我国主要宽皮柑橘品种中类胡萝卜素物质的检测及差异性分析

柑橘是世界第一大水果，是第三大国际贸易农产品，仅次于小麦和玉米[1]。我国柑橘种植面积和总产量均居世界第一，其中宽皮柑橘约占年产量的60%。柑橘果实营养丰富，富含类黄酮[2-6]、酚酸[5-6]、类柠檬苦素[5]、香豆素[6]、类胡萝卜素[7]、生物碱[8]、肌醇[9]和挥发性物质[10]等多种生物活性成分。目前，国内外主要集中于类黄酮和酚酸等活性物质的鉴定分析[2-6]。

类胡萝卜素是一类C40类萜化合物及其衍生物，是胡萝卜素和叶黄素2大类色素的总称。类胡萝卜素既是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标，也是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素[11]。医学研究表明，许多类胡萝卜素在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等方面起着重要的作用，β-胡萝卜素还是维生素A的前体[12]。日本的农研机构已明确证实经常食用温州蜜柑(1 d摄入3～4 mg功效成分的β-隐黄质)，可以显著降低骨质疏松、动脉硬化、吸烟者代谢症候群和胰岛素抵抗性等风险。

植物源食品中类胡萝卜素的检测方法主要有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)[7,13-14]、超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography, UPLC)[15-17]和液相色谱-串联质谱法(liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer, LC-MS/MS)[18-20]。高效液相色谱法是最常用的方法，具有价廉、易操作和稳定性好等优点。胡建中等[13]利用HPLC对大叶尾张宽皮柑橘汁中18种类胡萝卜素做了定性研究；ATTILA等[14]对金柑、葡萄柚、柠檬等6个柑橘品种的果皮、果肉中类胡萝卜素组成进行了比较，但涵盖的品种较少；陶俊等[7]分析了我国53个柑橘品种的6种类胡萝卜素组成，其中宽皮柑橘就有19种。然而HPLC存在溶剂用量大、分离度差、耗时长等缺点。UPLC具有高效、分离度高、峰形尖锐、成本低、环境友好、结果精确等特点，已逐渐成为食品分析检测的有效工具[4-6]。李文爽等[15]利用UPLC测定小麦中的4种类胡萝卜素，仅需25 min，而HPLC需要60 min以上。液相色谱-质谱联用技术结合了色谱和质谱两者的优点，将色谱的高分离性能和质谱的高鉴别特点相结合，已成为准确定性检测类胡萝卜素的技术之一。MATSUMOTO等[18]分析了39个柑橘品种的18种类胡萝卜素，并研究了类胡萝卜素含量随季节变化的规律。但液相色谱-串联质谱仪价格昂贵，并不常用。目前国外对柑橘中类胡萝卜素的研究主要集中于橙汁[21-22]，且国内还未有UPLC快速检测柑橘中类胡萝卜素的相关报道，特别是产量最大的宽皮柑橘。

本研究在前人基础上，优化了宽皮柑橘中类胡萝卜素的提取条件，建立快速、有效的UPLC方法,对我国34个宽皮柑橘品种中的主要类胡萝卜素物质含量进行测定，并分析比较不同宽皮柑橘品种的不同部位(果肉和果皮)中类胡萝卜素物质的种类和含量差异，探究类胡萝卜素与宽皮柑橘品种的相互关系，旨在充实宽皮柑橘功能性成分数据库，为合理开发利用柑橘资源、提高柑橘综合利用价值提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

34个宽皮柑橘品种均来自国家果树种质资源(重庆)柑橘圃，样品信息如表1。在果实成熟期，选择树势相对一致的3～5株树，在树冠中外围的中上部随机挑选大小、成熟度相对一致的果实。

叶黄素(纯度≧97%)、玉米黄质(纯度≧95%)、β-隐黄质(纯度≧97%)、α-胡萝卜素(纯度≧98%)、β-胡萝卜素(纯度≧97%)，美国Sigma-Adrich公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT，纯度≧99%)，德国CNW Technologies GmbH公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚(MTBE)、正己烷，均为色谱纯，德国CNW Technologies GmbH公司；丙酮、四氢呋喃、乙醇、KOH、Na2SO4，均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

Waters ACQUITY UPLC色谱仪(2996 PDA检测器，version 4.1 Empour工作站)，美国Waters公司，配YMC类胡萝卜素C30分析柱(4.6 mm×100 mm, 3 μm),日本YMC公司；Milli-Q Advantage A10超纯水器，美国Millpore公司；XS205电子天平(感量0.01 mg)、PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01 g)，瑞士梅特勒-托利多公司；0.22 μm有机相针式滤器，上海安谱科学仪器有限公司；KS260摇床，德国IKA公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；3K15高速冷冻离心机，美国Sigma-Aldrich公司；WD-12氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 实验方法

仪器条件参考文献[15]：流动相A为V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)∶V(三乙胺)=81∶14∶5∶0.05，流动相B为V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(三乙胺)=68∶32∶0.05。洗脱梯度：0 min，100%A；0.3 min，100%A；12 min，0%A；20 min，0%A；22 min，100%A；25 min，100%A。柱温35℃，流速0.5 mL/min，进样量3 μL，检测波长450 nm。根据标准样品的保留时间判断样品中类胡萝卜素的组分，并采用不同浓度的混合标准样品与对应的峰面积值间的关系制作标准曲线(R2>0.999 0)，采用积分获取样品的峰面积，再根据标准曲线计算样品相关组分含量。

1.3.2 标准溶液的配制

准确称取5种类胡萝卜素标准物质各2 mg，于10 mL容量瓶中分别用四氢呋喃(含体积分数为0.1%BHT)溶解并定容至刻度，配制成200 mg/L的标准品母液。以上标准品母液均存放于棕色瓶中，-80 ℃保存备用。

1.3.3 样品前处理

样品的取样参考相关标准[23]。用干净纱布轻轻擦去柑橘样品表面附着物，采用对角线分割法，取对角部分，将果皮和果肉分开(果肉保留囊衣，剔除种子)，将其切碎、混匀，放入食品加工器中彻底粉碎，制成待测样，放入分装容器中备用。前处理参照相关方法[24]，并作一定的改进：(1)提取：准确称取样品5.00 g于离心管中，加入25 mL V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1(含体积分数为0.1%BHT)，高速匀浆提取8 min，离心分层，收集有机相，旋转蒸发(40 ℃)浓缩至干，用约2 mL MTBE(含体积分数为0.1%BHT)洗涤烧瓶。(2)皂化：提取液中加入2 mL 10%(体积分数)KOH-甲醇溶液(含体积分数为0.1%BHT)，避光反应12 h。(3)萃取：加入5 mL水和2 mL MTBE(含体积分数为0.1%BHT)，收集有机相，加入4 mL MTBE(含体积分数为0.1%BHT)再洗涤1次，收集有机相。合并后的有机相用5 mL水洗涤2次，收集有机相，无水Na2SO4干燥，氮吹至干(40 ℃)，用MTBE(含体积分数为0.1%BHT)定容至1.0 mL，经0.22 μm微孔有机滤膜过滤后上机检测。

加标实验：果肉的加标水平为0.2和1 mg/kg，分别向5 g空白果肉样品(旭柑)中加入100 μL的10 mg/L和50 μL的100 mg/L标准溶液；果皮的加标水平为1和5 mg/kg，分别向5 g空白果皮样品(旭柑)中加入50 μL的100 mg/L和250 μL的100 mg/L标准溶液，混匀备用。前处理如上。

采用Origin 9.0软件绘图、数据统计；应用SPSS 24.0软件计算标准误差，并进行方差分析(ANOVA)，利用邓肯式多重比较对差异显著性进行分析(P<0.05)。所有样品均为3次平行，测定结果以平均值±标准差(mean±SD表示)。

2 结果与讨论

2.1 标准色谱图

类胡萝卜素均为脂溶性化合物，在C30色谱柱有较好的保留，因此本实验选择类胡萝卜素专用柱C30液相色谱柱，标准色谱图见图1。5种类胡萝卜素在22 min内达到完全的基线分离，与传统的HPLC相比，UPLC方法的分离时间只有原来的1/3[5, 7]，大大缩短了分析时间。

2.2 样品前处理的优化

2.2.1 提取剂的类型

实验选择3种不同的有机提取剂，以考察不同提取剂对柑橘(黄岩蜜桔果肉)中类胡萝卜素提取效果的影响，从而确定适合的提取剂，结果如图2所示。同一条件下，正己烷的提取效果最差，V(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1的提取效果较好，使用V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1提取获得的类胡萝卜素的总量最高。因此，选择V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1作为柑橘中类胡萝卜素的提取剂。

2.2.2 不同处理方法提取效果

类胡萝卜素如β-隐黄质含有1个羟基，叶黄素和玉米黄质含有2个羟基，在基质内多被酯化，而皂化反应可以去除脂质、脂肪酸和叶绿素，并水解类胡萝卜素酯。实验采用皂化和非皂化2种处理方法，考察了不同处理方法对柑橘(黄岩蜜桔果肉)中类胡萝

卜素提取效率的影响，结果如图3所示。皂化后测得的类胡萝卜素总含量明显高于未经皂化的，说明通过皂化能更有效地提取柑橘中的类胡萝卜素[20, 25]。

2.3 方法评价

在优化的实验条件下，对系列浓度标准溶液进行检测，结果见表2。5种类胡萝卜素在0.1～20 mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数达到0.999以上。仪器的检出限(S/N=3)为0.05 mg/L，定量限(S/N=10)为0.1 mg/L。保留时间和峰面积的日内偏差分别为0.6%～1.3%和1.4%～3.4%；日间偏差分别为0.9%～2.3%和4.1%～7.1%。

采用对空白基质(类胡萝卜素含量较低的旭柑)加标的方法进行回收率和精密度实验。分别对果皮和果肉样品进行2个水平的加标回收实验，以1.3.3节的方法对样品进行前处理，平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差(表3)。结果表明：在果肉样品中，2种添加水平的回收率在80.5%～92.3% 之间，相对标准偏差在3.2%～7.1%之间；在果皮样品中，2种添加水平的回收率在81.3%～91.5%之间，相对标准偏差在2.6%～7.9%之间。本方法有较好的准确度和精密度，满足柑橘中类胡萝卜素定量分析的要求。此方法的检出限为0.01 mg/kg，定量限为0.02 mg/kg。

2.4 实际样品测定

从国家果树种质资源(重庆)柑橘圃抽取34个宽皮柑橘样品，采用上述方法进行测定，不同品种果肉中类胡萝卜素的含量如表4所示，不同品种果皮中类胡萝卜素的含量如表5所示。实际样品(黄岩蜜桔)果肉和果皮的色谱图如图4所示。

2.5 宽皮柑橘中类胡萝卜素含量

宽皮柑橘中类胡萝卜素含量丰富，果肉和果皮中的平均总量分别为12.41和37.87 mg/kg FW，普遍高于文献报道的其他品种。果肉和果皮中类胡萝卜素分布均呈以下规律：β-隐黄质>玉米黄质>叶黄素>β-胡萝卜素>α-胡萝卜素。

2.5.1 果肉中类胡萝卜素含量

果肉中β-隐黄质的平均含量达8.44 mg/kg FW，占果肉总类胡萝卜素含量的68.0%，四会柑最高，达18.74 mg/kg FW，旭柑最低，仅为0.30 mg/kg FW。玉米黄质含量次之，其平均含量为2.19 mg/kg FW，占果肉总类胡萝卜含量的17.6%，蕉柑最为丰富(7.69 mg/kg FW)，旭柑最低(0.033 mg/kg FW)。叶黄素含量相对较低，其平均含量仅为1.04 mg/kg FW，仅占果肉总类胡萝卜含量的8.4%，贡柑最高(3.00 mg/kg FW)，旭柑最低(0.067 mg/kg FW)。β-胡萝卜素和α-胡萝卜素的总平均含量仅为0.75 mg/kg FW，占5种类胡萝卜素总含量的6.0%。除旭柑外，其他样品均检测出β-胡萝卜素，而满头红、莽山野桔、少核朱红橘、椪柑、旭柑、春见、不知火、清见和爱媛38等9个品种中均未检出α-胡萝卜素。

2.5.2 果皮中类胡萝卜素含量

与果肉一致，β-隐黄质也是果皮中最主要的类胡萝卜素，其平均含量为23.73 mg/kg FW，占果皮总类胡萝卜素的62.7%，椪柑最高(47.32 mg/kg FW)，晚蜜一号最低(2.59 mg/kg FW)。玉米黄质含量次之，其平均含量为9.16 mg/kg FW，占果皮总类胡萝卜素的24.2%，八月桔最高(29.31 mg/kg FW)，爱媛38最低(1.35 mg/kg FW)。叶黄素平均含量为4.15 mg/kg FW，占果皮总类胡萝卜素的11.0%，八月桔最高(13.27 mg/kg FW)，晚蜜一号最低(0.78 mg/kg FW)。β-胡萝卜素含量较低，其平均含量为0.74 mg/kg FW，仅占总类胡萝卜素的2.0%。与果肉中一致，α-胡萝卜素的含量最低，平均含量为0.09 mg/kg FW，在晚蜜一号和清见中均未检出。从总量上看，果皮中类胡萝卜素含量普遍高于果肉(总含量比值变幅为0.78～23.30 mg/kg FW)。

2.5.3 不同品种果肉中类胡萝卜素含量差异

从总量上看，四会柑果肉中类胡萝卜素含量最高，可达27.04 mg/kg FW，旭柑最低(0.40 mg/kg FW)。34种宽皮柑橘可分为橘类(编号1～18)、柑类(编号19～23)和杂柑(编号24～34)三大类，品种之间的含量差异显著(橘类>柑类>杂柑类)。橘类的类胡萝卜素含量最为丰富，平均含量为14.73 mg/kg FW，柑类(13.51 mg/kg FW)略低于橘类，最低的为杂柑类(8.11 mg/kg FW)。橘类中β-隐黄质除马水桔和砂糖桔(低于5.00 mg/kg FW)，其他品种的β-隐黄质均高于5.00 mg/kg FW，变幅为5.34～18.74 mg/kg FW；柑类中，与蕉柑和贡柑(β-隐黄质含量分别为6.76和3.09 mg/kg FW)相比，温州蜜柑(编号19～21)富含较多的类胡萝卜素，3个品种的β-隐黄质的变幅为8.92～14.29 mg/kg FW；杂柑中，类胡萝卜素含量普遍较低，除蜜可露和默科特(β-隐黄质分别为15.25和14.34 mg/kg FW)，其余品种β-隐黄质的变幅为0.30～5.30 mg/kg FW，旭柑最低。

2.5.4 不同品种果皮中类胡萝卜素含量差异

从总量上看，八月桔果皮中类胡萝卜素含量最高，高达80.85 mg/kg FW，爱媛38最低(7.02 mg/kg FW)。橘类的类胡萝卜素含量最为丰富，平均含量为47.94 mg/kg FW；与果肉中不同，杂柑果皮中的类胡萝卜素平均含量(28.71 mg/kg FW)略高于柑类(21.80 mg/kg FW)。橘类的β-隐黄质平均含量为30.70 mg/kg FW，约为柑类的2.29倍，杂柑类的1.80倍。橘类的玉米黄质的平均含量为11.18 mg/kg FW，明显高于杂柑类(7.52 mg/kg FW)和柑类(5.44 mg/kg FW)。橘类的叶黄素的平均含量为5.00 mg/kg FW，明显高于杂柑类(3.56 mg/kg FW)和柑类(2.39 mg/kg FW)。与陶俊报道的结果[7]相比：总体上类胡萝卜素含量相当，橘类中南丰蜜桔总量偏低，本地早的β-隐黄质和总量均偏低，杂柑类中默科特的β-隐黄质和总量均偏高。

3 结论

宽皮柑橘果实中含有丰富的类胡萝卜素物质，但生长环境和基因差异导致不同宽皮柑橘品种类胡萝卜素的含量存在明显差异。宽皮柑橘中类胡萝卜素以β-隐黄质为主，果皮中含量普遍高于果肉。

[1] WU Houjiu. The situation and outlook of citrus processing industry in China[C]. China/FAO Citrus Symposium. Beijing,2001.

[2] 张静,朱丽莎,张耀海,等.不同晚熟柑橘中酚类物质的含量检测及分析[J].食品与机械,2018,34(12):27-33;69.

[3] 于玉涵.柠檬中黄酮类化合物和辛弗林的检测和含量特征分析[D].重庆:西南大学,2011.

[4] 冉玥.基于柑桔功能成份指纹图谱地理标志产品鉴别技术研究[D].重庆:西南大学,2013.

[5] 郑洁.我国不同品种金柑主要营养及活性成分研究[D].重庆:西南大学,2015.

[6] 龚蕾.不同柚类中酚类物质的检测及差异性研究[D].重庆:西南大学,2016.

[7] 陶俊,张上隆,徐建国,等.柑橘果实主要类胡萝卜素成分及含量分析[J].中国农业科学,2003,36(10):1 202-1 208.

[8] ZHANG Yaohai, JIAO Bining. Simultaneous determination of six protoalkaloids in Chinese local varieties of loose-skin mandarins and sweet oranges by strong cation exchange-high performance liquid chromatography[J]. Food Analytical Methods,2019, 12(3):677-686.

[9] 王磊.柑桔汁中肌醇和可溶性糖检测及含量研究[D].重庆:西南大学,2010.

[10] 何朝飞.柑橘地理标志产品挥发性成分及其产地溯源研究[D].重庆:西南大学,2013.

[11] 陶俊,张上隆.园艺植物类胡萝卜素的代谢及其调节[J].浙江大学学报,2003,29(5):585-590.

[12] MILANI A, BASJRNEJAD M, SHAHBAZI S, et al. Carotenoids: biochemistry, pharmacology and treatment[J]. British Journal of Pharmacology,2017,174(11):1 290-1 324.

[13] 胡建中,王可兴,潘思轶.高效液相色谱法测定柑橘汁中类胡萝卜素[J].食品科学,2006,27(12):634-636.

[14] ATTILA A, NAGY V， ZOLTAN S, et al. Comparative study on the carotenoid composition of the peel and the pulp of different citrus species[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies,2007,8(3):390-394.

[15] 李文爽,夏先春,何中虎.普通小麦类胡萝卜素组分的超高效液相色谱分离方法[J].作物学报,2016,42(5):706-713.

[16] JANE N E, PIA L M, LARS O D, et al. Optimized, fast-throughput UHPLC-DAD based method for carotenoid quantification in spinach, serum, chylomicrons and feces[J]. J Agric Food Chem,2017,65:973-980.

[17] JOSE A F, JORGE A M P, PRISCILLA P F, et al. Ultrasound-assisted liquid-liquid extraction followed by ultrahigh pressure liquid chromatography for the quantification of major carotenoids in tomato[J]. J Food Com Anal,2017,57:87-93.

[18] MATSUMOTO H， IKOMA Y， KATO M， et al. Quantification of carotenoids in citrus fruit by LC-MS and comparison of patterns of seasonal changes for carotenoids among citrus varieties[J]. J Agric Food Chem,2007,55(6):2 356-2 368.

[19] 赵大球,周华.植物类胡萝卜素分析方法研究进展[J].北方园艺,2011(2):195-199.

[20] AARTI S, SAYEED A, ANEES A. Green extraction methods and environmental applications of carotenoids-a review[J].RSC Adv.,2015(5):62 358-62 393.

[21] RODRIGO M J， CILLA A， BARBERA R, et al. Carotenoid bioaccessibility in pulp and fresh juice from carotenoid-rich sweet oranges and mandarins[J]. Food & Function,2015,6(6):1 950-1 959.

[22] GIUFFRIDA D, DUGO P, SALVO A, et al. Free carotenoid and carotenoid ester composition in native, orange juices of different varieties[J]. Fruits,2010,65(5):277-284.

[23] GB/T 8855—2008,新鲜水果和蔬菜-取样方法[S].北京:中国标准出版社,2008.

[24] HYOUNG S L, WILLIAM S C. Seasonal changes of carotenoid pigments and color in hamlin, earlygold and budd blood orange juices[J]. J Agric Food Chem,2001,49:877-882.

[25] 王彬,林亮,陈敏氡,等.南瓜类胡萝卜素含量的超高效液相色谱分析[J].农学学报,2017, 7(12):22-27.