狮子头即大肉丸子，是我国最主要的调理肉制品之一，因其能较好地保留食品原料独特的色泽、鲜味和香气等，深受广大消费者的青睐。但速冻调理狮子头在贮藏运输过程中易发生脂肪氧化问题，加之我国冷链行业发展不均衡，整体冷链体系还不够完善[1]，产品在运输、销售过程中因温度波动而发生反复冻融，使得狮子头内部冰晶变大，产品内部结构遭到破坏、细胞破裂并释放出大量氧化酶。因此，反复冻融过程中水分分布状态的变化与脂肪氧化关系密切。虽然较低的贮藏环境可降低酶的活性，但脂肪氧化反应并不会因此而停滞[2]，从而造成产品产生酸败味和褐变[3]，严重降低其食用品质。
目前，肉制品氧化的检测指标主要有酸价、过氧化值和TBARS等[4-5]，然而这些指标在测定过程中对产品具有破坏性、试剂较为昂贵且部分具有毒性，测定过程也耗时、费力。因此，探索简便、快捷的肉制品脂肪氧化检测方法具有重要的实际意义。低场核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)技术是一种无损、快速的光谱检测技术[6]，采用氢原子核在磁场中产生的核磁共振信号，通过指数拟合反映出不同T2弛豫时间，从而获得肉制品水分分布状态和迁移规律，是目前国际上研究肉制品水分分布最有效的手段之一[7-8]。目前，LF-NMR技术已成功应用于肉制品[9-11]、蛋品[12]、果蔬[13-14]、食用菌[15-16]等产品贮藏及干燥过程中水分分布及迁移规律的研究。但鲜有研究反复冻融对调理狮子头脂肪氧化的影响，且未见从水分分布角度解释脂肪氧化变化的报道。
本研究利用低场核磁共振技术分析反复冻融过程中调理狮子头的水分变化与分布，并将水分变化与脂肪氧化指标进行相关性分析，旨在探讨肉制品脂肪氧化与低场核磁共振弛豫特性的关系，进一步探索借助低场核磁共振技术检测脂肪氧化的可行性，为肉制品脂肪氧化的监测及科学贮藏提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪后腿纯瘦肉、肥膘肉、食盐、味精等，购买于郑州双汇专卖店。
乙二胺四乙酸二钠、正己烷、冰乙酸、KI、三氯乙酸、三氯甲烷、硫代巴比妥酸，均为分析纯，购买于郑州市金图试剂公司。
1.2 仪器与设备
AL104电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；THZ-C台式恒温振荡器，太仓市华美生化仪器厂；UV-2600紫外分光光度计，岛津企业管理有限公司；N-1100旋转蒸发仪，东京理化器械株式会社；ZDJ-5B自动电位滴定仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；PQ001MicroMR柜式NMR成像仪，上海纽迈电子科技有限公司；核磁样品管(1 cm×3.5 cm)，上海纽迈电子科技有限公司；DZ-260PD台式真空包装机，温州市大江真空包装机械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 狮子头加工方法
狮子头加工工艺流程如下：
原辅料预处理→绞肉→成型→预煮→包装→速冻
工艺要点：预煮参数为85 ℃，4 min；包装形式采用真空包装机进行袋口密封，工作程序为中温，真空10 s，封口2 s；速冻参数为-37 ℃，30 min。
具体配方：新鲜猪后腿精瘦肉350 g、新鲜肥膘肉150 g、食盐6 g、料酒20 g、香葱43 g、嫩姜14 g、莲菜143 g、鸡蛋清20 g、玉米淀粉50 g、生抽10 g、老抽20 g、大豆分离蛋白30 g、纯白胡椒粉1 g、味精2 g、复合磷酸盐1 g。
贮藏条件：模拟物流温度，肉制品在冷冻运输过程中温度一般控制在-18 ℃以下；超市在销售过程中，冰柜温度一般设置为-10 ℃；产品被消费者购买后，因无法及时放入低温环境进行贮藏，速冻肉制品温度会上升至0 ℃以上。基于以上温度波动，实验过程中所采取的温度条件：-18 ℃(3 d)、-10 ℃(3 d)、4 ℃(1 d)为一个冻融循环，共循环7次，每次取解冻后肉样进行指标分析。
1.3.2 酸价测定
方法参照国标GB 5009.229—2016中第二法检测[17]，油脂提取方法稍作修改，将石油醚更改为正己烷。
1.3.3 过氧化值测定
方法参照国标GB 5009.227—2016中第一法检测[18]。
1.3.4 硫代巴比妥酸值(TBARS)的测定
方法参照国标GB 5009.181—2016中第二法检测[19]。
1.3.5 自旋-自旋弛豫时间(T2)的测定
将狮子头切成5个1 cm×1 cm×2 cm的肉块，在每个肉块外包裹一层保鲜膜，再将包裹保鲜膜的肉块放入特定的样品管中，用低场核磁共振仪进行样品的自旋-自旋弛豫时间T2测定，每个冻融循环测定5个平行。在32 ℃、22.4 MHz共振频率下，使用CPMG脉冲序列(90°脉冲和180°脉冲之间的时间 τ=200 μs)，P1=16.00 μs(硬脉冲90°脉宽)，P2=30.00 μs(硬脉冲180°脉宽)，TD=187 524(采样点数)，SW=250 KHZ(采样频率)，NS=16(累加次数)，TW=3 000 ms(重复采样等待时间)，NECH=3 000(回波个数)。所得LF-NMR回波序列用核磁自带软件进行反演，得到样品中不同水分的横向弛豫特性，最后对实验结果进行分析[20]。
1.4 数据处理与统计分析
试验数据采用SPSS 22.0处理并进行Duncan差异显著性分析、Pearson相关性分析，用Origin 8.5进行绘图处理。
2 结果与分析
2.1 冻融次数对酸价的影响
由图1可知，随着冻融次数的增加，狮子头的酸价呈先增后减的趋势。贮藏初期，酸价显著增加，在第3次冻融循环时，酸价达到最高值7.41 mg/g。继续贮藏，狮子头的酸价开始下降，特别在第4次冻融循环之后，酸价显著下降(P<0.05)。因为在贮藏前期，细胞在冰晶的作用下破裂，脂肪水解酸败程度不断增加，到了贮藏后期，脂肪发生氧化酸败，在氧气的作用下游离脂肪酸生成过氧化物[21]，游离脂肪酸的分解速率超过了其生成速率，导致狮子头的酸价逐渐下降。
图1 冻融次数对狮子头酸价的影响
Fig.1 Effect of freeze-thaw cycles on acid valueof large meatball注：图中不同小写字母表示差异显著，下同。
2.2 冻融次数对过氧化值的影响
过氧化值可表征脂肪酸初级氧化的程度。由图2可知，随着冻融次数的增加，狮子头的过氧化值呈先增后减的趋势。循环冻融1～4次时，过氧化值逐渐增加，在第4次冻融时达到最高值，可能与细胞受挤压破裂加速了脂肪氧化有关[22]。第3次冻融后酸价出现下降，而过氧化值显著增加，说明氢过氧化物的生成速率大于脂肪酸的生成速率，脂肪氧化程度进一步加深。之后过氧化值显著下降，因为氢过氧化物极不稳定，可进一步分解成醛类、酮类等小分子化合物，从而导致过氧化值降低。
图2 冻融次数对狮子头过氧化值的影响
Fig.2 Effect of freeze-thaw cycles on peroxidevalue of large meatball
2.3 冻融次数对TBARS的影响
脂肪水解产生的游离脂肪酸在贮藏过程中发生氧化，生成醛、酮类等物质，造成TBARS值逐渐增加[23]。醛、酮、酸等小分子物质是脂肪氧化酸败的终产物，具有较强的挥发性，且醛类物质占最终产物的绝大部分[24]，所以通过测定丙二醛含量可得知产品脂肪氧化酸败的程度，TBARS值越大，表明脂肪氧化酸败的程度越高。由图3可知，随着冻融次数的增加，TBARS值呈上升趋势。当冻融至第7次时，TBARS值达最高1.31 mg/kg，说明狮子头的脂肪氧化酸败程度加深。在反复冻融过程中，狮子头中水分转变为大小不同的冰晶，内部组织的网状结构遭到破坏，形成较大空洞，使脂肪与氧气的接触面积变大，加快了脂肪氧化酸败的程度。
图3 冻融次数对狮子头TBARS的影响
Fig.3 Effect of freeze-thaw cycles on TBARS of large meatball
2.4 冻融次数对横向弛豫时间的影响
2.4.1 冻融次数对自旋-自旋弛豫过程的影响
图4是调理狮子头在冻融贮藏过程中的NMR横向弛豫时间的反演图谱，表1为结合水、不易流动水和自由水的出峰时间，在弛豫图谱中一共出现3个峰T21、T22和T23。T21(1～10 ms)表征结合水，与有机大分子结合紧密，存在于肌纤维的内部，作用力强，一般不易失去；T22(10～100 ms)表征不易流动水，为肌原纤维蛋白外部的水，稳定程度相对于结合水较弱；T23(100～1 000 ms)表征自由水，是最不稳定的水分存在状态，在贮藏过程中极易失去[25]。T2反映样品中水分自由度的大小，T2越大，说明水分自由度越高，与其他物质的结合程度越不紧密[26]。由图4、表1可以看出,T22冻融2次时显著变化，T21冻融4次时显著变化，这与结合水比不易流动水稳定有关；冻融1～5次时T21增加，可能与水分从结合水向不易流动水迁移有关，冻融6～7次时T21出现下降，因为反复冻融导致狮子头内部组织结构破坏，不易流动水向结合水迁移，多次冻融后，水分流失严重，导致T21前移；T22从冻融2次时开始后移，说明不易流动水的流动性增加，即不易流动水向自由水迁移。T22、T23峰面积随冻融次数增加呈下降趋势，说明狮子头中不易流动水和自由水含量随着反复冻融逐渐减少。
图4 狮子头的横向弛豫时间(T2)分布
Fig.4 Transverse relaxation time (T2)distribution of large meatball
表1 不同冻融次数狮子头T21、T22、T23的变化
Table 1 Changes of T21, T22 and T23of large meatball in different freeze-thaw cycles
冻融次数/次T21/msT22/msT23/ms11.754±0.012b32.752±0.006b265.609±0.010a21.761±0.015b37.649±0.005a231.307±0.265c31.758±0.009b37.652±0.003a264.942±0.577a42.009±0.003a37.659±0.009a265.442±0.153a52.016±0.003a37.654±0.005a231.680±0.577bc62.009±0.005a37.663±0.012a232.346±0.568b71.749±0.006b37.655±0.007a231.438±0.547c
注：表中不同小写字母表示差异显著。
2.4.2 冻融次数对不同状态水分相对含量的影响
T2反演谱各水分的峰面积比例可以表示其对应水分(结合水P21、不易流动水P22、自由水P23)的相对含量，冻融过程中不同状态水分相对含量的变化如表2所示。由表2可知，P21在贮藏过程中数值有所降低，说明结合水在总水分中所占比例减小，水分向不易流动水和自由水迁移，冻融循环6次时，P21开始增加，这与表1中T21所反映的结果相一致。P22在贮藏过程中呈先增后趋于稳定的趋势，在第5次冻融之前不断增加，因为在贮藏过程中，狮子头组织结构遭到破坏，自由水不断流出，造成不易流动水所占总水分比例增加。P23在整体贮藏过程中呈下降趋势，自由水不稳定，易随汁液流失。
表2 不同冻融次数狮子头P21、P22、P23的变化
Table 2 Changes of P21, P22 and P23 of large meatball in different freeze-thaw cycles
冻融次数/次P21/%P22/%P23/%15.09±0.20ab92.94±0.20d1.96±0.10a25.38±0.20a93.12±0.00cd1.51±0.10cd34.90±0.40b93.65±0.20bcd1.46±0.01d44.18±0.06c93.93±1.73abcd1.86±0.10a53.63±0.10d95.03±0.11a1.41±0.01d63.89±0.10cd94.49±0.10ab1.61±0.02bc74.06±0.01c94.29±0.20abc1.65±0.01b
注：数值表示为平均值±标准误差；在同一行中，标有不同上标字母表示差异显著(P<0.05)；未标字母或标有相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
2.5 横向弛豫特性与脂肪氧化指标的相关性分析
将冻融过程中调理狮子头弛豫特性与脂肪氧化指标进行相关性分析，结果见表3。由表3可知，冻融次数与T23、P21极显著负相关(P<0.01)，与过氧化值显著正相关(P<0.05)，与T22、P22、TBARS极显著正相关(P<0.01)，表明狮子头脂肪氧化程度、水分变化与冻融次数之间显著相关，在贮藏过程中应尽可能减少肉制品冻融次数。
T21与P21极显著负相关(P<0.01)，与P22、过氧化值极显著正相关(P<0.01)，从相关性分析可以看出T21与其他指标间相关性不大，因为随着冻融次数的增加，T21变化不显著(P>0.05)。T22与T23显著负相关(P<0.05)，与冻融次数、P23、酸价、过氧化值、TBARS极显著正相关(P<0.01)，表明狮子头冻融过程中脂肪氧化对其不易流动水的稳定性有着显著影响。P21与冻融次数、T21、P22、过氧化值、TBARS极显著负相关(P<0.01)，表明随着冻融次数的增加，以稳定状态存在的结合水因狮子头组织状态、氧化程度的变化向不易流动水发生迁移。P22与P21极显著负相关(P<0.01)，与冻融次数、T21、TBARS极显著正相关(P<0.01)，与T22、过氧化值极显著正相关(P<0.01)，表明不易流动水的相对含量与脂肪氧化有关，随着冻融次数的增加，不易流动水向自由水发生迁移。P23与T22、TBARS极显著负相关(P<0.01)，与T23显著正相关(P<0.05)。
表3 各指标间的相关性分析
Table 3 Correlation analysis between various indicators
指标冻融次数T21T22T23P21P22P23酸价过氧化值TBARS冻融次数10.4170.613∗∗-0.573∗∗-0.821∗∗0.661∗∗-0.2860.3220.490∗0.875∗∗T2110.358-0.157-0.729∗∗0.550∗∗-0.0740.4040.763∗∗0.423T221-0.478∗-0.4140.452∗-0.674∗∗0.606∗∗0.557∗∗0.883∗∗T2310.365-0.4030.553∗0.3150.120-0.676∗∗P211-0.692∗∗0.192-0.381-0.643∗∗-0.689∗∗P221-0.2590.3580.455∗0.604∗∗P231-0.2980.032-0.619∗∗酸价10.750∗∗0.432过氧化值10.498∗TBARS1
注：**表示在P<0.01 水平(双侧)上显著相关，*表示P<0.05 水平(双侧)上显著相关。
2.6 TBARS与弛豫特性的回归模型
从相关性分析可以看出，狮子头在冻融过程中TBARS值与水分迁移及含量变化存在显著相关性(P<0.05)，且不易流动水是狮子头中水分的主要存在形式，TBARS值是反映肉类脂肪氧化酸败的一个直接指标[27]。因此，可用T22、P22作为冻融过程中狮子头氧化程度的检测指标。将TBARS值与T22、P22进行回归分析，其回归模型参数及检验如表4所示，y表示氧化指标TBARS值，x1、x2分别表示T22、P22。F检验反映模型中全部解释变量对被解释变量的共同影响是否显著，T检验反映每个解释变量对被解释变量的影响是否显著，由表4可知，回归方程均通过F检验和T检验，决定系数R2为0.814，表明所得回归方程具有较高的拟合精度。
表4 TBARS值与弛豫特性的回归模型及其参数
Table 4 Regression model of the TBARS and relaxation properties and their parameters
回归方程系数T检验F检验决定系数R2a=-9.50-3.691∗y=a+bx1+cx2b=0.1047.092∗44.767∗0.814c=6.7872.381∗
3 结论
冻融次数及贮藏时间均显著影响调理狮子头脂肪氧化及水分含量等品质，因此狮子头在流通过程中，应保持温度稳定、减少出现反复冻融等现象。利用低场核磁测得横向弛豫时间T21、T22后移，P22和P23含量不断减少，根据冻融过程中横向弛豫时间的变化可知，借助水分分布与迁移情况判断狮子头的品质变化具有一定可行性。通过横向弛豫特性与脂肪氧化指标的相关性分析发现，冻融次数与T23、P21、T22、P22和TBARS值极显著相关(P<0.01)，与过氧化值显著相关(P<0.05)；TBARS值与T22、P22之间极显著相关(P<0.01)；TBARS值与弛豫特性的回归模型决定系数为0.814，回归方程拟合度较好。
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