沙棘是一种独特的药食同源植物，具有广泛的药理功效。沙棘果实富含维生素A,C,B1,B2,E等、微量元素K、Na、Mn、Fe等，氨基酸和有机酸苹果酸、琥珀酸，柠檬酸等以及沙棘黄酮类化合物和其他生物活性成分[1-6]。现代医学研究证实，沙棘具有抗疲劳、抗肿瘤、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、预防心脑血管疾病和抑制血小板聚集等作用，并且对胃溃疡、肠损伤也有良好的治疗作用[7-12]，是一种不可多得的保键食品和药品原料。
汽酒，也被称为起泡酒或是发泡酒，是一种既富含气体(CO2)又有一定酒精度的饮料[13]。由于汽酒中含有较多CO2气体，因此在炎炎夏日饮用能带出人们体内的热量，让人感受到清凉舒爽[14]。汽酒中的酒精度一般含量较低，大约在0.5%～5%，带有果汁原有的香甜，适合各年龄层的消费者购买饮用[15]。本试验以沙棘果汁和蔗糖为主要原料，添加大米糖化液增加口感，利用微生物发酵产生CO2制备沙棘汽酒，该产品不含防腐剂和其他食品添加剂，绿色安全健康，符合现代人的消费观念。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘果，四川省阿坝州小金县；大米、蔗糖，超市；酵母，安琪酵母有限公司；糖化酶，泉州市中信实业有限公司；α-淀粉酶，郑州万瑞达化工产品有限公司；葡萄糖、NaOH、Na2SO3、硅藻土，成都科龙化工试剂公司。
1.2 仪器与设备
RJ-TDL-50A冷冻离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；7890A安捷伦气相色谱-质谱仪，安捷伦科技公司；HWS-260A恒温恒湿培养箱，杭州绿博仪器有限公司；DSX-18L手提式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。
1.3 试验方法
1.3.1 大米糖化溶液的制备
1.3.1.1 粉碎
将东北大米粉碎过40目筛。
1.3.1.2 糊化
取粉碎后的大米50 g，按料水比1∶4(g∶mL)加入蒸馏水200 mL，混匀后用盐酸将醪液的pH调节至5.5～6.0，加热，不断搅拌，直至醪液变成黏稠糊状。
1.3.1.3 液化
加热过程中，添加耐高温的α-淀粉酶(10 U/g)，沸腾30 min后于90 ℃继续保温30 min，保温过程中可适当补充温水。
1.3.1.4 糖化
用盐酸将上述醪液pH调节至4.0～4.5，冷却到手温后按150 U/g大米粉的比例加入活化好的糖化酶酶液，加热至80 ℃，20 min灭酶处理，冷却过滤，冷藏保存。
1.3.2 沙棘汽酒的工艺流程
(1)沙棘原汁处理工艺[19]
沙棘果实→破碎压榨→沙棘果汁→离心去脂(6 000 r/min，5 min)→加入果胶酶→二次离心去杂质(6 000 r/min，5 min)→降酸(CaCO3)→澄清过滤→沙棘汁
(2) 沙棘汽酒发酵工艺
沙棘澄清汁→料水比1∶2(g∶mL)→加大米糖化溶液→调糖→接种发酵→转桶→硅藻土过滤→调配(风味、酒精度、糖度)→灌装→巴氏灭菌→成品
1.4 沙棘汽酒单因素的试验
1.4.1 发酵时间的确定
沙棘果汁稀释后，初始糖度调至16.0%，酵母接种量30 g/L，大米糖化溶液20 mL/L，发酵温度22 ℃，发酵时间分别为68、72、76、80、84 h，发酵结束后以感官评价标准评分，选取口感最佳者，确定最适发酵时间，以此确定正交梯度水平。
1.4.2 酵母添加量的确定
沙棘果汁稀释后，初始糖度调至16.0%，酵母接种量为10、20、30、40、50 g/L，大米糖化溶液20 mL/L，发酵温度22 ℃，发酵76 h，发酵结束后以感官评价标准评分，选取口感最佳者，确定最适发酵时间，以此确定正交梯度水平。
1.4.3 大米糖化溶液添加量的确定
沙棘果汁稀释后，初始糖度调至16.0%，酵母接种量30 g/L，大米糖化溶液添加量为20、40、60、80、100 mL/L，发酵温度22 ℃，发酵76 h，发酵结束后以感官评价标准评分，选取口感最佳者，确定最适发酵时间，以此确定正交梯度水平。
1.4.4 发酵糖度的确定
沙棘果汁稀释后，初始糖度分别调至14.0%、16.0%、18.0%、20.0%、22.0%，酵母接种量30 g/L，大米糖化溶液80 mL/L，发酵温度22 ℃，发酵76 h，发酵结束后以感官评价标准评分，选取口感最佳者，确定最适发酵时间，以此确定正交梯度水平。
1.4.5 发酵温度的确定
沙棘果汁稀释后，初始糖度调至18.0%，酵母接种量30 g/L，大米糖化溶液80 mL/L，发酵温度为22、24、26、28、30 ℃，发酵76 h，发酵结束后以感官评价标准评分，选取口感最佳者，确定最适发酵时间，以此确定正交梯度水平。
1.4.6 正交试验优化沙棘汽酒的发酵条件
根据上述单因素试验，设定发酵时间(A)、酵母添加量(B)、大米糖化溶液添加量(C)、发酵糖度(D)、发酵温度(E)五因素四水平的正交试验，确定最佳工艺条件，因素水平见表1。
表1 正交因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal table
水平因素A/hB/(g·L-1)C/(mL·L-1)D/%E/℃174207017232762580182437830901925480351002026
1.5 沙棘汽酒评价指标及测定方法
1.5.1 沙棘汽酒的感官评分标准
沙棘汽酒的感官评价标准包括酒体色泽、果香酒香的协调性、泡沫刺激感、糖酸比等指标。根据该产品的各项感官指标进行百分制评分。
表2 沙棘汽酒的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluations standards of sea-buckthorn sparkling wine
项目(百分制)分数/分评分标准酒体颜色(25分)18～25酒体呈金黄色,澄清透明,无浑浊杂质10～18酒体呈暗黄或淡黄色,有微量浑浊0～10酒体暗沉,有较多浑浊物果香酒香协调性(30分)25～30沙棘果香浓郁,酒香与果香相辅相成,果与酒香味恰到好处15～25沙棘果香较淡,或是酒香较淡,香味较协调0～15沙棘果香几乎没有,或是酒香刺鼻,整体香味较粗糙泡沫刺激感(20分)15～20泡沫细腻浓郁,入口刺激感较强10～15泡沫细腻但较少,入口刺激感较弱0～10泡沫几乎没有,入口较平淡糖酸比(25分)18～25酸甜可口,滋味丰富,口感协调10～18较酸、较甜、较涩或较苦,整体一般0～10苦涩味较重,或是杂味较重
1.5.2 分析方法
酒精度测定：参见文献[16]；pH测定：采用pH计测定；还原糖测定：参见文献[17]；总糖测定：参见文献[17]；总酸测定：参见文献[18]；挥发性物质检测[19]：采用顶空固相微萃取法和气相色谱-质谱联用仪；透光率测定：看见文献[19]。
1.6 数据处理
采用Excel、Origin 8.5等软件对单因素结果进行分析、作图，单因素平行试验进行3组，正交试验采用平均值及标准差表示[20]。
2 结果与讨论
2.1 发酵工艺单因素试验结果与分析
2.1.1 最佳发酵时间的确定
由图1可知，随着发酵时间的增加，酒体中酒精度升高，酵母生长迅速，将原料中的糖转化为酒精，发酵时间与酒精度呈正比，与总糖含量呈反比。总酸随时间的增加而呈上升趋势，且发酵80 h后总酸上升速度较发酵前期迅速，综合各理化指标以及口感，发酵时间为76 h时，汽酒中酒精度、总糖、总酸相对适合，故选择最佳发酵时间为76 h。
图1 发酵时间对汽酒品质的影响
Fig.1 Effect of time on the fermentation quality of light sparkling wine
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
2.1.2 酵母接种量对汽酒品质的影响
酵母发酵是酿造沙棘汽酒的重要环节，酵母不仅能够产生乙醇，还能产生其他醇、醛、酯、酸等风味物质，直接影响沙棘汽酒中感官品质，酵母接种量不同，得到的汽酒中酒精度也就不同，口感自然也就不同。
图2 酵母接种量对汽酒品质的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculums on the quality of light sparkling wine
由图2可知，酵母的接种量越高，酒精度也就越高，与之相对的总糖含量呈下降趋势，而在接种量为30 g/L时，总糖消耗的速度较快，总酸的含量也上升较快。接种量较少时，酒精度也较低，此时总糖消耗较慢，这是因为酵母接种量过低导致生物活性不足，无法快速将可发酵性糖转化为酒精，酒体口感平淡。综合各理化指标以及口感，酵母接种量为30 g/L，汽酒中酒精度、总糖、总酸相对合适，故选择最佳酵母接种量为30 g/L。
2.1.3 大米糖化溶液添加量对汽酒品质的影响
大米中淀粉含量高，蛋白质、多酚、脂肪含量低，能够改善沙棘汽酒的口感，降低沙棘汽酒的色度。
由图3可知，大米糖化溶液的添加对酒体中总酸含量的影响不大，但当添加量超过60 mL/L时，酒精度明显升高，这是由于大米糖化溶液中也含有可供酵母发酵的糖分，使酵母可利用的糖增加，酒精度也随之增加。在大米糖化溶液添加量为80 mL/L时，酒体苦涩度降低，综合各理化指标以及口感，大米糖化溶液添加量为80 mL/L时，汽酒中酒精度、总糖、总酸相对合适。
图3 大米糖化溶液对汽酒品质的影响
Fig.3 Effect of rice saccharified liquid on the quality of light sparkling wine
2.1.4 初始糖度对汽酒品质的影响
沙棘原汁中有机酸含量较高，而含糖量仅3%，若直接使用原汁发酵，无论是口感还是酒精度都达不到标准。因此，果汁发酵前需加入白砂糖，调节发酵液至合适的糖度再进行酒精发酵。初始糖度的高低会直接影响沙棘汽酒的口感。
由图4可知，随着糖度的增加，酒精度变化不大，可能原因是发酵时间较短，酵母能够利用的糖度有限，转化成的酒精量也有限；总糖呈现先下降后期有略微上升的趋势，推测原因是沙棘本身酸度对发酵中的酒体总糖有影响，总酸先略微上升，后期下降，原因是糖度较低，沙棘本身偏酸，影响了酵母生长。综合各理化指标以及口感，初始糖度为18%时，汽酒中酒精度、总糖、总酸相对合适。
2.1.5 发酵温度对汽酒品质的影响
图4 初始糖度对汽酒品质的影响
Fig.4 Effect of initial sugar content on the quality of light sparkling wine
由图5可知，发酵温度对酒体中总酸含量的影响不大，酒精度随温度升高而升高，但当发酵温度高于24 ℃时，酒精度升高速率减缓，这是由于温度升高，使酵母代谢速率加快，得酵母过早衰亡，而酵母细胞死亡自溶后与其他物质作用分解会增加酒体内不良风味，因此感官评价也随之降低。总酸含量先下降再略微上升，总糖先下降后上升之后又下降，综合各理化指标以及口感，发酵温度为24 ℃，汽酒中酒精度、总糖、总酸相对合适。
图5 发酵温度对汽酒品质的影响
Fig.5 Effect of temperature on the quality of light sparkling wine
2.2 发酵工艺各参数的正交试验与分析
由表3可知，以感官评价为指标，按照极差的大小列出各因素对沙棘汽酒品质影响的主次进行排序，其顺序为：A>D>C>E>B，发酵时间是最主要的影响因素，其次是初始糖度，接着是大米糖化溶液添加量，然后是发酵温度，影响最低的是酵母接种量。通过K值确定最佳工艺参数是A4B1C4D2E3，即发酵时间80 h，酵母接种量20 g/L，大米糖化溶液添加量100 mL/L，初始糖度18%，发酵温度25 ℃。
表3 正交试验结果
Table 3 The results of orthogonal test
试验号A/hB/(g·L-1)C/(mL·L-1)D/%E/℃感官评价111111722122227531333388414444905212448262213382723412768243217093134280
续表3
试验号A/hB/(g·L-1)C/(mL·L-1)D/%E/℃感官评价103243184113312476123421375134142392144231485154324188164413282K1325326312308314K2310326320313313K3315328325336337K4347317342340333k181.2581.5787778.5k277.581.58078.2578.25k378.758281.258484.25k486.7579.2585.58583.25极差R9.252.757.586
注：ki为Ki的平均值。
2.3 验证试验
根据以上数据进行验证性试验，通过感官评价分析发现，按照上述条件发酵的果酒酒体呈鲜亮的金黄色，沙棘果香浓郁，酒香与果香相辅相成，泡沫细腻浓郁，酸甜可口，回味悠长，酒精度在(5±0.5)%vol。因此理论最佳工艺为最优工艺。
2.4 沙棘汽酒中香气成分分析
利用气相色谱-质谱联用仪，使用顶空固相微萃取法检测沙棘果汁和沙棘汽酒中的挥发性物质，结果见图6和图7。
图6 沙棘果汁中香气成分GC-MS图
Fig.6 The GC-MS of favor components of sea-buckthorn juice
图7 沙棘汽酒中香气成分GC-MS图
Fig.7 The GC-MS of favor components of sea-buckthorn light sparkling wine
由表4可知，通过顶空固相微萃取，沙棘果汁和沙棘汽酒中共检测出12种醇类物质，其中3种为两者共有，但含量差距较大，两者主要醇类物质为乙醇，未发酵的果汁中检测出酒精，其原因为沙棘果实表皮存在野生酵母，而由于储存时间长造成少量果汁发酵，产生了酒精。
酯类化合物能够使沙棘汽酒带有浓郁果香，沙棘果汁与沙棘汽酒中共检测出了10种酯类物质，其中仅2种为两者共有。沙棘果汁和沙棘汽酒中香气的主要成分分别为乙酸乙酯和辛酸乙酯。
表4 沙棘果汁与沙棘汽酒中香气成分组成对比
Table 4 The differences between sea-buckthorn juice and light sparkling wine
编号化合物名称沙棘果汁/%沙棘汽酒/%1二氧化碳-21.8822DL-丙氨酸-3.11231-甲氧基-2-丙胺-5.1474乙酸乙酯14.2423.1955乙醇17.81932.39962-甲基-1-丙醇-0.2877乙酸异戊酯0.2750.8338异戊醇1.6144.3649己酸乙酯-1.228101,3,5,7-环辛四烯-0.15311辛酸乙酯-11.7512乙酸0.7140.39813癸酸乙酯-7.4414辛酸3-甲基丁酯-0.22816乙酸苯乙酯-0.9617十二酸乙酯-0.48518苯甲醇2.3440.15619苯乙醇-1.55620十六烷基二甲基叔胺-0.46521辛酸-1.10522癸酸-0.439231,2-二甲基丙胺38.124-24DL-氨基丙醇11.638-25乙酸甲酯1.673-
续表4
编号化合物名称沙棘果汁/%沙棘汽酒/%26三氯甲烷0.284-271-己醇0.798-28芳樟醇氧化物反式1.409-291-庚醇1.611-306-甲基-5-庚烯-2-醇0.307-31氧化钙0.436-322-乙基己醇0.281-331-辛醇0.462-34环辛烷0.885-35松油醇0.252-36溴苯乙酸甲酯0.587-37苯基乙醇3.212-38正丁基硼酸0.451-
注：“-”表示检出。
3 结论
本试验通过对沙棘汽酒主发酵工艺的研究，利用单因素、正交试验和验证试验确定了沙棘汽酒最优发酵工艺条件：发酵时间为80 h，酵母接种量为20 g/L，大米糖化溶液添加量为100 mL/L，初始糖度为18%，发酵温度为25 ℃。在这种条件下，得到的沙棘汽酒酸甜可口，果酒酒体呈鲜亮的金黄色，沙棘果香浓郁，酒香与果香相辅相成，泡沫细腻浓郁，回味悠长，酒精度在(5±0.5)%vol，口感丰富。
由于沙棘果实中有机酸含量较高，现阶段研究主要集中利用在医疗、食品、保健品等方面，对沙棘酒精饮料的研究还存在不足，因此造成大量沙棘果汁的浪费。本研究将沙棘汽酒的酿造与农民当前利益相结合，为沙棘作物的综合研究提供了另一种可能。
[1] 郑瑞霞,杨峻山.中国沙棘果实化学成分的研究[J].中草药,2006,37(8):1 154-1 155.
[2] 刘勇,廉永善,王颖莉,等. 沙棘的研究开发评述及其重要意义[J].中国中药杂志,2014,39(9):1 547-1 552.
[3] MA Xueying, MOILANEN J, OSKAR LAAKSONEN, et al. Phenolic compounds and antioxidant activities of tea -type infusions processed from sea buckthorn (Hippopha⊇ rhamnoides) leaves[J]. Food Chemistry, 2019, 272(1):1-11.
[4] 何志勇,夏文水.沙棘果汁营养成分及保健作用[J].食品科技,2002(7):69-71;63.
[5] 葛孝炎,史国富,马翠英. 沙棘化学成分的研究概况[J]. 中草药,1986,17(8):42-44.
[6] 赵红军.沙棘果酒的研制[D].呼和浩特：内蒙古农业大学, 2010.
[7] 吴斯琴毕力格,包勒朝鲁,那生桑.沙棘药理作用研究进展[J].中国药业,2015,24(1):95-96.
[8] 于云,曲树明,何跃生.沙棘叶提取物的调血脂作用[J].中草药,2002,33(9):824-826.
[9] 刘天浩,陈运贤,钟雪云，等.沙棘对血液系统的作用[J].中药材,2001,24(8):610-612.
[10] JOHANSSON,KORTE A,YANG H,et al.Seabuckthorn berry oilinhibits platelet aggregation[J].Journal of Nutritional Biochemistry,2000,11(10):491-495.
[11] 臧茜茜,邓乾春,从仁怀,等.沙棘油功效成分及药理功能研究进展[J].中国油脂,2015,40(5):76-81.
[12] BEATA OLAS.Sea buckthorn as a source of important bioactive compounds in cardiovascular diseases[J]. Food and Chemical Toxicology,2016,97(11):199-204.
[13] 李超,司合芸,沈志毅,等.起泡酒发展概况及生产工艺分析[J].中外葡萄与葡萄酒,2015(4):54-57.
[14] 候廷帅.沙棘汽酒的研制[D]. 天津:天津科技大学,2015.
[15] 党翠红.低度海红果酒酿造工艺研究[D]. 西安：陕西科技大学，2015.
[16] 中国国家标准化管理委员会.GB/T 15038—2006.葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京:中国标准出版社, 2006.
[17] 张永华.食品分析[M].北京:中国轻工业出版社,2007:115-129.
[18] 中国国家标准化管理委员会.GB/T 13662—2008.黄酒国家标准[S].北京:中国标准出版社,2008.
[19] 邓梦婕,李丽,刘庆,等.沙棘红曲酒发酵工艺的优化[J].食品工业科技,2018,39(6):130-134.
[20] 李云雁,胡传荣.试验设计与数据处理(第2版)[M].北京:化学工业出版社,2008.