莱克多巴胺(ractopamine，RAC)是一种人工合成的肾上腺受体激动剂，在医学上用来治疗心力衰竭症、肌肉萎缩症或者减少脂肪蓄积，并对胎儿和新生儿生长有一定的益处。在动物饲养中能减少动物脂肪累积，使瘦肉增加，改善肉质，同时还使得动物饲料利用率和蛋白质含量得到提高[1-2]。但摄入过量的RAC，人体会出现不同程度的中毒反应，其中毒症状表现为肌肉震颤、四肢麻痹、心动过速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心眩晕等，重者可引发高血压、心脏病甚至危及生命[3-6]。2002年，我国农业部、原卫生部、原国家药品监督管理局联合发布《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》(农业部公告第176号)禁止RAC在动物养殖中的使用RAC。俄罗斯和欧洲国家也都禁止RAC作为食品添加剂[7]，所以建立RAC的快速测定是非常必要的。
目前，常用于测定RAC的方法主要有气相色谱法(GC)[8]，液相色谱法(HPLC)[9-10]，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[11-12]，液相色谱-质谱联用法(GC-MS)[13-14]、酶联免疫吸附测定法(ELISA)[15-16]以及分子印迹法[2,17]。然而，这些方法中有些方法需要昂贵的仪器、熟练的操作人员和制备大量的样品；有些试验中存在试剂稳定性差和需要进行动物试验，导致其对食品样品中RAC的现场检测和快速检测的适用性有限的缺陷。而电化学方法稳定、灵敏、成本低，特别是在药物和食品分析方面得以广泛应用。有些电化学传感器已经应用于RAC的检测[18-24]。氨基酸聚合膜修饰电极具有稳定性好、选择性好、检测的灵敏度高和使用寿命长等特点，被广泛用于化学修饰电极的制备[25]。聚γ-氨基丁酸(γ-ABA)具有良好的电催化特性，是一种优良的电极的修饰材料，在电化学领域应用前景非常广泛，聚γ-ABA修饰电极(P-γ-ABA/GCE)已经应用于一些电化学活性物质的检测，表现出了优良的催化活性[26-28]。但据我们所知，P-γ-ABA/GCE测定RAC还未见报道。本文采用在P-γ-ABA/GCE对RAC进行测定，电极表现出了较好的稳定性及抗干扰能力，催化了RAC的氧化反应，能够用于实际样品的检测。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
电化学工作站CHI660D型，上海辰华仪器有限公司；三电极体系，饱和Ag/AgCl电极为参比电极、铂丝电极为辅助电极、玻碳电极(GCE)或P-γ-ABA/GCE为工作电极；KQ-100型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；石英亚沸高纯水蒸馏器SYZ-550，金坛市江南仪器厂。
γ-ABA，阿拉丁试剂有限公司；RAC标准品，农业部环境保护科研监测所；猪肉，购买于当地超市；0.2 mol/L的缓冲溶液(PBS)由Na2HPO4和NaH2PO4配制；试验用水均为二次蒸馏水。
1.2 P-γ-ABA/GCE的制备
将玻碳电极在麂皮上用氧化铝粉末的糊状液抛光，然后分别在硝酸、乙醇和水中分别超声清洗30 s，再用二次蒸馏水冲洗干净晾干备用。将预处理后的玻碳电极放置于含有0.1 mol/L KNO3的5.0 mmol/L K3[Fe(CN)]6溶液中，使用循环伏安法(CV)扫描，当峰电流不再变化且趋于稳定，即电极清洗和活化过程完成。将电极置于1.0×10-3mol/L的γ-ABA溶液中，在-1.4～2.2 V电位范围内以40 mV/s的扫描速率循环扫描8段，取出电极清洗待用。
1.3 电化学分析试验方法
将三电极体系放置于一定量的RAC标准溶液(pH=6.8的PBS配制)与PBS中，用CV或差分脉冲伏安法(DPV)扫描，观察并记录在GCE或P-γ—ABA/GCE电化学行为。
2 结果与分析
2.1 RAC的电化学行为
由图1可知，浓度为1.00×10-6 mol/L的RAC溶液在P-γ-ABA/GCE上的氧化峰电流(3)相对于在裸电极(2)上的氧化峰明显增大，可以看出，γ-ABA增大了检测灵敏度。说明P-γ-ABA对RAC氧化具有催化作用，加速了RAC的电子转移速率。
1-γ-ABA/GCE测定空白溶液 (0.2 mol/L, pH=6.8);2-裸电极测定1.0×10-6 mol/L RAC;3-P-γ-ABA/GCE测定1.0×10-6 mol/L RAC
图1 不同电极测定的DPV图
Fig.1 DPV curves of different electrode measurement
2.2 最佳电化学聚合条件
2.2.1 P-γ-ABA/GCE聚合溶液的pH
聚合溶液pH影响了电极的性能。为了确定最佳聚合溶液的pH，固定电位于-1.4～2.2 V， 40 mV/s的扫描速率下，仅改变聚合溶液的pH。试验表明：当pH达到6.5时，RAC在聚P-γ-ABA/GCE上的氧化峰电流达到最大值(图2)，因此，在本试验中选择含有γ-ABA的pH=6.5的缓冲溶液作为修饰溶液。
图2 P-γ-ABA/GCE聚合液最佳pH
Fig.2 Optimization of the pH of the polymer stocksolution of P-γ-ABA/GCE
2.2.2 P-γ-ABA/GCE扫描段数(n)的优化
试验中讨论了n对聚合物修饰电极的影响。通过改变n聚合得到的修饰电极来测定RAC，试验结果表明(图3)，聚合过程中n达到8段时，RAC在P-γ-ABA/GCE上的氧化峰电流值达到最大。因此，聚合最佳n是8段。
图3 P-γ-ABA/GCE最佳聚合段数(n)
Fig.3 Optimization of the number ofelectropolymerization cycles (n) of P-γ-ABA/GCE
2.2.3 P-γ-ABA/GCE聚合扫描速率的优化
聚合扫描速率对修饰电极也起到较大的影响。通过改变扫描速率来观察氧化峰电流的电流变化。试验结果显示，当修饰电极上扫描速率是40 mV/s，RAC的氧化峰电流值达到最大(图4)。所以，最佳聚合扫描速率选用40 mV/s。
图4 P-γ-ABA/GCE最佳聚合扫描速率
Fig.4 Optimization of the scanning rate of P-γ-ABA/GCE
2.2.4 P-γ-ABA/GCE聚合高电位、低电位的优化
P-γ-ABA/GCE电极的制备中，聚合高、低电位能够在一定程度上影响电极的检测灵敏度。首先固定低电位为-1.0 V，改变聚合高电位进行试验。最佳高电位为2.2 V。然后固定高电位，最佳低电位为-1.4 V。此时，RAC在修饰电极上的响应氧化峰电流达到了最大值(图5)。所以聚合电位为-1.4～2.2 V。
a-低电位聚合；b-高电位聚合
图5 P-γ-ABA/GCE最佳聚合电位
Fig.5 Optimization of the potential of P-γ-ABA/GCE
2.2.5 优化条件下P-γ-ABA/GCE电极聚合曲线
在上述最佳聚合条件下，用循环伏安法得到了P-γ-ABA/GCE电极的聚合曲线。γ-ABA在电极表面发生了氧化还原反应，通过电化学氧化还原反应制备了聚合物膜。
聚合条件：1.0×10-3mol/L的ABA；聚合电位：-1.4～2.2 V；聚合扫描段数：8段；扫描速率：40 mV/s。
2.3 RAC最佳测定条件的选择
2.3.1 测定溶液最佳pH
电极反应受到测定溶液pH的影响。为了考察测定过程中测定溶液pH的影响，在0.2～1.0 V的电位范围内，改变测定底液的pH。在pH为6.0到8.0之间，RAC在P-γ-ABA/GCE上氧化峰电流变化如图6所示。当pH=6.8时，RAC在P-γ-ABA/GCE上的氧化峰电流达到最大值。因此，在该试验中选择pH=6.8的PBS为测定底液。另外，由图6插图可以看出，RAC氧化电位与pH值成线性相关；pH在6.0～8.0，氧化峰电位(Epa)随pH值的增加而降低，线性回归方程为：Epa=1.05-0.053 pH，R=0.996 3，其线性方程的斜率为0.053 V，接近0.059 V，故质子转移数等于电子转移数，由此可说明RAC在氧化过程中涉及质子的参与。
1～6 (pH)-6.0, 6.4, 6.8, 7.2, 7.6, 8.0
图6 不同pH下的1.0×10-6 mol/L的RAC在P-γ-ABA/GCE上的差分脉冲图
Fig.6 DPV curves (DPVs) of 1.0×10-6 mol/L RAC atthe P-γ-ABA/GCE
2.3.2 扫描速率的影响
设置电位范围为0.2～1.2 V，选择1.0×10-6mol/L的RAC溶液，选择pH=6.8的PBS，用循环伏安法研究扫描速率的变化规律(图7)。
1～14-20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240 mV/s
图7 不同扫速下的CV图
Fig.7 Cyclic voltammograms at deferent scan rate
试验结果证明，在20～240 mV/s的速率，氧化峰电流值随着扫描速率的增加而增大，并且氧化峰电流与扫描速率ν1/2成线性关系，线性方程ipa=4.03×10-7+1.57×10-9ν1/2 (mV/s)，相关系数R2=0.994 1，说明RAC在聚氨基丁酸修饰电极上的反应过程为扩散过程。
2.4 线性范围
在最佳的试验条件下，使用差分脉冲伏安法测定RAC(DPV曲线如图8所示)。在6.0×10-8～1.0×10-5mol/L，OX电流与其浓度成相对比较好的线性正相关(如图8插图所示)，线性回归方程为：ipa=1.09×10-7+0.26c(mol/L)，R2=0.998 8。RAC的最低检出浓度为8.0×10-9mol/L。
2.5 样品的测定
2.5.1 样品处理
称取10.000 0 g生猪肉，用大约20 mL的无水乙醇将样品浸泡，静置10 min，用真空泵抽滤，滤渣用乙醇萃取3次，合并滤液，取适量倒入离心试管，放入离心泵离心10 min，取上层上清液定容于10 mL容量瓶中配制成猪肉样品待测液。
2.5.2 样品回收率测定
在优化的试验条件下，取猪肉样品待测液0.5、1和2 mL，用标准加入法向猪肉样品待测液中加RAC溶液，回收率在98.0%～102%，计算结果如表1。
2.6 电极的抗干扰能力、稳定性与重复性
用P-γ-ABA/GCE测定浓度为6.00×10-6 mol/L的RAC(pH=6.8)进行干扰试验，评估了可能干扰修饰电极响应的几种物质。试验结果表明，在允许相对误差±5.0%以内，100倍的葡萄糖(Glc)和半乳糖(Fru)，50倍的甘氨酸(Gly)和尿酸(UA)，20倍的抗坏血酸(AA)，加入到6.00×10-6 mol/L的RAC中，在此体系中只检测到UA到相对微弱的氧化峰，其他物质未检测到峰，并且没有影响RAC氧化峰电流的大小，所以该方法具有较好的选择性。
1～11-0.06, 0.08, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 2.0,4.0, 6.0, 8.0,10 μmol/L
图8 P-γ-ABA/GCE上不同浓度的RAC在最佳试验条件下的DPV图
Fig.8 DPV curves of different concentrations of RACat the P-γ-ABA/GCE
表1 猪肉样品中RAC的回收率的测定(n=6)
Table 1 Results of tests for recovery
样品编号样品测定值/(mol·L-1)加入的标准量/(mol·L-1)样品的测定总量/(mol·L-1)回收率/%RSD/%102.00×10-72.04×10-71022.3202.00×10-61.96×10-6982.8301.00×10-59.96×10-699.63.1
将制备好的电极连续扫描6次，电流响应仅下降1.5%。然后将其置-4℃避光保存，7 d后响应电流变化率不超过5.0%，表明该传感器的稳定性较好。分别制备同一批次3支电极对RAC进行检测电流变化率不超过3.9%，表明该电极有较好重复性。
3 结论
本试验制备了P-γ-ABA/GCE，用于测定RAC，该方法操作简单，灵敏度高，有较好的稳定性、重现性及抗干扰能力，试验中用于实际样品的检测，结果满意。因此，该方法在食品中RAC的检测方面有较好的应用前景。
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