蜂蜜含有葡萄糖、果糖、蛋白质、维生素、有机酸、酚酸、黄酮、酶、矿质元素、芳香物质等多种成分,具有抑菌、抗氧化、抗炎、护肝、润肠、提高免疫力以及抗癌等功效[1-3],不仅是一种价值极高的药食两用天然食品,还被作为添加剂广泛应用于各类食品加工中,深受消费者青睐[3-4]。
5-羟甲基糠醛(5-hydroxymthylfurfural, 5-HMF)是蜂蜜中容易产生的一种黑色、难闻物质,其在新鲜蜂蜜中几乎不存在,但经热加工或贮存条件差(温度升高、贮藏时间过长等)时,蜂蜜中氨基化合物和羰基化合物在酸性条件下容易发生美拉德反应,5-HMF大量生成[5-6]。5-HMF对皮肤、眼睛及黏膜具有刺激性,摄入过多会对人体组织器官造成伤害,如损伤横纹肌麻痹和内脏,甚至引发癌症[6-7]。因此,在国际贸易中,5-HMF作为蜂蜜检测指标,含量应≤40 mg/kg[6]。然而,目前我国蜂产品市场上,蜂蜜中5-HMF含量超标现象严重。2016年北京东城区食药监控中心抽检115批次市售蜂蜜,发现42批次超出5-HMF标准值,部分产品中5-HMF含量高达100 mg/kg以上[8]。对于5-HMF含量超标的蜂蜜,国外通常是将其进行销毁处理,但实际上这种蜂蜜中仍含有很多营养成分和活性物质,直接销毁是巨大的资源浪费。如能采取合适的技术手段先脱除或降低蜂蜜中超标5-HMF,然后再将其作为甜味剂、饲料成分或生物质能源等应用于食品加工或其他领域,对实现不合格蜂蜜的资源再利用具有重要意义。
连会[9]和宋秀超[10]采用活性炭吸附法研究蜂蜜中5-HMF的脱除技术,但活性炭吸附选择性较差、机械强度低、使用寿命短、运行费用较高。相比之下,大孔树脂吸附法具有选择性好、吸附容量大、吸附迅速及可再生等优点[11],在天然产物脱色、食品农残和毒素脱除等方面已显示出巨大优势[12-15]。然而,目前缺乏利用大孔树脂吸附技术脱除蜂蜜中超标5-HMF的研究。本文采用静态吸附法,比较不同类型大孔吸附树脂对蜂蜜中5-HMF的脱除效果,分析吸附工艺条件对5-HMF脱除的影响,以期为实现5-HMF超标蜂蜜的资源再利用提供理论依据。
洋槐蜜,陕西永寿(2017年);龙眼蜜、荔枝蜜,广西(2011年);枸杞蜜、荞麦蜜,宁夏(2013年);荆条蜜,陕西周至(2012年);油菜蜜,青海青藏生物资源开发有限公司。所有蜂蜜样本运至实验室后4 ℃贮存待用。LSA-960、XDA-300、LSI-3、LX-260和LX-670型大孔树脂,西安蓝晓科技公司,5种大孔树脂参数见表1。
表1 5种大孔吸附树脂参数
Table 1 Physical parameters of five kinds of macroporous resins
树脂型号比表面积/(m2·g-1)孔径/Å粒径/nm极性含水量/%骨架LSA-960≥1 00026~320.315~1.25弱55~65苯乙烯二乙烯基苯XDA-300≥1 00030~360.315~1.25弱52~62苯乙烯二乙烯基苯LSI-3≥70030~350.4~1.25弱50~60苯乙烯系LX-260≥70030~500.4~1.25强50~60苯乙烯二乙烯基苯LX-670≥40040~600.4~1.25强56~65丙烯酸
5-HMF标准品(纯度为99%),美国Sigma-Aldrich公司;色谱甲醇,美国Tedia公司。NaOH、KI,天津北联精细化学品开发有限公司;I2,天津科密欧化学试剂有限公司;无水乙酸钠、可溶性淀粉,天津市河东区红岩试剂厂;CuSO4,天津瑞金特化学品有限公司;酒石酸钾钠、NaCl,天津天力化学试剂有限公司;蔗糖,天津东丽区天大化学试剂厂;浓HCl、冰乙酸、甲醇、乙醇,天津富宇精细化工有限公司;以上试剂均为分析纯。
SHA-B恒温振荡器,北京宏昌信科技有限公司;722G可见分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;BSA224S电子分析天平(精度0.1 mg),北京赛多利斯科学仪器有限公司;Five Easy Plus pH酸度计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DDS-11A数显电导率仪,上海佑科仪器有限公司;Ultimate-3000高效液相色谱仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;HP1049A电化学检测器、G1315A二极管阵列检测器,美国安捷伦科技公司。
1.4.1 大孔树脂活化处理
大孔树脂用无水乙醇浸泡24 h后,用去离子水反复淋洗至无醇味,之后依次用5倍体积HCl(pH 2)、NaOH(pH 12)溶液淋洗,2次淋洗前后均用去离子水淋洗至中性。
1.4.2 不同种类大孔树脂对蜂蜜中5-HMF脱除效果比较
1 kg洋槐蜜加一定量5-HMF标准品(70 mg),制成模拟加工贮藏后5-HMF含量超标的蜂蜜。蜂蜜样品与蒸馏水按质量比1∶1均匀,常温超声振荡10 min。称取20 mL蜂蜜水溶液,分别加入0.3 g LSI-3、LSA-960、XDA-300、LX-260和LX-670型大孔树脂,然后在25 ℃恒温条件下水浴摇床振荡150 min。吸附结束后按公式(1)计算5-HMF脱除率。
大孔树脂对蜂蜜中5-HMF脱除率计算如公式(1):
(1)
式中:A表示蜂蜜样品5-HMF脱除率;C0、C1分别表示大孔树脂处理前后蜂蜜样品中5-HMF含量,mg/kg。
1.4.3 大孔树脂吸附工艺对蜂蜜中5-HMF脱除的影响
1.4.3.1 吸附温度对蜂蜜中5-HMF脱除的影响
称取3份20 mL蜂蜜水溶液,每份加入0.3 g LSI-3型大孔树脂,分别在25、35和45 ℃条件下,水浴摇床恒温振荡150 min。吸附结束后公式(1)计算5-HMF脱除率。
1.4.3.2 树脂用量对蜂蜜中5-HMF脱除的影响
称取8份20 mL蜂蜜水溶液,分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g LSI-3型大孔树脂,在25 ℃恒温水浴摇床振荡150 min。吸附结束后按公式(1)计算5-HMF脱除率。
1.4.3.3 吸附时间对蜂蜜中5-HMF脱除的影响
称取7份20 mL蜂蜜水溶液,每份加入0.3 g LSI-3型大孔树脂,25 ℃恒温水浴摇床振荡,分别在20、40、60、80、100、120、150 min取样。吸附结束后按公式(1)计算5-HMF脱除率。
1.4.4 蜂蜜电导率、pH测定
将20 g蜂蜜样品用重蒸蒸馏水溶解并定容到150 mL,测定电导率和pH。
1.4.5 蜂蜜淀粉酶值和还原糖含量测定
分别参照GB/T 18932.16—2003[16]和GB 5009.7—2016[17]中方法测定。
1.4.6 蜂蜜总酚含量测定
参照HINNEBURG等[18]方法测定。
1.4.7 蜂蜜中酚类化合物高效液相色谱分析
参照贺琼等[19]方法提取蜂蜜中酚类化合物,然后采用高效液相色谱进行分析。具体色谱条件:ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相,甲醇(A)和0.1%(v/v)甲酸水溶液(B);流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;进样量10 μL;检测电压900 mV;洗脱梯度:0~10 min,5% B;10~20 min,15% B;20~25 min,30% B;25~30 min,35% B;30~50 min,50% B;50~55 min,55% B;55~60 min,75% B。
1.4.8 大孔树脂吸附对脱除不同种类蜂蜜中5-HMF的适用性
选取龙眼蜜、枸杞蜜、荞麦蜜、荆条蜜、荔枝蜜、油菜蜜和2种百花蜜,按照1.4.3 LSI-3型大孔树脂吸附的优化工艺条件,分析其对脱除不同种类蜂蜜中5-HMF的适用性。
1.4.9 蜂蜜中5-HMF含量分析
参照GB/T 18932.18—2003分析方法[20]。1 g试样与1 mL色谱甲醇混匀,蒸馏水定容至10 mL,经0.45 μm滤膜过滤,采用高效液相色谱进行检测。色谱条件:色谱柱ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相A甲醇有机相,流动相B水相,10% A等梯度洗脱15 min;流速1 mL/min;柱温30 ℃;进样量10 μL;检测波长285 nm。
1.4.10 数据处理与分析
实验重复3次,数据以平均值±标准偏差表示,使用Microsoft Office Excel软件进行数据处理并绘制图表;显著性分析采用SPSS 19.0软件进行,P<0.05表示存在差异显著。
由图1可知,5种大孔树脂对蜂蜜中5-HMF脱除能力存在明显差异,其中LSA-960、LSI-3和XDA-300型树脂对脱除5-HMF具有较好效果,脱除率为45.35%~52.63%;LX-260型树脂脱除效果较差,脱除率仅6.35%,LX-670型树脂对5-HMF几乎没有脱除能力。大孔树脂主要通过物理吸附作用,依靠吸附剂和吸附质之间范德华力来脱除溶液中的目标物质,其对目标物的吸附性能与树脂极性、比表面积与孔径均有关[21-22]。在选取的5种树脂中,LSA-960、LSI-3和XDA-300属于弱极性树脂,LX-260和LX-670属于强极性树脂,由此可见,大孔树脂极性对5-HMF吸附作用影响较大,弱极性树脂适合脱除蜂蜜中的5-HMF。刘清清等[12]在蜂蜜中农残脱除实验中,则发现极性树脂更适合脱除拟除虫菊酯。另外,对于3种弱极性树脂,LSI-3型树脂对蜂蜜中5-HMF脱除效果最佳,脱除率达52.63%。而雷海燕研究蜂蜜中硝基咪唑类和喹诺酮类药物大孔树脂脱除技术时,发现LSI-3型树脂对甲硝唑等农残脱除效果远不如另2种弱极性树脂LSI-1和LSI-2[23]。这预示着,对于不同吸附质分子,其适合的大孔吸附树脂类型差异较大。以脱除蜂蜜中5-HMF效果最佳的LSI-3型树脂为对象,进一步分析吸附工艺条件对5-HMF脱除的影响。
图1 不同类型大孔树脂对蜂蜜中5-HMF脱除能力比较
Fig.1 Effects of macroporous resin types on 5-HMF removal from honey
注:不同字母代表显著差异P<0.05。下同。
2.2.1 吸附温度对蜂蜜中5-HMF脱除的影响
温度会影响溶质分子运动活性,从而可能改变大孔树脂对溶质的吸附效果。选取25、35和45 ℃ 3个温度,研究吸附温度对脱除蜂蜜中5-HMF的影响,结果如图2所示。
图2 吸附温度对脱除蜂蜜中5-HMF的影响
Fig.2 Effects of adsorption temperature on 5-HMF removal from honey
结果表明,在不同吸附温度下,LSI-3型树脂对蜂蜜中5-HMF脱除效果有显著差异(P<0.05),25 ℃下大孔树脂的脱除效果最佳,随温度升高,5-HMF脱除率逐渐降低。孟范平等[24]用聚苯乙烯型大孔吸附树脂脱除海水中有机磷农药,同样发现温度越高农药脱除效果愈差。溶质分子运动活性随温度升高而增强,但可能由于LSI-3型树脂对5-HMF的吸附作用为放热反应,从而导致低温有利于蜂蜜中5-HMF脱除[14,24]。
2.2.2 树脂用量对蜂蜜中5-HMF脱除的影响
如图3所示,随着树脂用量增加,脱除效果逐渐增大,当树脂蜂蜜质量比达到44 g/kg后,树脂用量对5-HMF脱除率改变程度影响较小,大孔树脂对5-HMF吸附逐渐趋于平衡。考虑到经济因素,选取树脂蜂蜜质量比44 g/kg作为LSI-3型大孔树脂脱除蜂蜜中5-HMF的最佳用量。
图3 树脂用量对脱除蜂蜜中5-HMF的影响
Fig.3 Effects of macroporous resin amount on 5-HMF removal from honey
2.2.3 吸附时间对蜂蜜中5-HMF脱除的影响
图4显示的是蜂蜜中5-HMF脱除率随吸附时间的变化规律:0~80 min内,蜂蜜中5-HMF脱除率先快速增加后逐渐趋缓,80 min以后,大孔树脂对5-HMF吸附达到平衡,5-HMF脱除率没有显著变化。因此选取80 min作为LSI-3型大孔树脂脱除蜂蜜中5-HMF的最佳吸附时间。吸附初期,树脂所有表面层均存在吸附力场,吸附能力最强,蜂蜜中5-HMF含量快速减少;随吸附时间延长,树脂表面活性面积逐渐减小,5-HMF分子与树脂活性部位接触机会越来越少,因此,蜂蜜中5-HMF脱除速率在20~80 min减慢,直到达到平衡阶段(80~150 min)[11,13,21]。
图4 吸附时间对脱除蜂蜜中5-HMF的影响
Fig.4 Effects of adsorption time on 5-HMF removal from honey
综合吸附温度、树脂用量以及吸附时间对蜂蜜中5-HMF脱除的影响,确立LSI-3型大孔树脂脱除蜂蜜中5-HMF的优化工艺条件:吸附温度25 ℃,树脂用量44 g/kg蜂蜜,吸附时间80 min。在优化脱除工艺条件下,LSI-3型树脂对蜂蜜中5-HMF脱除率达62.49%。
蜂蜜组成非常复杂,目前已从蜂蜜中发现150多种成分,其中总糖75%~80%、水分18%~22%、蛋白质0.02%~0.5%,此外,还含有维生素、有机酸、酚酸、黄酮、多种酶类、矿质元素、色素、芳香物质等多种物质[1-2]。为研究大孔吸附树脂在脱除蜂蜜中有害物质5-HMF同时,是否会带来其他成分的改变,选取电导率、淀粉酶值、pH、还原糖含量以及总酚含量5个指标进行评价。结果如表2所示,LSI-3型树脂对蜂蜜的电导率、pH和还原糖总量没有显著影响(P≥0.05),淀粉酶值略有降低,总酚含量下降明显。这说明,树脂处理后蜂蜜仍保留糖类及大部分营养功能成分,是甜味剂、饲料成分或生物质能源等的良好物质来源,可实现对不合格蜂蜜的资源再利用。
表2 LSI-3型大孔树脂吸附对蜂蜜理化指标的影响
Table 2 Effects of LSI-3 macroporous resin adsorption on honey routine physical and chemical indexes
蜂蜜样品电导率/ (μs·cm-1)淀粉酶值pH值还原糖/%总酚含量/(mg·kg-1)树脂脱除前158.8±0.19a41.55±0.05a3.82±0.02a75.84±0.03a83.54±1.81a树脂脱除后159.8±0.48a40.11±0.03b3.86±0.03a75.53±0.04ab72.67±1.32b
注:同一列具有不同上标字母数据之间表示显著差异(P<0.05)。
酚类化合物是蜂蜜中重要的生物活性物质,包括酚酸、黄酮及其衍生物等多种成分,具有较强的抗氧化能力,对心脑血管疾病、癌症、炎症、动脉粥样硬化及衰老等有辅助疗效[25-26]。图5显示的是树脂处理前后蜂蜜中酚类化合物种类和含量在高效液相色谱图谱上的变化,树脂处理前后蜂蜜酚类组分的色谱图相似,色谱峰出峰时间均集中在14~34 min,大部分色谱峰也无明显变化,但部分色谱峰值出现明显降低(如15~20 min),该现象与总酚含量的下降相呼应(表2)。由此可知,LSI-3型大孔树脂在进行蜂蜜中5-HMF脱除处理时,可保留大部分酚类化合物,但也会造成部分酚类成分一定程度的减少。在我们构建的树脂与非树脂处理蜂蜜中酚类成分指纹图谱研究中也发现,树脂处理会导致蜂蜜中某些酚类特征成分发生显著差异,利用化学计量学可将两者有效区分(待发表数据)。树脂处理前后蜂蜜中酚类成分的明显差异可为避免一些不法商家将再处理蜂蜜假作正常蜂蜜售卖提供理论依据。
图5 LSI-3型大孔树脂吸附对蜂蜜中酚类化合物的影响
Fig.5 Effects of LSI-3 macroporous resin adsorption on phenolic compounds in honey
为研究LSI-3型大孔树脂对脱除不同种类蜂蜜中5-HMF适用性,随机选取实验室贮藏的8种蜂蜜进行验证,结果如表3所示。
表3 LSI-3型大孔树脂对不同种类蜂蜜中5-HMF脱除效果
Table 3 Removal of 5-HMF from different kinds of honey by LSI-3 macroporous resin
蜂蜜种类树脂处理前5-HMF含量/(mg·kg-1)树脂处理后5-HMF含量/(mg·kg-1)5-HMF脱除率/%枸杞蜜8.73±0.074.86±0.0144.31±0.02荔枝蜜45.29±0.1124.61±0.0245.66±0.05油菜蜜11.35±0.124.49±0.6860.45±0.54百花蜜172.75±0.8828.79±0.3260.43±0.75百花蜜227.55±1.3517.90±0.9835.03±1.14龙眼蜜6.22±0.09-几乎完全脱除荞麦蜜4.98±0.02-几乎完全脱除荆条蜜4.73±0.01-几乎完全脱除
注:“-”代表未检测到。
LSI-3型大孔树脂对8种蜂蜜中5-HMF均具有良好的脱除效果:对于5-HMF含量较高的荔枝蜜和百花蜜1,经LSI-3型树脂处理后5-HMF脱除率分别为45.66%和60.43%;5-HMF含量稍高的枸杞蜜、油菜蜜和百花蜜2,树脂处理后5-HMF脱除率则分别为44.31%、60.45%和35.03%;而5-HMF含量较低的龙眼蜜、荞麦蜜和荆条蜜,树脂处理后5-HMF含量太低未检测到。这说明,LSI-3型大孔树脂适用于脱除不同蜂蜜品种中5-HMF,但脱除效果在蜂蜜种类间存在一定区别,可能是由于不同种类蜂蜜的化学组成或5-HMF初始含量存在差异,从而影响了大孔树脂与5-HMF分子间的相互作用。
大孔树脂极性对5-HMF吸附作用影响较大,弱极性树脂更适合脱除蜂蜜中5-HMF,其中LSI-3型树脂脱除效果最佳;降低温度、增加树脂用量以及延长吸附时间有利于提高LSI-3型树脂对蜂蜜5-HMF脱除效果,在吸附温度25 ℃,树脂用量44 g/kg蜂蜜,吸附时间80 min的优化工艺条件下,5-HMF脱除率达62.49%;LSI-3型大孔树脂吸附对蜂蜜电导率、pH和还原糖总量没有显著影响,淀粉酶值略有降低,酚类化合物成分则明显减少,因此,大孔树脂在有效去除蜂蜜中超标5-HMF同时,仍保留蜂蜜中糖类及大部分营养功能成分,是甜味剂、饲料成分或生物质能源等的良好来源。此外,LSI-3型大孔树脂对不同种类蜂蜜中5-HMF脱除具有良好适用性。采用大孔树脂吸附技术可实现对不合格蜂蜜的资源再利用,并且树脂处理前后蜂蜜中酚类成分存在差异,也可避免一些不法商家将此种再处理蜂蜜假作正常蜂蜜售卖。
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