因片段714 bp,条带与目的片段大小吻合,所以验证结果表明GFP已成功标记4株植物乳杆菌。


图1 PCR产物电泳结果
Fig.1 Electrophoresis result of PCR products注:M-marker;Y-无菌水阴性对照;1、2、3、4-P1、P2、P3、P4的标记后的菌株;5、6、7、8-P1、P2、P3、P4阴性对照。

2.1.3 荧光显微镜观察

将上述转化菌株用荧光显微镜观察,自然光下即可见微弱的绿色荧光,在紫外灯下转化菌株菌体发出明亮的绿色荧光,细菌形状成杆状。表明质粒PCD4033-GFP已成功转入植物乳杆菌中,且GFP成功表达。

2.2 生物学特性比较研究

2.2.1 生长曲线及不同生长阶段荧光强度的测定

标记前后菌株的生长曲线如图2所示。在相同的生长环境下,所有菌株标记前后的生长曲线的变化趋势基本相同。P1和P1G的生长曲线几乎吻合,OD600最终均达到7.2左右;P3和P3G的生长曲线完全一致,OD600最终均达到4.2左右;P2G和P4G的生长速度比标记前略有滞后,但P2和P2G的OD600最终稳定在4.0左右,P4和P4G稳定在7.4左右。在王晶等[24]的研究中也发现标记后的菌株出现生长略微滞后的现象。综上,GFP基因标记对植物乳杆菌生长几乎不影响。

对于荧光强度,转化后的这4株植物乳杆菌的荧光强度随着时间变化的趋势基本一致(图2)。指数期前期荧光强度随着吸光度的增加而显著增加,当吸光度在2.5~3.0,荧光强度达到最大值。随后,荧光强度随着吸光度的增加显著降低至一个稳定的水平;对于荧光强度的最高水平,不同的菌株之间存在一定的差异,其中荧光强度相对较高的是P4G,大约为25。

a-P1、P1G;b-P2、P2G;c-P3、P3G;d-P4、P4G
图2 标记前后菌株的生长动力学曲线及不同生长阶段的荧光强度
Fig.2 Growth curve of wild strains and labeled strains and fluorescence intensity at different growth stages

2.2.2 胃酸耐受性和胆盐耐受性的测定

乳酸菌经口服进入机体后,只有能够抵抗较强的胃酸和胆盐,才能在肠道中存活继而发挥其益生功效[25]。图3可以看出, P1、P2、P4标记前后的菌株在模拟胃液3 h后,依然保持85%~100%的高存活率,表现出良好的胃酸耐受性;P3标记前后的菌株在模拟胃液3 h后存活率均显著降低。但在模拟肠液4 h后,所有的菌株存活率显著降低,其中存活率相对较高的P1、P2、P3标记前后的菌株,存活率也只有5%~10%,所有菌株对胆盐的耐受性都比较弱,但是,所有菌株标记前后对胃酸和胆盐的耐受性没有显著差别(P>0.05)。

a-P1;b-P2;c-P3;d-P4
图3 标记前后菌株的酸耐受性和胆盐耐受性的结果
Fig.3 The tolerance to acid and bile salts of wild strains and labeled strains

2.2.3 冻存前后的活菌数及荧光强度的变化

由图4可知,被GFP标记前和标记后的菌株在冻存的2周内,活菌数和荧光强度均没有显著性变化(P>0.05)。对于活菌数,冻存期间所有菌株基本维持在10.5 lgCFU/mL左右。对于荧光强度,P2G、P3G、P4G均维持在一个稳定的水平,冻存前后没有明显的变化;P1G的荧光强度在第2周时有轻微的上调,但与冻存前和冻存1周的结果比较并没有显著的差异(P>0.05)。所以-80℃冻存2周对于标记前后植物乳杆菌的活菌数和荧光强度没有影响。

a-P1;b-P2;c-P3;d-P4
图4 冻存期间活菌数及荧光强度的变化
Fig.4 Results of viable cell count and fluorescence intensity after cryopreservation

2.2.4 对低聚果糖(FOS)利用能力的测定

标记前后的菌株对FOS利用情况如表2所示。P1、P2、P4标记前后的菌株接种到葡萄糖平板和FOS平板,培养20 h后,平板均由紫色变成了黄色,所以P1、P2、P4标记前后均可以利用葡萄糖和FOS。P3标记前后的菌株接种到葡萄糖平板上,培养20 h后紫色变成了黄色;接种到FOS平板上培养,没有黄色产生,综上可知,P3标记前后都不具备利用FOS的能力。综上可知,GFP基因标记植物乳杆菌后不影响菌株对FOS的利用能力。

表2 标记前后的菌株对FOS利用情况
Table 2 The use of FOS by wild strains and labeled strains

菌株碳源- FOS 碳源-葡萄糖P1++P1G++P2++P2G++P3-+P3G-+P4++P4G++

注:+表示可以利用;-表示不能利用。

2.2.5 抗生素最低抑制浓度(MIC)测定

由表3可知除了氯霉素外,转化前和转化后菌株的各种抗生素的MIC基本相同,所以转化几乎不影响菌株对抗生素的耐受性。氯霉素存在显著差异的原因是,表达载体里的选择标记基因是氯霉素的抗性基因,所以标记后的菌株都具备氯霉素的抗性。结果表明,除氯霉素外,GFP基因标记植物乳杆菌,不影响菌株对抗生素的敏感性。

3 结论

通过荧光显微镜观察,发现4株菌在紫外灯下发出明亮的绿色荧光,表明用GFP基因成功标记了4株植物乳杆菌,而且GFP的表达量在不同的植物乳杆菌中存在差异,在P4G中的表达量最高(≈25)。标记前后,P1和P3的生长曲线几乎吻合,P2和P4被GFP标记后生长略有滞后,但趋势基本相同,表明GFP标记不影响植物乳杆菌的生长情况,GORY等[26]发现Lactobacillus sake被GFP标记后,生长略有滞后,正常生长不受影响。P1、P2、P4这3株植物乳杆菌标记 前后的菌株,经过3 h模拟胃液存活率均高于85%,P3和P3G的存活率分别是65%和61%,所有菌株经过4 h的模拟肠液后存活率均低于11%,结果表明GFP标记不影响植物乳杆菌对胃酸和胆盐的耐受性(P>0.05),此结果与王晶等[27]的研究结果一致。在-80℃冻存的2周内,所有植物乳杆菌的活菌数均没有显著性变化(P>0.05),表明GFP标记不影响植物乳杆菌对低温的耐受性,可以一次性制备菌体冻存于-80℃供动物实验用。FOS利用能力的实验发现,P1、P2、P4标记前后均可以利用FOS,但是P3和P3G均不具备FOS利用的能力,表明GFP标记不影响植物乳杆菌对FOS的利用能力。从抗生素最低抑制浓度的实验结果可以看出,标记后4株植物乳杆菌对氯霉素具有抗性,对其他抗生素的敏感性几乎没有变化,这是因为在重组过程中带入了氯霉素抗性基因作为标记基因[18-19],所以GFP标记不影响植物乳杆菌对抗生素的敏感性,王晶等[27]发现GFP标记不改变植物乳杆菌对除红霉素外其他药物的耐药性,表达载体的标记基因选择的是红霉素。

表3 抗生素对微生物生长的最低抑制浓度 单位:μg/mL

Table 3 Minimum inhibitory concentration of antibiotics on microbial growth

抗生素 P1P1GP2P2GP3P3GP4P4G万古霉素 RRRRRRRR环丙沙星 RR12832RRRR氨苄青霉素 3232323232323232庆大霉素 2561283216128641616氯霉素 64R32R128R8R阿莫西林 1111110.50.5新霉素 641283216641283232四环素 641286464128646464克林霉素 1618832444利福平 323284163284甲氧苄氨嘧啶128128128128128641616卡那霉素 25612812864256128128128红霉素 8844161644链霉素 3232163264326464

注:R表示耐受,数字表示最低耐受浓度。

综上,植物乳杆菌被GFP标记后的生物学特性具有稳定性,为利用GFP基因标记植物乳杆菌评价其定植能力和作用机理解析奠定了基础。

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Biological properties of green fluorescent protein labelled Lactobacillus plantarum

CHEN Cailing, MAO Bingyong, CUI Shumao, ZHAO Jianxin*

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACT The purpose of this study is to explore whether green fluorescent protein (GFP) labelling has effects on the biological characteristics of Lactobacillus plantarum. Four strains of L. plantarum (P1-P4) were labeled with GFP and their biological characteristics were examined. The results showed that the growth curves of the strains were nearly coincident with and without labeling, although strain P2 and P4 showed slight delay compared to pre-labeled strains. All strains showed no significant differences in the tolerances of gastric acid and bile salts. After being stored at -80 °C for two weeks, their viable counts and the ability to utilize fructooligosaccharides did not change significantly. Although their sensitivity to 13 antibiotics were not different, non-labeled strains were sensitive to chloramphenicol but labeled strains not. In conclusion, GFP labelling had no significant effects on the biological characteristics of L. plantarum, which provides a theoretical basis for visualizing the colonization and distribution of L. plantarum in the intestine of mice in future studies.

Key words Lactobacillus plantarum; green fluorescent protein; recombinant strains; biological characteristics

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.020432

第一作者:硕士研究生(赵建新教授为通讯作者,E-mail:zhaojianxin@jiangnan.edu.cn)。

基金项目:国家自然科学基金(31601453)

收稿日期:2019-03-04,改回日期:2019-05-07