绿茶是我国产量最大、消费量最大、最有优势的茶类。特种绿茶作为绿茶的一类,是通过不同的制作方法及做形,形成的外形独具一格、内质别有风韵的名茶[1]。珠形绿茶一般使用一芽二、三叶的鲜叶原料,采用曲毫机造型的独特工艺,所加工出的产品具有颗粒圆结、色泽绿润、香高持久、滋味浓爽、汤色清亮、叶底绿明等特点[2]。珠形绿茶的鲜叶原料较成熟,适合推广机械化采摘,可大大降低生产成本,是当前提倡生产的大众消费型名优茶的代表性类型[3]。香气、滋味及汤色是绿茶茶汤的主要品质特征,其中滋味是决定绿茶风味品质的关键因子[4]。色泽也是绿茶品质的重要评价指标之一[5-6]。目前对珠形绿茶的研究多数集中于茶叶机械、加工工艺等方面[2,7-8],少数涉及品质成分分析[9],可见对构成珠形绿茶品质特征的感官品质、色泽、滋味化学成分组成及含量的研究尚不系统。
主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)是目前食品领域比较常见的多元统计技术[10-17]。本研究针对涌溪火青、绿宝石和平水日铸3个主要珠形绿茶样品,采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法、色差计及分光光度计等常规方法进行系统的化学成分含量、色差值检测和分析,结合多元统计分析技术,揭示其主要滋味化学成分含量、色差值在不同产地珠形绿茶样品中的差异,以期明确珠形绿茶的主要品质特征。
实验样品来自安徽宣城、贵州遵义及浙江绍兴的珠形绿茶主产区,所有样品的加工均按照珠形绿茶初制工艺进行,基本工艺流程为“鲜叶→杀青→揉捻→做形→干燥”,茶样经过粉碎后用铝箔袋低温密封储存。
咖啡碱、没食子酸(gallic acid, GA) 、没食子儿茶素(gallocatechin, GC) 、表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC) 、儿茶素(catechin, C) 、表儿茶素(epicatechin, EC) 、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG) 、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate, GCG)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate, ECG) 和儿茶素没食子酸酯(catechingallate, CG),Sigma公司;乙酸、乙腈、甲醇、KH2PO4等试剂为色谱纯;福林酚、AlCl3、氯化亚锡、茚三酮等试剂均为国产分析纯。
表1 不同产地珠形绿茶样品信息
Table 1 Information of bead-shaped green tea samples from different places
编号名称产地品种鲜叶规格生产日期生产厂家01~06涌溪火青安徽宣城涌溪柳叶种一芽二叶为主2018.4~2018.5安徽泾县其华涌溪火青茶叶有限公司07~10绿宝石贵州遵义群体种一芽二叶为主2018.4~2018.5贵州凤香苑茶业有限责任公司 11~16平水日铸浙江绍兴龙井43一芽二叶为主2018.4~2018.5绍兴柯桥日香红茶叶专业合作社
Waters 2695 高效液相色谱、2998 PDA检测器,美国Waters公司;CM-5色差计,日本柯尼卡美能达公司;岛津UV-2550紫外-可见光分光光度计,日本岛津公司;Milli-RO PLUS 30纯水机,法国Millipore公司;Waters Symmetry C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;HHS型恒温水浴锅,上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3.1 感官审评评分
根据GB/T 23776—2018(茶叶感官审评方法)中的绿茶审评法,由专业人员对样品的外形、汤色、香气、滋味和叶底进行感官审评,总分=外形×0.25+汤色×0.10+香气×0.25+滋味×0.30+叶底×0.10。
1.3.2 容重含量测定
采用量筒法测定茶叶容重。茶叶加料方法选择自然堆放法,手工加料,使供试材料表面基本和容器刻度线平齐,读取容积数值,称量茶叶质量。计算公式如式(1):
(1)
式中:R,茶叶容重,g/L;G,为茶叶质量,g;V为茶叶所占量筒体积,L。
1.3.3 色差测定方法
色差法(亮度L值,红绿色度a值、黄蓝色度b值、色相b/a值)测定(光源D65,角度4 °),干茶混匀随机取样,用专用比色皿测定;汤色采取3 g茶叶加150 mL沸纯净水冲泡5 min,过滤后用专用比色皿测定[18]。
1.3.4 化学成分测定方法
水浸出物含量测定参照GB/T 8305—2013《茶:水浸出物测定》恒温干燥法;茶多酚含量测定参照GB/T 8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检验方法》福林酚法;氨基酸含量测定参照GB/T 8314—2013《茶:游离氨基酸总量的测定》茚三酮比色法;可溶性总糖的测定采用蒽酮-硫酸法[19];黄酮化合物含量的测定采用三氯化铝法[19]。
儿茶素、没食子酸及咖啡碱含量的测定采用高效液相色谱法[20],流动相为0.2 %乙酸和乙腈,色谱条件:检测波长为278 nm,流速:1 mL/min,柱温:25 ℃,进样量:10 μL,流动相梯度洗脱。
每组试验数据重复测定3次,采用SPSS 22.0和SIMCA 13.0软件进行显著性分析、PCA与PLS-DA分析。
3个产地珠形绿茶感官审评结果如表2所示,涌溪火青总分为85.5~90.2,大部分样品呈颗粒状、茶汤嫩绿、有栗香、滋味较甘醇,总分最高;绿宝石总分为86.4~87.6,大部分样品呈颗粒状、汤色绿、香气清高、微有栗香或花香、滋味尚浓醇;平水日铸总分为84.1~87.5,大部分样品稍呈颗粒状、汤色嫩黄或黄绿、以清香为主、带闷、滋味较浓醇。
茶叶容重是反映商品茶物理性状的一个重要指标。由表3可知,珠形绿茶平均容重从大到小依次为:绿宝石、涌溪火青和平水日铸,平水日铸在外形审评中稍呈颗粒状,紧结度低于两类珠形绿茶,与容重测定结果一致,容重差异可能与其做形工艺参数变化有关。3个产地绿茶的干茶与茶汤亮度L值差异较小,绿宝石的干茶和茶汤色差a值最小、绿度最好,涌溪火青的干茶和茶汤色差b值最小、蓝度较好,干茶和茶汤色相b/a值分别以涌溪火青和绿宝石最高。
不同产地珠形绿茶主要滋味化学成分如表3所示,涌溪火青、绿宝石和平水日铸的水浸出物总量较为接近,其平均含量分别为43.87 %、43.24 %和42.75 %;游离氨基酸总量以绿宝石略低于其他2个产地珠形绿茶;涌溪火青和绿宝石的茶多酚、儿茶素含量相近,都显著高于平水日铸;绿宝石的可溶性糖含量低于其他2个产地珠形绿茶,而黄酮含量则较高;涌溪火青、绿宝石和平水日铸的咖啡碱较为接近,其平均含量分别为3.80 %、3.51 %和3.40 %。涌溪火青和平水日铸的滋味鲜爽度、甘甜度明显高于绿宝石,与其高含量的氨基酸和可溶性糖相关。儿茶素组成方面,EGCG、GCG、ECG、EGC的含量较高且以平水日铸显著低于其他2个产地。
表2 不同产地珠形绿茶感官审评结果
Table 2 Sensory evaluation of bead-shaped green tea samples produced from different areas
茶样外形汤色香气滋味叶底评语得分评语得分评语得分评语得分评语得分总分01盘花呈颗粒状、略有毫、尚嫩绿稍深89浅嫩绿、明亮、微有沉淀90高爽、有栗香92较甘醇、较鲜爽、微涩90软匀、有芽、绿明8990.202盘花呈颗粒状、微有毫、深绿88嫩绿、明亮、微有沉淀93高鲜、有栗香92.5尚浓醇、较甘鲜、微涩89.5软匀、有芽、较绿明8890.103盘花呈颗粒状、微有毫、深绿88.5嫩绿、明亮、微有沉淀92高鲜、有栗香92尚浓醇、较鲜爽、略涩88.5软尚匀、较绿稍深87.589.604盘花呈颗粒状、微有毫、深绿88.5嫩绿、明亮、微有沉淀93清高、微有栗香91较甘醇、较鲜爽91软尚匀、较绿8690.105盘花呈颗粒状、微有毫、深绿88尚嫩绿、偏黄、明亮、微有沉淀90较高鲜、有栗香90醇、尚甘鲜、微涩88.5软尚匀、较绿稍深8688.706盘花稍呈颗粒状、微有毫、深绿稍欠润86黄绿、明、微有沉淀85有栗香、闷84尚浓醇、略熟闷、微涩87软、带茎、尚绿8485.507盘花呈颗粒状、带黄片、稍有嫩茎、深绿86.5绿明、有沉淀88清高、微有花香90尚浓醇、尚甘鲜、微青涩87.5软、带茎、尚绿8487.608盘花呈颗粒状、稍带黄头、茎、深绿86.5绿、较明亮、有沉淀89较清高、有花香89尚浓醇、尚甘鲜、微青、略涩87软、带茎、黄绿8487.309盘花呈颗粒状、稍带黄头、片、茎、深绿86.5绿、较明亮、有沉淀89较清高、微有花香89尚浓醇、尚甘鲜、略青涩86软、带茎、黄绿848710盘花稍呈颗粒状、带黄头、片、茎、深绿85绿、较明亮、有沉淀89尚清高、微有花香88尚浓醇、尚甘鲜、微青、略涩86软、带茎、黄绿8486.411盘花呈颗粒状、略有毫、黄绿润89嫩黄绿、明亮、稍有沉淀89清香、闷83尚浓醇、较甘、微涩、略闷87嫩匀、有芽、较嫩绿908712盘花稍呈颗粒状、有毫、带爆点、绿89较绿明88清香、略闷83醇爽、较甘、略涩、略闷89嫩匀、有芽、嫩绿9087.513盘花尚呈颗粒状、微有毫、带黄片、绿稍深86黄绿、明亮、稍有沉淀88清香、微闷86醇、较甘、略涩、微闷86软尚匀、尚绿848614盘花稍呈颗粒状、带黄头、片、茎、黄绿87黄绿、明、稍有沉淀87清香、闷83较浓醇、略涩、略闷86软较匀、微有芽、较绿87.585.815盘花稍松、多黄松块、带茎、有爆点、黄绿82嫩黄绿、明亮、稍有沉淀87清香、熟闷83较浓醇、尚鲜、略涩86软尚匀、黄绿8384.116盘花呈颗粒状、较匀齐、深绿88较绿明、稍有沉淀87清香、略有火工87尚浓醇、较甘、略涩87软较匀、较绿8787.3
绿茶色泽特征为清汤绿叶,杀青是形成该色泽特征的关键工序,有研究表明,微波杀青和汽热杀青的色泽较优[21]。对珠形绿茶而言,做形温度及时间对其色泽的影响也很大。绿茶的滋味特征主要为苦、涩、鲜、甜,基本没有酸、咸味[22]。儿茶素是绿茶茶汤中的多酚类的主体物质,表型儿茶素约占儿茶素总量的70 %,以EGCG的含量最高,主要呈现出苦味和涩味,其中EGCG的苦味强于涩味,EGC的涩味强于苦味,ECG的苦涩味相当,少数人甚至觉得EC具有鲜味和咸味[23-26]。茶叶滋味、色泽的形成主要受茶树品种、栽培环境、采摘季节、加工工艺等因素影响,促使茶叶化学物质的组成和含量存在差异,从而产生不同类型的风味品质。
表3 不同产地珠形绿茶色差及化学成分含量
Table 3 Chromatic aberration and contents of chemical components in bead-shaped green teas from different areas
品质指标涌溪火青绿宝石平水日铸平均值范围平均值范围平均值范围容重/(g·L-1)380.44a350.11~407.42394.16a376.76~428.07317.19b258.17~363.82L(干茶)24.79a21.24~28.8725.29a23.81~26.0527.47a25.48~29.98a(干茶)0.46a0.33~0.68-0.56c-0.67~-0.46-0.21b-0.26~-0.19b(干茶)8.32b6.08~11.108.73b8.13~9.4810.61a9.63~11.45b/a(干茶)18.56a13.64~24.30-15.97b-20.77~-12.95-50.36c-60.26~-40.24L(茶汤)98.79a98.30~99.0498.76a98.54~98.9398.25b97.92~98.49a(茶汤)-2.35a-2.95~-1.37-4.01b-4.25~-3.76-2.32a-3.60~-1.69b(茶汤)8.20b5.38~9.6412.05a10.83~13.2710.42a8.46~13.46b/a(茶汤)-3.54a-4.03~-3.26-3.00a-3.12~-2.88-4.63b-5.28~-3.73水浸出物/%43.87a39.90~47.0043.24a42.00~44.5442.75a40.03~45.13茶多酚/%21.03a17.81~22.6821.03a18.54~22.2313.53b10.87~18.63可溶性糖/%5.34ab3.07~7.074.26b3.78~4.926.58a5.48~8.30咖啡碱/%3.80a3.41~4.093.51a3.31~3.693.40a2.84~3.81氨基酸/%2.60a2.18~3.272.21a1.94~2.592.69a1.97~3.32黄酮/%1.15b0.87~1.881.53a1.43~1.771.00b0.78~1.36没食子酸/%0.22b0.16~0.320.16b0.13~0.190.32a0.21~0.38GC/%1.18a0.64~1.421.02a0.92~1.120.91a0.67~1.06EGC/%1.79a1.20~2.081.61a1.48~1.900.87b0.63~1.26C/%0.26a0.05~0.670.48a0.37~0.600.45a0.19~1.07EGCG/%5.35a5.19~5.615.22a4.67~5.783.18b2.84~3.46EC/%0.65b0.54~0.740.77a0.74~0.820.59b0.49~0.70GCG/%1.87a1.42~2.422.10a1.77~2.331.14b1.00~1.40ECG/%1.42b1.10~1.671.70a1.59~1.881.21b1.09~1.49CG/%0.31b0.24~0.410.43a0.35~0.470.27b0.22~0.35儿茶素总量/%12.83a11.39~14.1213.33a12.74~14.038.61b7.65~9.55
注:表中数据为3个平均值,同行中不同字母表示差异显著(P<0.05)。表中%为质量分数。
由于茶叶成分种类多、成分复杂,且受茶树品种、原产地及加工条件等多方面影响,很难通过简单的数据分析获得有效的变量。多元统计分析是一种综合分析方法,能够在多个对象和多个指标互相关联的情况下分析目标样品的统计规律,主要研究客观事物中多个变量之间相互依赖的统计规律性[27]。其中PCA是常见的统计学分析手段,首先本研究基于不同产地珠形绿茶色泽与滋味成分的含量建立了相应的PCA模型,如图1-A所示,统计分析结果表明,绿茶样品以产地为指定变量可获得较好聚类效果。
对3个主产地珠形绿茶滋味化学成分及色差等进行主成分分析,结果如图1-A、图1-B、表4所示,第1主成分方差贡献率为44.597 %,总儿茶素、b/a(茶汤)的贡献率最大,对应的特征向量为0.968、0.938,这些成分对茶汤滋味的苦涩味和厚度,茶汤的色泽有重要贡献,因此第1主成分主要反映珠形绿茶的苦涩味及茶汤色差;第2主成分方差贡献率为17.696%,干茶色差a值和茶汤色差a值的贡献率最大,对应的特征向量为0.876和0.664,因此第2主成分主要反映珠形绿茶干茶和茶汤的色泽;第3主成分方差贡献率为7.791%,可溶性糖的贡献率最大,对应的特征向量为0.659,可溶性糖对茶汤的甜度有影响,因此第3主成分主要反映珠形绿茶茶汤的甜味;第4主成分方差贡献率为5.872%,EC的贡献率最大,对应的特征向量为0.384,因此第4主成分主要反映珠形绿茶茶汤的苦涩味;第5主成分方差贡献率为5.265%,C的贡献率最大,对应的特征向量为0.488,因此第5主成分主要反映珠形绿茶茶汤的苦涩味;5个主成分方差累计贡献率达到81.222 %,可基本反映总体情况。因子载荷图可以反映每一个变量在得分图上的贡献,以第1、第2主成分作PCA载荷图可以直观看出,变量17(总儿茶素)、变量25(b/a(茶汤))在第1主成分上贡献率最高,变量19(干茶色差a值)、变量23(茶汤色差a值)在第2主成分上贡献率最高(图1-B)。
PLS-DA为有监督的分析,人为加入了分组变量,可弥补PCA方法的不足,强化组间的差异,因此具有高效的鉴别能力,可进一步对特征化合物进行发现和筛选[28]。本研究采用SIMCA-P 13.0软件对绿茶检测结果进行分析,基于珠形绿茶色泽与主要滋味成分的含量建立了PLS-DA模型,通过PLS-DA模型更好地区分了3个产地的珠形绿茶样品。将模型建立时定义的分类Y矩阵的变量随机排列20次,得到随机的不同相应Q2值作为衡量模型是否过拟合的标准。检验结果显示,R2=0.202,Q2=-0.608,Q2负值表明该PLS-DA模型可靠,未存在过拟合现象,可以用于各自类别的判别分析。PLS-DA变量重要性因子(variable important for the projection,VIP)值可以量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献,VIP值越大,变量在不同产地间差异越明显[29]。从化学成分中鉴定出影响珠形绿茶品质的8种关键成分指标(VIP>1.0,SE<0.5) (图2-D),它们分别是a(干茶)、b/a(干茶)、b(茶汤)、a(茶汤)、EGCG、总儿茶素(catechins)、CG和EGC,可以作为区别3个产地珠形绿茶的标志物。
表4 主成分分析的特征值
Table 4 Eigenvalues of principal component analysis
主成分初始特征值提取平方和载入合计方差的贡献率/%累积贡献率/%合计方差的贡献率/%累积贡献率/%111.14944.59744.59711.14944.59744.59724.42417.69662.2934.42417.69662.29331.9487.79170.0841.9487.79170.08441.4685.87275.9561.4685.87275.95651.3165.26581.2221.3165.26581.22261.1624.64785.8681.1624.64785.86870.9163.66389.531…………240.0000.001100.000
表5 主成分分析的特征向量
Table 5 Eigenvectors of principal component analysis
成分指标主成分123456容重0.763-0.0290.1370.1410.231-0.020茶多酚0.8140.297-0.1810.2440.173-0.017多糖-0.614-0.0980.6590.062-0.097-0.199氨基酸-0.4870.477-0.3540.1360.3140.217黄酮0.682-0.4760.065-0.195-0.043-0.194水浸出物0.1080.446-0.7460.124-0.2120.248GA-0.8030.0680.200-0.1010.335-0.003GC0.5810.2510.274-0.556-0.2000.266EGC0.8630.354-0.037-0.036-0.228-0.030C-0.039-0.492-0.0380.0970.4880.504咖啡碱0.5100.3930.203-0.4420.2610.305EGCG0.8530.3250.0540.356-0.036-0.119EC0.679-0.3820.0400.384-0.0980.141GCG0.910-0.0740.222-0.0790.1150.114ECG0.766-0.3830.1580.3230.165-0.093CG0.721-0.4970.145-0.1040.2730.146儿茶素总量0.9680.1050.1130.1420.0160.045L(干茶)-0.556-0.3030.2460.236-0.4120.194a(干茶)0.0760.8760.360-0.0610.0370.025b(干茶)-0.754-0.2750.2830.3700.1640.081b/a(干茶)0.7170.6010.2020.156-0.047-0.127L(茶汤)0.083-0.0550.2840.196-0.4570.636a(茶汤)-0.6700.6640.2030.1140.1080.029b(茶汤)0.177-0.822-0.262-0.315-0.142-0.035b/a(茶汤)0.938-0.070-0.0370.0380.012-0.098
A-PCA 得分图;B- PCA 载荷图;C-PLS-DA 得分图;D-VIP>1关键成分;Y-涌溪火青;L-绿宝石;P-平水日铸
图1 不同产地珠形绿茶化学成分PCA得分图、PCA载荷图、PLS-DA得分图及其VIP值
Fig.1 Score plot of PCA and PLS-DA, PLS-DA model of validate components, VIP values inbead-shaped green teas from different different areas
3个产地珠形绿茶中涌溪火青大部分样品呈颗粒状、茶汤嫩绿、有栗香、滋味较甘醇,总分最高,绿宝石大部分样品呈颗粒状、汤色绿、香气清高、微有栗香或花香、滋味尚浓醇,平水日铸大部分样品稍呈颗粒状、汤色嫩黄或黄绿、以清香为主、带闷、滋味较浓醇;绿宝石的容重最大、干茶色差最好,涌溪火青和绿宝石的茶多酚、儿茶素含量相近,都显著高于平水日铸,绿宝石的可溶性糖含量显著低于其他产地,而黄酮总量显著高于其他产地,3个产地绿茶水浸出物、氨基酸、咖啡碱的含量无显著差异(P<0.05)。在主成分分析中,提取了PC1和PC2两个主成分,解释了不同珠形绿茶特征变量62.293%的方差信息,不同产地珠形绿茶区域区分相对明显,可视化效果直观。利用偏最小二乘判别分析法建立珠形绿茶相关模型,得出变量重要性(VIP)图且得出相关指标8种,分别是a(干茶)、b/a(干茶)、b(茶汤)、a(茶汤)、EGCG、总儿茶素、CG和EGC,对这些指标的研究将会对珠形绿茶差异特征分析提供有利的支持。
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