含盐量对腌制大黄鱼鱼肉品质的影响

大黄鱼(Larimichthys crocea)，在经历20世纪80年代的毁灭性捕捞后，在水产科技工作者的努力下，于1985年首次人工培育了大黄鱼鱼苗成功，且随着育苗技术和养殖技术的不断成熟，养殖大黄鱼的产量逐年增加，2017年中国大黄鱼养殖总量已达到17.76万t，大黄鱼成为我国重要的经济鱼类[1]。养殖大黄鱼的鱼肉具有高蛋白高脂肪的特点，鱼肉滋味肥美。鱼肉富含多种多不饱和脂肪酸；同时，鱼肉中必需氨基酸含量符合WHO/FAO的推荐标准[2]。

鱼类的腌制、干制产品是最具有独特风味的传统水产加工食品，当前，大黄鱼的加工主要是以腌制和干制加工为主，其中最为出名的就是浙江传统名肴黄鱼鲞。腌制会使鱼肉蛋白质发生变性，鱼肉品质发生改变[3]。生鱼肉中的蛋白质大致分为肌原纤维蛋白、肌浆蛋白及基质蛋白，其中盐溶性的肌原纤维蛋白含量最高，如卵形鲳鲹鱼肉中可达到65%～75%[4]。肌原纤维蛋白在肉类加工中起着重要作用。肌原纤维蛋白在化学作用力的作用下能够形成三维网格结构，有助于凝胶的形成并且影响着凝胶的性能结构。干腌肉制品中的蛋白质主要是肌原纤维蛋白及肌浆蛋白，其中肌原纤维蛋白在肌肉收缩中起到重要的作用，其主链和二级结构在加工过程中发生了明显的变化[5]。另外，肌原纤维蛋白发生降解会产生风味物质，形成干腌制品的特殊风味[6]。

传统鱼类腌制、干制食品的技术创新和产业化是十三五期间的重点攻关内容。目前，对腌制处理的养殖大黄鱼的研究主要围绕腌制工艺、营养成分、品质及微生物菌群等方面展开[3,7-11]，而大黄鱼腌制品中食盐的最适含量是产业迫切需要解决的问题。

本文采用混合腌制法腌制大黄鱼，分析不同食盐含量对大黄鱼片中蛋白质特性指标、鱼肉pH值、质构指标和挥发性风味物质的影响，明确食盐含量对大黄鱼鱼肉的品质影响，以期结合现代加工装备和加工新技术，以及生物技术为研发现代大黄鱼腌制技术提供基础支撑，也为制定大黄鱼腌制标准的量化指标提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活养殖大黄鱼，捕获后加冰运回实验室，由福建宁德金盛水产有限公司提供。

海盐：广东省盐业公司生产，购自广州华润万家超市。

蛋白质定量测试盒及微量总巯基测试盒，南京建成生物工程研究所；CuSO4、K2SO4、三氯乙酸(trifluoroacetic acid, TCA)、KCl、NaOH、AgNO3、HCl，国产分析纯,广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

Brookfield QTS-25质构仪，英国CNS FARNELL公司；SH220F石墨消解仪，济南海能公司；KjeltecTM2300蛋白自动分析仪，丹麦FOSS公司；Sunrise-basic Tacan型酶标仪，瑞士TACAN公司；IS128实验室pH计，上海仪迈仪器科技有限公司。

1.3 实验方法

样品前处理：准备9条新鲜的养殖大黄鱼，去鱼鳞和内脏，用清水冲洗干净后，沿背脊将整条鱼剖开，每条鱼形成2片鱼片，共18片鱼片，冲洗干净后沥水，修整并称重。

腌制过程：将大黄鱼片用食盐进行腌制，先将食盐均匀涂抹在鱼片表面，置于容器中，加入饱和食盐水，按液料比(V腌制食盐水∶m鱼片)2.0 mL/g在0～4 ℃条件下腌制。并按照预实验中得到的鱼肉中含盐量达到不同水平时所需要的湿腌时间，分别在腌制时的0、1、4、16、72 h取样，最终得到含盐量分别为0%、6%、9%、12%、15%(质量分数)的鱼片各3片。

1.3.2 肌原纤维蛋白的提取

参考BENJAKUL等[12]的方法稍作修改，称取2.0 g大黄鱼鱼肉，并倒入20 mL预冷KCl溶液(0.6 mol/L、pH 7.0)，并在冰浴条件下均质分散(10 000 r/min)2 min，为防止机器过热，均质时应每运行20 s停止休息10 s。将均质液进行离心处理(4 ℃、12 000 r/min)10 min。取上清液，加入3倍体积的预冷超纯水，再次离心处理(4 ℃、12 000 r/min)10 min；取沉淀，加入相同体积的预冷KCl溶液(1.2 mol/L、pH 7.0)，在冰浴条件下放置30 min，最后离心处理(4 ℃、12 000 r/min)10 min。离心后的上清液为肌原纤维蛋白。

1.3.3 盐溶性蛋白含量的测定

参照蛋白质定量测试盒的操作方法进行。

1.3.4 巯基含量的测定

参照微量总巯基测试盒的操作方法进行。

1.3.5 蛋白质水解指数(proteolysis inder, PI)

蛋白质水解指数按照公式(1)计算:

总氮(total nitrogen, TN)测定[13]：按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》规定的自动凯式定氮仪法进行测定。

非蛋白氮(nonprotein nitrogen, NPN)测定[14]：称取5 g搅碎的鱼肉(数值精确到0.001 g)，加入预冷的100 g/L TCA 25 mL，使用均质机进行高速分散(10 000 r/min)1 min，4 ℃放置过夜。再次离心(4 ℃、5 000 r/min)5 min，取上清液，用中速滤纸过滤，得到的滤液用来测定非蛋白氮。方法与测总氮相同，取5 mL滤液进行消化。

1.3.6 pH值的测定

根据GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品pH测定》[15]。

1.3.7 质构特性[16]

使用Brookfield QTS-25质构仪以及P/5平底圆柱形探头进行测定，使用测试模式为质地多面剖析(TPA)模式，测试速度为0.5 mm/s，返回速度为0.5 mm/s，循环次数为2次，触发点负载为5.0 g。每组实验重复8次，去除异常值后取平均值。

1.3.8 挥发性风味物质的测定

按照吕卫金[17]的方法进行。先进行样品前处理，然后通过顶空固相微萃取的方式萃取挥发性风味成分。得到的化合物在计算机NIST谱库中检索定性，定量分析则采用峰面积归一化法进行。

1.4 数据处理

用Excel 2016软件处理数据，再用SPSS 22统计分析软件对各参数进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 不同食盐含量对养殖大黄鱼肌肉蛋白质的影响

2.1.1 对养殖大黄鱼肌肉中盐溶性蛋白含量的影响

鱼肉在盐离子的作用下，盐溶性蛋白更易溶出。从图1可以看出，随着鱼肉中食盐含量不断增加，盐溶性蛋白含量不断减少；盐溶性蛋白含量在鱼肉中食盐含量从0%增至6%时下降幅度最大，而后降幅较为缓慢，特别是在鱼肉中食盐含量从9%增至12%时下降趋势平缓。随着含盐量不断增加，蛋白质附近的水与盐离子结合，使水分子发生重排，在盐离子的作用下蛋白质之间作用力增强，导致α-螺旋结构失去稳定性而遭到破坏或转化[18]，肌肉纤维被打开，使更多的盐溶性肌原纤维蛋白暴露并进入盐溶液，因此由鱼肉中提取出的肌原纤维蛋白随着鱼肉含盐量的不断增加而越来越少，造成鱼肉营养流失。鱼肉食盐质量分数增加至6%时，绝大多数蛋白质已经发生变性，暴露的肌原纤维蛋白溶入盐溶液，因而测得的鱼肉中肌原纤维蛋白含量大幅度减少；随后鱼肉食盐含量继续增加，剩下的少数未变性的蛋白质也开始发生变性，但由于数量少，下降趋势不如之前明显。由此可见传统高盐腌制的腌制品在提高贮藏期的同时也降低了腌制品的营养价值，而轻盐腌制能减少营养流失。

2.1.2 对养殖大黄鱼肌肉中肌动球蛋白总巯基含量的变化

肌原纤维蛋白主要包括肌球蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白。肌球蛋白与肌动蛋白因ATP而结合成肌动球蛋白，分子中含有活性巯基(SH)。活性巯基是蛋白质结构与生物体内某些氧化还原反应的重要基团，主要存在于半胱氨酸[19]。2个巯基经过脱氢可形成二硫键，从而连接相邻的多肽，导致蛋白质变性，可测定总巯基含量的变化来指示变性程度。从图2可以看出，随着鱼肉中食盐含量不断增加，总巯基含量先略微上升，然后不断下降。其中曲线上升是盐质量分数0～6%阶段，随后总巯基含量开始下降，其中盐含量9%～12%阶段下降幅度最大，可能与新增的巯基数目变少，消耗太大有关。从预实验的结果来看，鱼肉中盐含量的多少与时间呈正相关。当鱼肉中盐含量达到6%时，由于鱼肉肌纤维被打开使得大量巯基暴露，增加了巯基的数量，且可能由于时间较短活跃的巯基分子被氧化的程度较低，因而鱼肉中总巯基的数目略微上升。随着鱼肉含盐量的继续增加，即腌制时间越来越长，巯基的氧化程度不断增大，总巯基数目整体开始下降。图1中鱼肉盐含量9%～12%阶段的曲线几乎持平，说明鱼肉中肌原纤维蛋白含量损失非常少，即新生成的肌原纤维蛋白较少，因而新增加的巯基也非常少，结合该阶段总巯基数量大幅下降的趋势来看，该阶段总巯基处于净消耗状态，说明该阶段鱼肉蛋白的变性速度减慢。

2.1.3 不同食盐含量对养殖大黄鱼肌肉中非蛋白氮、总氮及蛋白质水解指数的变化

蛋白质水解指数是非蛋白氮与总氮比值的百分数。非蛋白氮以核苷、核苷酸及游离氨基酸等为主要成分。蛋白质水解产生的肽类和游离氨基酸再进一步水解可形成风味物质的前体，可以用来表征蛋白质在腌制过程中的水解程度[20]。从图3-a中可以看出，随着鱼肉中食盐含量不断增加，TN含量呈现先上升后下降的趋势。从图3-b和3-c中可以看出，随着鱼肉中食盐含量不断增加，NPN及PI呈现先下降后上升的趋势。鱼肉中NPN及PI在食盐含量0%～6%阶段快速下降，说明该阶段蛋白质水解程度很高，与该阶段盐溶性蛋白的含量下降情况类似。而NPN向风味物质或前体转化，这说明该阶段也是小肽降解成游离氨基酸的过程。有研究表明，该过程中部分游离氨基酸也会转化为挥发性风味物质[21]，该结果与赵志霞[22]的结果一致。随后，在鱼肉食盐含量从6%增至12%期间NPN及PI值缓慢上升，其中鱼肉盐含量9%至盐含量12%的阶段曲线几乎持平，与前面的情况相似；在鱼肉食盐含量从12%增至15%时，大幅度上升，可能是因为腌制时间长，鱼肉食盐含量高，蛋白质变性降解更彻底，生成的核苷、核苷酸及游离氨基酸等NPN大量增多；另一方面，图3-a中显示鱼肉中TN值在食盐含量12%～15%阶段快速下降，因而PI值增大。由此可见，在鱼肉含盐量达到6%的腌制过程中，蛋白质水解最为活跃。

2.2 不同食盐含量对大黄鱼肉质构特性及pH值的影响

2.2.1 不同食盐含量对大黄鱼肉质构特性的影响

腌制过程中鱼肉蛋白质的构象变化会影响鱼肉的质构，蛋白质、多肽与风味物质的作用，导致食品的感官发生变化[23]。通过模拟牙齿咀嚼食物的机械过程而获得的质构参数是用来衡量鱼肉食用品质的重要指标。从图4-a中可以看出，随着鱼肉中食盐含量不断增加，鱼肉的硬度首先略微下降，然后开始缓慢上升，当盐含量超过12%后硬度值开始大幅度上升；从图4-b中可以看出，随着鱼肉中食盐含量不断增加，鱼肉的弹性呈现缓慢上升最后趋于平稳的趋势。从图4-c中可以看出，随着鱼肉中食盐含量不断增加，鱼肉的咀嚼性呈现首先大幅度下降然后开始上升的趋势。可见，腌制加工改变了鱼肉的硬度、弹性及咀嚼性等质构特性。腌制过程中由于渗透作用，盐分置换水分，因此盐浓度越大，渗透压越大，鱼肉水分损失更快从而盐分逐渐累积，硬度不断增大。图4表明，当鱼肉盐含量到达6%的过程中，鱼肉的硬度稍有降低，咀嚼性出现大幅度下降，而弹性略微上升，说明鱼肉盐含量较低的情况下，即轻度腌制能够轻微降低鱼肉的硬度并较大程度地降低咀嚼性，轻微地增加弹性，表明鱼肉质地变软且弹性有所增加。而当鱼肉盐含量超过12%后，鱼片的硬度及咀嚼性开始大幅度增长，弹性却趋于平缓，说明鱼肉盐含量较高的情况下，即重度腌制会显著增加(P<0.05)鱼肉的硬度和咀嚼性，但对弹性无显著性影响(P>0.05)，也会影响食品的嫩度及多汁性[24]。

2.2.2 不同食盐含量对养殖大黄鱼肌肉pH值的影响

鱼肉pH值受种类、生长环境、宰杀方式等诸多因素的调控，它对鱼肉失水力、凝胶性、肉色、货架期长短都有显著影响[25]。鱼肉pH较高时，蛋白质所带负电荷多，能吸附大量水，此时肌肉有较强的系水力。从图5可以看出，随着鱼肉中食盐含量不断增加，鱼肉的pH整体呈现下降趋势。这是因为鱼类死后首先呈僵直状态，肌肉中的糖原因无氧分解产生乳酸，导致鱼肉的pH下降，并使鱼肉蛋白质变性；随着鱼肉中食盐含量不断增加，蛋白质变性降解，产生的游离氨基酸、多肽使鱼肌肉的系水力下降。鱼类死亡较长时间后，蛋白质在内源酶或微生物的作用下腐败并生成含氮的碱性物质，导致pH上升，而腌制期间大黄鱼片所处温度较低(0～4 ℃)，导致蛋白质降解生成的碱性物质较少，因而pH上升较慢。总体来看，鱼片在腌制期间生成碱性物质的效率较低，说明腌制鱼片的腐败过程比较缓慢。

2.2.3 食盐含量与鱼肉品质指标的相关性分析

使用SPSS 22统计分析软件对鱼肉含盐量与鱼肉各品质指标进行相关性分析。结果表明，一方面，鱼肉含盐量与蛋白质类及pH等指标呈负相关。其中，鱼肉含盐量分别与盐溶性蛋白含量、蛋白质水解指数、pH呈现较显著的负相关(P<0.05)，而与总巯基含量呈负相关。说明腌制使鱼肉含盐量发生变化的同时也使盐溶性蛋白流失，蛋白质发生降解，pH也发生变化。另一方面，鱼肉含盐量与质构特性指标呈正相关。其中，鱼肉含盐量与弹性呈现显著相关性(P<0.05)，与硬度呈现一般相关性，而与咀嚼性的相关性不显著(P>0.05)。说明腌制时，鱼肉的含盐量影响着肉质弹性和硬度。因此，腌制过程，在考虑鱼肉含盐量的同时要综合鱼肉的蛋白质、pH、质构特性变化来合理确定腌制工艺，控制鱼肉的含盐量。综合以上的分析表明鱼肉含盐量控制在6%～9%，既能满足产品咸度要求，又能较好地保持产品的营养和质构特性。

注：*表示在0.05水平(双侧)上显著相关；**表示在0.01水平(双侧)上显著相关。

2.3 不同食盐含量对大黄鱼肉挥发性风味物质的影响

风味是滋味和气味的总称，前者是借由非挥发性化合物刺激人体味觉而产生的感觉，后者则是借由挥发性化合物刺激人体嗅觉而产生的感觉，挥发性的气体物质影响着鱼肉整体风味[26]。腌制使蛋白质发生降解产生游离氨基酸和多肽，而这些可成为挥发性物质的前体，并具有一定呈味作用，这些前体物质经过美拉德反应及Srecker降解等反应最终形成腌制品的特殊风味。研究表明，咸鱼中的主要挥发性风味物质是醇、酮、醛、及含氮物质等，而特征风味物质几乎都是醇类和醛类，与鱼腥味及青草-脂肪味有关[6]。腌制剂中食盐对风味成分的释放影响最大[27]，不同食盐含量的鱼肉中含有的挥发性风味物质种类及数量也有所不同。

2.3.1 不同食盐含量的大黄鱼肉中的挥发性风味成分

醛类的阈值大都较低，对风味影响作用最大，而酮类及醇类等物质的阈值较高，影响作用有限[28]。对5个实验组进行分析后发现，每组样品的鱼肉的挥发性风味以鱼腥味、青草-油脂味、蘑菇味、杏仁、坚果味、清甜面包香、水果味、花香味等6种风味为主，呈现这些风味的对应物质如表2所示。

统计这6种特征气味物质的相应含量，如表3所示。从表3中可以看出，单组样品中鱼腥味和青草-油脂味为主要成分，整体所占比例远远高过其他4种风味。鱼肉含盐质量分数为0%、12%、15%时的特征风味物质总含量整体相近，所占比例最高；而鱼肉含盐质量分数为6%、9%时的特征风味物质总含量整体相近，所占比例最低，说明腌制使鱼肉逐渐失去原有的风味，并随着腌制的不断进行，鱼肉的风味在不断恢复，同时还产生了少量的新风味。在腌制前期(含盐6%、9%)，整体风味成分含量首先大量减少，随后开始缓慢增加；而腌制中后期(含盐12%、15%)，整体风味成分含量大量增加，随后趋于平缓。说明腌制前期是特征风味物质形成的过程，而腌制中后期是累计的过程。腌制中后期中出现了清甜面包香味，而水果味和花香味仅在中期(盐的质量分数9%)出现。另外，附表1中显示5组样品都检测出了甲氧基-苯基-肟，在对照组(盐含量0%)中的相对含量为3.99%，其他4组中的含量不超过1%。翁丽萍[29]也检测出了这种物质，暂时没有找到相关资料解释该物质，也没有CAS编号。

2.3.2 不同食盐含量的鱼肉中挥发性风味成分种类及相对含量的比较

从表4可以看出，鱼肉经过腌制后，各类挥发性风味物质的种类及相对含量随着鱼肉盐含量的增加而发生变化。从种类来看，当鱼肉含盐量达9%时各类挥发性风味物质的种类以及总种类均达到最多。从相对含量来看，当鱼肉含盐量达6%时，烃类的相对含量最高(81.27%)，其他各类挥发性风味物质的相对含量以及总相对含量均基本达到最低。说明腌制使原本养殖大黄鱼鱼肉的挥发性风味成分逐渐向烃类转化，而烃类因阈值较高而对风味影响作用有限，因此当鱼肉含盐量达6%时鱼肉风味不足。

而当鱼肉含盐量达9%时，烃类总量为68.86%，比6%时减少了12.41%。另外，各类挥发性风味物质的总种数增加至65种，比6%时增加了22种。说明减少的这12.41%烃类物质向其他类物质进行了转化，增减情况为：醇类4种(3.65%)、醛类2种(3.36%)、酮类2种(1.31%)、烃类1种(-12.41%)、芳香类6种(2.28%)、酸类1种(0.16%)及酯类6种(1.25%)。结合前面得到的当鱼肉盐含量为6%时鱼肉蛋白质的分解程度最高及整体特征气味物质含量最低的结果，说明该阶段蛋白质的分解程度极高，但是生成的大多数都是挥发性风味物质的前体，因而当鱼肉含盐量继续增加至9%的过程中才开始生成有效的挥发性风味物质。

当鱼肉含盐量超过9%后，烃类的相对含量大幅下降，至含盐量为15%时仅剩9.46%，而醇类、醛类及酮类的相对含量逐渐增大，至含盐量为15%时分别达到28.67%、29.28%、16.69%，总计74.66%，占总数的绝大部分。说明鱼肉中食盐含量越高，即腌制时间长，产品的特殊风味越足。这也进一步应证了风味形成于咸鱼的成熟阶段，期间酶和微生物起着重要作用。一方面，鱼肉自身的蛋白酶及脂肪酶会将蛋白质和脂肪分解成小分子化合物；另一方面，某些微生物能够产生具有一定活力的蛋白酶和脂肪酶，例如乳酸菌、葡萄球菌、微球菌等，辅助分解[27]。醇类是糖类、氨基酸类、醛类等物质通过氧化还原反应得到的[31]，并且研究表明使用复合乳酸菌发酵有利于咸鱼中的醇类物质的形成[32]。酮类物质的阈值普遍较高，因不饱和脂肪酸的分解或受热氧化产生。醛类物质，诸如己醛、辛醛、壬醛及庚醛等均由不饱和脂肪酸分解而得[33]。醛类物质不仅阈值更低，对风味的影响作用更明显，而且产生的风味种类更全面。本研究中得到大多数醛类物质均有对应的气味类型，有青草味、亚麻油香、油脂香、杏仁香、坚果香和水果香、柑橘香、花香、蜡香、青苹果味和鱼腥味等。所以从鱼肉风味来说，大黄鱼肉中食盐含量在9%时具有较好的咸鱼风味。

3 结论

通过分析腌制大黄鱼鱼肉中含盐量对鱼肉品质的影响，表明鱼肉食盐含量对鱼肉的蛋白、质构、pH和挥发性成分有显著的影响。盐溶性蛋白含量及总巯基含量在鱼肉中食盐含量≤9%时较稳定，而后随着含盐量的进一步增加而下降。随着含盐量的增加，鱼肉中pH不断下降，TN含量呈现先上升后下降的趋势，NPN和PI呈现先下降后上升的趋势，鱼肉含盐量越高盐溶性蛋白流失越严重。鱼肉含盐量6%能够轻微降低鱼肉的硬度并较大程度地降低咀嚼性，鱼肉质地变软且弹性有所增加；而鱼肉含盐量超过12%时鱼肉的硬度和咀嚼性显著增加(P<0.05)但对弹性无显著性影响(P>0.05)。盐含量达到6%时鱼肉的挥发性醛类、酮类物质的含量均少于对照组的，并从整体来看，该阶段挥发性物质主要向烃类转化；随着鱼肉含盐量的不断增加，鱼肉中的挥发性醛类、酮类物质的总含量不断增加，并且在鱼肉盐含量超过9%后逐渐成为挥发性风味物质的主体成分。鱼肉总挥发性风味物质种类最多处是含盐量达到9%的时候，高达65种。所以腌制大黄鱼鱼肉含盐量控制在9%时能较好地保持产品的营养、质构特性和咸度，也能更好地提升产品的腌制风味。该研究为养殖大黄鱼的腌制加工和鱼肉含盐量控制提供技术依据。

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