快速冻融猪皮明胶理化性质分析

刘廷薇,陈雪珂,马良,戴宏杰,余永,周鸿媛,郭婷,张宇昊*

(西南大学 食品科学学院,重庆,400715)

摘 要 对冻融法猪皮明胶的基本理化性质——色差、SDS-PAGE、氨基酸组成、全质构、流体特性、起泡性和泡沫稳定性进行测定。结果表明,冻融法明胶与传统酸法明胶基本理化性质相似,颜色略微深于传统酸法明胶;冻融法明胶质构特性优良,硬度(368.0 g)显著高于传统酸法明胶(341.0 g)(P<0.05);流体特性结果表明冻融法明胶拥有更高的黏度;起泡性研究表明,冻融法明胶溶液质量浓度从10 g/L到30 g/L,其起泡性和泡沫稳定性均优于传统酸法明胶;SDS-PAGE和氨基酸组成结果显示,赋予快速冻融明胶更好功能特性的原因在于,冻融法明胶较传统酸法明胶含有更多高分子亚基组分和更低的小分子组分,以及更高的亚氨基酸含量(252 g/kg)。快速冻融猪皮明胶具有优良的理化加工特性,为明胶的清洁化生产提供了思路。

关键词 冻融;明胶;理化特性;加工特性

明胶是一种变性纤维蛋白,通过部分热水解从胶原中获得,它是一种重要的功能性生物高聚物,因其生物具有相容性和亲水性等属性,被广泛应用于食品、化妆品、制药和摄影行业[1-3]。明胶在热水提取之前通常需要进行明胶化处理[4]。在明胶化的过程中,胶原中的共价交联和次级键被破坏,胶原的三螺旋结构变得疏松,非螺旋结晶区被破坏,使后续的提胶过程中胶原亚基分子更容易释放[5]

目前,我国明胶生产主要采用酸碱法,酸碱的使用目的主要是破坏胶原中的共价键和部分次级键,使胶原的亚基组分可以在热水提胶过程中被释放,形成明胶。但酸碱的大量使用造成了明胶生产过程的高污染,我国明胶企业规模较小,高额的污水处理系统建设和运行成本严重限制了我国明胶企业产能的扩大和产品的市场竞争。因此,明胶行业污染和高效生产问题的解决归根到底要从工艺入手,做到高效清洁生产,才能促使我国明胶行业健康、快速发展。

2000年以后,酶法制备明胶成为明胶制备工艺改进的主要方向[6],主要是利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等的破坏原料中杂蛋白和胶原蛋白的非螺旋区,使三螺旋结构松散,有利于后期热水提胶。但酶法明胶始终存在小分子组分含量高,明胶凝胶强度低的问题,使之无法在产业化中应用[7-8]。近年来,出现了一些诱导胶原明胶化新方法,CHEN等[9]通过超高压协同稀酸法制备猪皮明胶,结果表明经该法明胶化后提取的猪皮明胶得率最高可达63%(以羟脯氨酸含量计),凝胶强度大多在375~400 g,该法诱导胶原蛋白明胶化的机理在于超高压破坏原料胶原中氢键的平衡,松散胶原分子的三螺旋结构,同时促进稀酸向原料中渗透,并快速破坏胶原分子间共价交联[10]。但该法受限于设备与连续化生产等问题,难以有效实现产业化。

本课题组在胶原明胶化新型工艺的方法上尝试了液氮快速冷冻结合稀酸解冻诱导猪皮胶原明胶化的方法[11],发现液氮处理结合质量分数为1%的HCl溶液的解冻后能有效提取明胶,其明胶得率为18.44%(以原料湿重计),凝胶强度可达368.0 g。原因在于快速冻融过程是水变成冰再快速变成水的过程,存在体积的快速变化,胶原分子中的不易流动水转化成冰时体积增加,快速融化后体积又迅速减小。这一过程中,胶原分子三螺旋结构可能因冰的形成快速膨胀而松散,但融化时,胶原分子又不能尽快复原,同时加之酸的介入破坏了分子间共价交联,从而实现了快速明胶化,这一方法具有实现产业化应用的前景。

但目前对于冻融法明胶的理化性质尚缺乏全面研究与评价,本研究通过对冻融法明胶基本理化性质,明胶亚基组成,氨基酸组成,全质构,流体特性,色差,起泡性和泡沫稳定性等指标的测定,并与传统酸法明胶作对比,对快速冻融猪皮明胶的理化性质进行全面评价,旨在为其在明胶的生产加工和应用方面提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

猪皮,购于重庆市北碚区城南新世纪超市;液氮、HCl、十二烷基苯磺酸钠(SDBS),成都市科龙试剂厂;考马斯亮蓝R-250,BIO BASIC公司;标准蛋白(分子质量10~200 kDa),加拿大Fermentas公司;丙烯酰胺(质量分数为30%),北京索莱宝科技有限公司;考马斯亮蓝R-250、丙烯酰胺为优级纯,其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

SHZ-B水浴恒温振荡器,上海龙跃仪器设备有限公司;4-6型马弗炉,北京市永光明仪器厂;HX-1005恒温循环器,郑州长城科工贸有限公司;TA.XT2i物性测定仪,英国Stable Micro System公司;Power PacTM基础电泳仪,美国Bio-Rad公司;DHR-1流变仪,美国TA公司;752型紫外可见分光光度计,上海箐华科技有限公司;FSH-Ⅱ高速匀浆机,江苏金坛市环宇科学仪器厂;L-8900型全自动氨基酸分析仪,日本日立公司。

1.3 实验方法

猪皮明胶具体制备流程如下:

猪皮→清洗、剪碎→脱脂→清洗→除杂蛋白→清洗、沥干→明胶化处理(传统酸处理或液氮冻融)→热水提胶→过滤、烘干

(1)清洗、剪碎:猪皮清洗后,用刀刮去表面的毛和脂肪,剪成4 mm×4 mm块状。

(2)脱脂:按1∶2.5料液比将猪皮浸泡于7.5 g/L的SDBS溶液中超声脱脂(2 h、120 W、25℃)。

(3)除杂蛋白:将猪皮浸泡于10 g/L的NaCl溶液中,料液比1∶5,磁力搅拌6 h(每2 h换一次溶液)。

(4)明胶化处理:本实验明胶化处理有2种方式,即传统酸法处理或快速冻融处理。

①传统酸法处理:按1∶10料液比将猪皮加入质量分数为1%的HCl溶液中,间断搅动处理6 h,然后冲洗至pH 4~5,以备提胶。

②快速冻融处理:将猪皮用液氮速冻后,立即用质量分数为1%的HCl溶液在40℃条件下水浴解冻20 min,料液比为1∶10,期间不断搅拌,然后冲洗至pH 4~5,以备提胶。

(5)热水提胶:以3倍原料体积加入去离子水,60℃水浴振荡提取6 h。

(6)过滤、烘干:胶液过滤后,倒入塑料盘中,60℃烘干即可。

1.4 分析方法

1.4.1 明胶理化性质分析

1.4.1.1 明胶基本理化性质的测定

蛋白质含量按照GB 5009.5—2010[12]凯氏定氮法测定;水分和灰分分别依照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[13]直接干燥法和GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》[14]马弗炉高温灼烧法进行测定;透明度依照GB 6783—2013《食品添加剂明胶》[15]分光光度法进行测定。

1.4.1.2 明胶色差的测定

配制66.7 g/L的传统酸法明胶溶液和冻融法明胶溶液在(10±0.1)℃恒温循环器内冷凝过夜。用白标板与黑标板矫正色差仪,然后测定样品的色差。

1.4.2 明胶亚基组成

向明胶中加入去离子水,静置1 h后于60 ℃下水浴溶解,得到1.5 g/L明胶样品溶液。按照V(样品溶液)∶V(上样缓冲液)=4∶1加入5×还原性样品缓冲液,涡旋后煮沸5 min,立即冷却上样,样品15 μL,标准蛋白10 μL。SDS-PAGE浓缩胶质量分数为5%,分离胶质量分数为6%。设置初始电流为15 mA开始电泳,当蓝色条带移至分离胶中电流增大到25 mA,当蓝色条带达到凝胶底层时电泳完成。取出凝胶加入考马斯亮蓝染色2 h,之后加脱色液至背景完全透明。

1.4.3 氨基酸组成分析

向水解管中加入20 mg明胶粉末和10 mL,6 mol/L的HCl溶液,抽真空后(110±1)℃沙浴水解22 h,冷却到室温,将水解液过滤,加去离子水定容到50 mL。取1 mL稀释后的滤液,蒸干多余溶剂后加入1 mL、pH 2.2柠檬酸钠缓冲液溶解,振荡混匀,通过0.22 μm针孔过滤膜后即可用全自动氨基酸分析仪测定。

1.4.4 明胶全质构测定

配制66.7 g/L的明胶溶液,于(10±0.1)℃的恒温循环器中冷却16~18 h,用TA.XT2i物性测定仪测定其质构特性。SMSP/0.5圆柱型探头,下压距离4 mm,下压速度1 mm/s。

1.4.5 明胶功能特性

1.4.5.1 明胶流体特性测定

使用DHR-1流变仪分别测定66.7 g/L传统酸法和冻融法明胶溶液在40℃条件下剪切速率在0~50 s-1对黏度的影响情况。

1.4.5.2 明胶起泡性特性的测定

分别配制10、20、30、40 g/L的传统酸法明胶溶液和冻融法明胶溶液放在50 mL离心管中,用高速均质在3 000 r/min速度下搅动1 min,通过泡沫体积占明胶溶液体积的比例表示起泡性。将起泡后的明胶溶液静置20 min,通过失水率来衡量起泡稳定性,失水率越小,起泡稳定性越大,计算公式如式(1)、式(2):

起泡性

(1)

泡沫失水率

(2)

式中:V1,明胶溶液的初始体积,mL; V2,高速均质后明胶溶液与上层泡沫的总体积,mL; V3,下层析出液体的体积,mL。

1.5 数据分析

使用SPSS 17.0和Microsoft Excel 2010进行数据分析。设置3个平行实验,结果用平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 明胶的理化性质

明胶成品呈淡黄色片状,透明度高,如图1所示。明胶作为胶原蛋白的降解产物,有着很高的蛋白含量,是蛋白质的良好来源;明胶中的灰分来源于明胶原料和生产过程中的无机离子和杂质,过高的灰分会影响明胶的胶冻性能;同时明胶中更低的水分含量有利于明胶产品的保存;透射比是衡量其透明度的重要指标,透射比越高代表明胶越透明。由表1可以看出,本研究制备的2种明胶粗蛋白含量均高于90%,其灰分、水分含量和透射比等都符合GB 6783—2013《食品添加剂明胶》[15]的要求。2种方法制备的明胶各基本指标差异较小,说明2种方法制备的明胶其基本理化性质并无二致。

对冻融法明胶和传统酸法明胶凝胶的颜色进行测定,结果如表2所示。冻融法明胶凝胶除a*值外,L*值,和b*值与传统酸法明胶凝胶没有显著差异(P>0.05),但冻融法明胶凝胶的亮度更低,颜色更偏黄。所以,从颜色角度上来看,冻融法制备的明胶凝胶略微深于传统酸法明胶,这可能是因为冻融过程没有经过长时间酸处理,色素类物质溶出量略少。明胶常作为添加剂加入到食品中[16],但添加量不大,因此它本身的颜色基本不会影响到加工产品的颜色。

a-冻融法明胶;b-传统酸法明胶
图1 冻融法明胶成品和传统酸法明胶成品
Fig.1 Gelatin prepared by freezing-thawingmethod and traditional acid method

表1 明胶的基本理化性质
Table 1 The basic physical and chemical properties of gelatin

冻融法明胶传统酸法明胶GB 6783—2013粗蛋白/%(质量分数)92.05±0.87a91.78±1.05a—灰分/%(质量分数)0.63±0.08a0.61±0.12a≤2水分/%(质量分数)7.21±0.53a6.89±0.43a≤14pH4.54±0.21a4.71±0.11a4.5~6.5透射比/%620 nm56.01±0.53a55.29±0.31a≥30450 nm48.46±0.26a47.32±0.42a≥50

注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

表2 冻融法明胶和传统酸法明胶凝胶的色差结果
Table 2 Chromatic aberration results of freezing-thawing gelatin and traditional acid gelatin gels

指标L∗a∗b∗冻融法明胶 32.80±2.87a0.38±0.01a5.87±0.96a传统酸法明胶35.57±0.58a0.32±0.03b5.08±0.59a

注:L*表示亮度;a*为红绿值;b*为黄蓝值。

2.2 明胶的亚基组成

如图2所示,猪皮明胶主要由α(α1和α2)带和β带组成,其中α带主要在100~120 kDa,β带主要在200 kDa左右。电泳图中冻融法明胶的α组分和β组分含量和传统酸法明胶观察不到明显差别。冻融法明胶在200 kDa以上仍能看到更高分子的条带,在明胶凝胶化过程中,高分子亚基组分的自组装和类三螺旋结构的形成与明胶形成高凝胶强度直接相关[5]。此外,传统酸法明胶与冻融法明胶相比,含有更多的低于100 kDa的小分子组分,这可能是因为长时间的酸处理导致更多明胶亚基组分降解所致,明胶中的小分子组分的存在不利于形成高凝胶强度的明胶凝胶[17]。由此可见,冻融法制备的明胶,可以更好地保留明胶的高分子亚基,同时明胶亚基组分降解程度更低,这些赋予明胶更好的凝胶特性。

M-标准蛋白;1-冻融法明胶;2-传统酸法明胶
图2 SDS-PAGE电泳图谱
Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis

2.3 明胶氨基酸组成

表3包含了冻融法和传统酸法所得明胶的氨基酸组成信息。2种明胶中甘氨酸(Gly)含量最高,分别为268 g/kg和299 g/kg,其次为脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp),这与胶原原料有重复的Gly-X-Y序列有关,X和Y通常分别为脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp)。脯氨酸和羟脯氨酸又叫亚氨基酸,它们能够与周围氨基酸侧链基团和水分子形成氢键,有利于类三螺旋结构的稳定[5]。由表3可以看出,冻融法明胶的亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)含量(252 g/kg)高于传统酸法明胶(219 g/kg),使明胶更有可能具有高凝胶强度等好的凝胶特性。

2.4 明胶的质构分析

全质构(TPA)可以客观地反映食品中的力学性质,广泛应用于许多食品中[18]。表4是2种方法所得明胶的TPA结果。冻融法明胶的胶着性、黏性、弹力、内聚性与传统酸法明胶相比差异不显著(P>0.05),但硬度、黏力、咀嚼性显著高于传统酸法明胶(P<0.05)。明胶的硬度直接反映明胶的凝胶强度,冻融法明胶的硬度(368.0 g)显著高于传统酸法明胶(341.0 g)(P<0.05),与SDS-PAGE和氨基酸组成结果一致,说明冻融法明胶具有更优的凝胶特性,这主要与冻融法明胶中含有更多的高分子亚基组分和更少的小分子亚基组分以及跟多的亚氨基酸含量有关。

2.5 明胶功能特性

2.5.1 明胶流体特性分析

结果如图3所示,随着剪切速率的增加,2种明胶溶液的黏度先迅速下降,而后保持稳定,呈现典型假塑性流体特征。随着剪切速率的增加,冻融法明胶的黏度一直高于传统酸处理明胶,说明冻融法制备的明胶分子中有更多的链状高分子胶体粒子,这主要是因为冻融法明胶中高分子组分含量更多,在溶液状态下更容易相互缠结,使体系黏度更高[19],这一结果于2种明胶的分子质量分布结果一致。且在剪切速率刚开始变快的阶段(0~10 s-1),冻融法明胶相比与传统酸法明胶,其剪切变稀的过程更加滞后,由此可见,冻融法明胶对剪切速率的敏感性比传统酸法明胶对剪切速率的敏感性更小。

表3 冻融法明胶和传统酸法明胶的氨基酸组成
Table 3 The amino acid composition of gelatin prepared by freezing-thawing method and traditional acid method

氨基酸冻融法明胶/(g·kg-1)传统酸法明胶/(g·kg-1)天门冬氨酸5159苏氨酸2018丝氨酸2829谷氨酸9289甘氨酸268299丙氨酸109104半胱氨酸43缬氨酸2222蛋氨酸97异亮氨酸1111亮氨酸3434酪氨酸23苯丙氨酸2525赖氨酸2929组氨酸12精氨酸4346脯氨酸135112羟脯氨酸117107

表4 冻融法明胶和传统酸法明胶的TPA结果
Table 4 TPA results of freezing-thawing gelatin and traditional acid gelatin

TPA 快速冻融法明胶传统酸法明胶硬度/g368.00±13.12a341.00±22.08b黏力/g16.00±2.53a10.00±2.11b胶着性/g342.50±8.74a316.20±20.21a黏性/mJ0.40±0.11a0.45±0.15a咀嚼性/mJ19.60±0.87a10.48±0.18b弹力0.82±0.05a0.86±0.02a内聚性0.70±0.12a0.80±0.07a


图3 剪切速率对冻融法明胶和传统酸法明胶黏度的影响
Fig.3 Effect of shear rate on the viscosity of freezing-thawinggelatin and traditional acid gelatin

2.5.2 起泡特性

起泡性是衡量明胶起泡性能的指标,其值越高起泡性能越好;泡沫失水率反映泡沫稳定性,失水率越小泡沫稳定性越高。对冻融法明胶和传统酸法明胶溶液的起泡性和泡沫稳定性进行评价,结果如图4所示,在明胶溶液质量浓度从10 g/L增加到30 g/L,冻融法明胶的起泡性和泡沫稳定性均高于传统酸法明胶,说明冻融法明胶在该浓度范围内具有良好的起泡特性。

A-起泡性;B-失水率
图4 冻融法明胶和传统酸法明胶起泡性和失水率结果
Fig.4 Results of foaming capacity and water loss offreezing-thawing gelatin and traditional acid gelatin注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

这可能是因为冻融法明胶中高分子组分更多,溶液状态下明胶分子间更易相互缠结,更易形成氢键[20],有利于界面的稳定。但当明胶溶液浓度进一步增大,2种明胶的起泡性和起泡稳定性均下降,这可能是因为明胶浓度过大,明胶中亚基组分由于相互作用等导致疏水基团被掩盖,溶液表面张力增加,难以形成界面,故起泡性能下降。由此可见,冻融法明胶具有良好的发泡性能,可用于啤酒、棉花糖和化妆品等的制作中。

3 结论

(1)冻融法明胶和传统酸法明胶的基本组分均符合国标要求,冻融法明胶较传统酸法明胶含有更多的高分子亚基组分和更低的小分子组分以及更多的亚氨基含量,可赋予冻融法明胶更好的凝胶特性。

(2)相对于传统酸法明胶,冻融法明胶具有更高的凝胶强度,更好的起泡性和泡沫稳定性,且在高剪切速率下具有更高的黏度,这主要是因为冻融法明胶中高分子组分含量更多,更容易相互缠结,从而使冻融法明胶加工适应性更强。此外,冻融法明胶凝胶颜色略深,但这并不影响其在实际加工体系中的应用。

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Physicochemical properties analysis of pig skin gelatin prepared by rapid freezing-thawing pretreatment

LIU Tingwei, CHEN Xueke, MA Liang, DAI Hongjie, YU Yong, ZHOU Hongyuan,GUO Ting, ZHANG Yuhao*

(College of Food Science Southwest University, Chongqing 400715, China)

ABSTRACT To describe the characteristics of pig skin gelatin prepared by rapid freezing-thawing method, basic physicochemical properties, chromatic aberration, SDS-PAGE, amino acid composition, texture profile analysis, fluid characteristics, foaming capacity and foam stability were analyzed. Gelatin prepared by rapid freezing-thawing method had similar basic physicochemical properties with traditional acid gelatin, yet had good texture characteristics. The hardness (368.0 g) was significantly higher than that of traditional acid gelatin (341.0 g) (P<0.05), while color was slightly deeper. Fluid characteristics results showed that freezing-thawing gelatin had higher viscosity. In addition, the foaming capacity and stability of freezing-thawing gelatin were both better than that of traditional acid gelatin in the range of 10 g/L to 30 g/L. SDS-PAGE and amino acid composition results indicated the reason for better functional properties was that freezing-thawing gelatin had more high molecular weight subunits, less low molecular weight components and more imino acid content (252 g/1 000 g) than traditional acid gelatin. Pig skin gelatin prepared by rapid freezing-thawing method has good physicochemical properties and processing characteristics, which can provide new method for clean production of gelatin.

Key words freezing-thawing; gelatin; physicochemical property; processing characteristics

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.020689

第一作者:硕士研究生(张宇昊教授为通讯作者,E-mail:zhy120 3@163.com)。

基金项目:十三五”国家重点研发计划重点专项(2016YFD0400 200);国家自然科学基金面上项目(31671881);重庆市基础科学与前沿技术研究项目(cstc2018jcyjA0939);中央高校基本科研业务费重点项目(XDJK2019B028)

收稿日期:2019-03-28,改回日期:2019-06-26