牡丹籽油是以油用牡丹籽为原料，经压榨、精制等工艺制成黄色透明油状液体[1]。牡丹籽油含有丰富的不饱和脂肪酸，具有抗氧化、降低血糖血脂、防癌抗癌、调节脂肪酸代谢、保护肝脏等作用[2-4]。牡丹籽油中富含亚麻酸(约40 g/100 g)，远远超过橄榄油(约0.5 g/100 g)、菜籽油(约8.5 g/100 g)等植物油，有研究表明，α-亚麻酸对血脂成分、花生酸合成、免疫功能异常、心血管健康、脂类代谢的基因异常、精神障碍、细胞信号级联反应和基因表达等均有重要影响[5-7]。α-亚麻酸的缺乏是导致老年痴呆、心脑血管疾病、高血压、高脂血症和糖尿病、癌症等疾病的重要诱因，可见牡丹籽油是一种很有开发前景的植物油[8-11]。
甘油三酯是由1个甘油分子和3个脂肪酸分子生成，天然甘油三酯很少含有3个相同的酰化脂肪酸，一般是由多种不同的脂肪酸组成。国外研究表明，脂肪酸在甘油三酯中的位置分布对于脂肪营养是一个重要的影响因子，决定着甘油三酯的吸收代谢过程及油脂的应用价值[12-14]。故而分析牡丹籽油甘油三酯结构对牡丹籽油对人体的保健功能研究有参考作用。拉曼光谱对有机酸分子具有很好的指纹特性，有快速高效、无污染、无损分析等优点，且其特征峰对应于有机分子的官能团，能精确反映官能团的浓度[15]。相比红外、紫外、荧光、近红外等光谱分析方法，拉曼光谱应用领域更广、检测范围更宽、灵敏度更高、更快速，无污染[16]。食用油的拉曼光谱信息非常丰富，油脂结构中占有较大比重的不饱和键对拉曼光谱中的分子振动有较大贡献，其信息可于拉曼光谱中清晰表达[17]。
本实验在分析牡丹籽毛油基本理化特性的同时选用胰脂肪酶对甘油三酯Sn-1,3位进行专一性水解，将Sn-1,3位置上的脂肪酸游离出来，通过薄层层析分离可得到单甘脂。甲酯化后经气相色谱分析可知Sn-2位脂肪酸组成，利用1,3-随机-2-随机分布学说可计算出甘油三酯组成[18-20]。利用拉曼光谱测试牡丹籽毛油拉曼光谱特征，分析其分子的官能团结构，以期为牡丹籽油的营养学深入研究和产品开发提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
‘凤丹’牡丹籽，山东菏泽油用牡丹产业基地；37种C4-C24脂肪酸甲酯混标(产品编号：18919-1AMP | SUPELCO)，sigma-aldrich公司；猪胰脂肪酶(30 000 u/g，生物试剂纯)，上海腾准生物科技有限公司；胆酸钠(分析纯)、柱层析硅胶(100～200目，化学纯)，重庆市钛新化工有限公司；其他实验室常用试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
GC-2010气相色谱仪(配有氢火焰检测器(FID)，日本岛津公司；激光显微拉曼光谱仪，英国Renishaw公司；SB-3200DTDN型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；1580型离心机，Gene有限公司；6YZ-160型榨油机，上海亚荣生化仪器厂；GF254高效薄层层析硅胶板(20 cm×20 cm)，北京贝洛生物科技有限公司；硅胶柱(柱长30 cm，内径2 cm)，重庆市钛新化工有限公司；薄层色谱展开缸(200 mm×200 mm)，上海信谊仪器厂。
1.3 实验方法
1.3.1 校准曲线的制作
外标溶液的配制：将8.2 mg标准品溶于2 mL V(石油醚)∶V(乙醚)=1∶1溶剂中，稀释成质量浓度为4.1 g/L的溶液；将此母液依次稀释为2.05、1.03、0.51、0.26 g/L的混标溶液。将各浓度溶液经气相色谱法分析，对照说明书，计算各脂肪酸甲酯的标准曲线及相关系数。
气相色谱仪条件：检测器：火焰离子检测器(FID)；色谱柱：DB-WAX(30 m×0.246 mm×0.25 mm)；升温程序：185 ℃保持 3min；气化室250 ℃；进样温度250 ℃；载气：高纯氦气(60 mL/min)，氢气(40 mL/min)，空气(400 mL/min)；进样(1 μL)。
1.3.2 牡丹籽毛油提取
预热榨油机10 min，称取颗粒饱满牡丹籽40 g，分批数次放入榨油机，初榨油置于离心机5 000 r/min离心10 min，吸取上层油样用于后续分析使用。
1.3.3 牡丹籽毛油理化指标测定
酸价参照GB 5009.229—2016 执行;皂化值按照GB/T5534—20088 执行;过氧化值参照GB 5009.227—2016 执行;碘价参照GB/T 5532—2008 执行。
1.3.4 牡丹籽油甘油三酯制备
采用硅胶柱分离法：硅胶30 g，用石油醚调成糊状填充层析柱。取油样1 g，溶于15 mL三氯甲烷，加入层析柱，然后用300 mL洗脱液V(石油醚)∶V(乙醚)=9∶1洗脱，流速1～1.5 mL/min。收集液用旋转蒸发仪减压除去溶剂，得纯甘三酯，供气相色谱分析使用。
1.3.5 牡丹籽毛油脂肪酸组成测定
参考并改进室温甲酯化方法[21]。取80 mg牡丹籽毛油，装入5 mL离心管，加V(石油醚)∶V(乙醚)=1∶1混合溶液2 mL，稍适振摇，放置40 min。再加1 mL KOH-甲醇(0.4 moL/L)溶液混匀，静置30 min。沿瓶壁加入1 mL蒸馏水，静置，待分层后，上机检测。
1.3.6 胰脂肪酶水解牡丹籽油甘油三酯
称取0.1 g纯化过的甘油三酯于50 mL离心管中，加入胰脂肪酶100 mg及Tris-HCl缓冲液(pH 8)4 mL，摇匀；依次加入1 mL 2 g/L的胆酸钠溶液及0.4 mL 220 g/L的CaCl2溶液，摇匀，后置于40 ℃的恒温水浴锅7 min,并不断摇动；在40 ℃，18 KHz，80 W超声波清洗机中超声12 min，加入6 mol/L的HCl 3 mL并摇匀，加入10 mL V(正己烷)∶V(异丙醇)=9∶1混合液，摇匀，吸取上清液[22]。经薄层层析分离，确定甘一酯带并刮下，用乙醚提取甘一酯后除去溶剂，对甘一酯进行甲酯化后经气相色谱分析Sn-2位脂肪酸组成及含量。利用1，3-随机-2-随机分布学说计算甘油三酯的构成及含量[23]。
1.3.7 牡丹籽油拉曼光谱分析
仪器预热稳定后，将牡丹籽油样不经任何化学预处理，放入专用液体样品池。
拉曼光谱测定条件：激光波长：785 nm，光栅：400刻线/mm，光阑：50 μm狭缝，激光能量：10.0 mW；曝光时间：1.00 s，曝光次数：30，背景曝光次数：512，物镜：10×。
1.3.8 甘油三酯分布与组成的计算
根据牡丹籽油立体专一分布，由Sn-1、Sn-2、Sn-3位脂肪酸组成分析数据，采用1,3-随机-2-随机分布学说计算各甘三酯组分的含量，如公式(1)所示:
Sn-XYZ/%=R1×R2×R3×10-4
(1)
式中：R1，X酸在Sn-1,3 位的百分含量，%；R2，Y酸在Sn-2位的百分含量，%；R，Z酸在Sn-1,3位的百分含量，%。
如果油脂中含有n种脂肪酸，理论上可以生成n3种甘油三酯。
1.4 数据处理
采用统计分析软件SPSS进行显著性检验。每组试验进行3次，结果用(平均值±标准偏差)表示。
2 结果与讨论
2.1 牡丹籽毛油的理化指标
根据1.3.3 提供的方法测定牡丹籽油的理化特性指标。如表1所示，牡丹籽油的酸值为(3.54±0.19) mg/g，过氧化值为(0. 19±0.01) g/100 g，符合国标对植物原油的规定[24]。牡丹籽油皂化值较高，说明牡丹籽油脂肪酸分子量小，易吸收；碘值为(161.80±2.65) g/100 g，说明油的不饱和程度很高，牡丹籽油易被氧化，应注意贮藏条件[25]。
表1 牡丹籽毛油的理化指标
Table 1 Physical and chemical indexes of crude oil of
peony seed
酸值/(mg·g-1)过氧化值/[g·(100 g)-1]皂化值/(mg·g-1)碘值/[g·(100 g)-1]3.54±0.190. 19±0.01175.20±2.19161.80±2.65
2.2 甘油三酯脂肪酸组成的定性与定量分析
将牡丹籽油甘三酯样品甲酯化处理，再进行气相色谱分析，所得色谱图见图1。
a-37种脂肪酸甲酯气相色谱图;b-牡丹籽油脂肪酸组成气相色谱图
图1 牡丹籽油脂肪酸组成定性分析
Fig.1 Qualitative analysis of fatty acid composition of peony seed oil
所得图谱结合37种脂肪酸甲酯标样的保留时间与标准曲线定性定量，并将脂肪酸甲酯对照换算系数换算为脂肪酸含量，结果如表2所示[26]。此品种牡丹籽毛油的脂肪酸总含量为(89.73±1.89) g/100 g，总不饱和脂肪酸为(77.51±1.51) g/100 g。其主要脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸，其中三不饱和脂肪酸亚麻酸的含量高达(40.33±1.01) g/100 g，远高于橄榄油[(0.34g±0.01) g/100 g]及葡萄籽油[(0.21±0.01) g/100 g]等植物油[27-28]。有研究表明，人体每天需摄取6 g亚油酸，牡丹籽油甘三酯中含人体必需脂肪酸亚油酸，其含量为(21.08±0.61) g/100 g[29]。可见牡丹籽油是一种富含亚麻酸，亚油酸的植物油，可以维持人体正常生理代谢。
表2 牡丹籽油脂肪酸组成及定量分析
Table 2 Fatty acid composition and quantitative analysis of peony seed oil glycerin three fat
峰号脂肪酸组成含量/[g·(100 g)-1]1肉豆蔻烷酸C14∶00.12±0.0012十五烷酸 C15∶00.12±0.013棕榈酸 C16∶07.59±0.464棕榈油酸 C16∶10.15±0.0015十七烷酸 C17∶00.13±0.046十七碳烯酸C17∶10.09±0.017硬脂酸 C18∶04.11±0.418油酸 C18∶115.67±0.599亚油酸 C18∶221.08±0.6110亚麻酸 C18∶340.33±1.0111花生酸 C20∶00.15±0.0112二十碳烯酸 C20∶10.19±0.01单不饱和脂肪酸16.10±0.61多不饱和脂肪酸61.41±1.31总不饱和脂肪酸77.51±1.51总饱和脂肪酸12.22±0.99总计89.73±1.89
2.3 牡丹籽油甘油三酯结构分析
利用气相色谱法分析牡丹籽油甘三酯的总脂肪酸组成及其Sn-2位脂肪酸组成，根据脂肪酸甲酯标样定性，峰面积归一法定量，得到牡丹籽油的总脂肪酸及Sn-2位脂肪酸含量，所得气相色谱见图2，并采用1,3-随机-2-随机分布学说计算出甘三酯中Sn-1位、Sn-2位、Sn-3位脂肪酸组成分布，结果见表3。根据牡丹籽油立体专一分布，由Sn-1、Sn-2、Sn-3位脂肪酸组成分析数据，采用1,3-随机-2-随机分布学说计算牡丹籽油主要甘三酯组分的含量，结果见表4。
由猪胰脂酶水解法测定的牡丹籽油Sn-2位脂肪酸分布表明：Sn-2位脂肪酸主要由棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸组成，其中油酸含量最高，相对百分含量为(48.06±1.41)%，其次为亚油酸，为(24.07±0.63)%，亚麻酸(23.11±0.57)%。研究表明，Sn-2位脂肪酸直接以单甘酯的形式在小肠吸收，吸收效率大于Sn-1,3位脂肪酸。
结合表3及表4可知，牡丹籽油甘油三酯中有79%的油酸在Sn-2位置，这说明牡丹籽油中的油酸
a-牡丹籽油甘油三酯总脂肪组成气相色谱图;b-牡丹籽油Sn-2位脂肪酸组成气相色谱图;1-肉豆蔻烷酸甲酯，2-十五烷酸甲酯，3-棕榈酸甲酯，4-棕榈油酸甲酯，5-十七烷酸甲酯，6-十七碳烯酸甲酯，7-硬脂酸甲酯，8-油酸甲酯，9-亚油酸甲酯，10-亚麻酸甲酯，11-花生酸甲酯，12-二十碳烯酸甲酯
图2 牡丹籽油甘三酯总脂肪组成及Sn-2位脂肪酸组成气相色谱图
Fig.2 Gas chromatogram of total triglyceride composition and Sn-2 fatty acid composition of peony seed oil
表3 牡丹籽油立体专一分布相对百分含量 单位：%
Table 3 Mole specific distribution of peony seed oil relative
to percentage
脂肪酸/%Sn-1,2,3Sn-2Sn-1,3C16∶0/P5.19±0.352.03±0.156.77±0.60C18∶0/St1.69±0.091.12±0.031.98±0.02C18∶1/O20.23±0.5748.06±1.416.32±0.15C18∶2/L27.64±0.6224.07±0.6329.36±0.62C18∶3/Ln44.66±0.6123.11±0.5755.44±1.23其他脂肪酸0.59±0.010.61±0.010.58±0.01总不饱和脂肪酸/U92.73±0.5095.34±1.5791.42±1.47总饱和脂肪酸/S6.99±0.184.76±0.348.16±1.30
主要选择性地与Sn-2结合，Sn-2位油酸以单甘油酯的形式在体内被很好地吸收。13.0%的棕榈酸在牡丹籽油的甘油三酯Sn-2位置。22.0%的硬脂酸在牡丹籽油的甘油三酯Sn-2位置，这表明饱和脂肪酸牡丹籽油通常有选择性地酯化于Sn-1, 3位。牡丹籽油甘油三酯中有29.03%的亚油酸位于Sn-2位，17.25%的α-亚麻酸酯化在Sn-2位，这表明大多数亚油酸和α-亚麻酸酸选择性地结合到Sn-1,3位。这两种多不饱和脂肪酸比油酸更容易氧化，其高含量使牡丹籽油更容易氧化变质，这个分布不利于保护易氧化的脂肪酸。UUU的含量在79%以上，而SUU的含量在14%左右。牡丹籽油甘油三酯中Sn-LOLn含量最高，为15.64%，其次为Sn-LnOLn，为14.77%。其中Sn-LLLn、Sn-LLnLn、Sn-LnLLn、Sn-LnLnLn的含量约为7%。其余甘油三酯相对较小，含量小于5%。
表4 牡丹籽毛油甘油三酯结构及组成分析
Table 4 Analysis of structure and composition of glycerol three fat in peony seed oil
甘油三酯名称含量/%甘油三酯名称含量/%甘油三酯名称含量/%LOLn15.64OLLn1.68OOO0.19LnOLn14.77StOLn1.06LPL0.17LLLn7.84PLL0.96OPLn0.14LLnLn7.52OLL0.9POSt0.12LnLLn7.4OLnL0.86StOO0.12LnLnLn7.1LnPLn0.62PLP0.11LOL4.12StOL0.56PLnP0.11POLn3.6StLLn0.52OLO0.1OOLn3.36StLnLn0.5StLnO0.06LLL2.07POO0.42PLSt0.06LLnL1.99LnStLn0.34PLnSt0.06POL1.92LLSt0.28StOSt0.02PLLn1.8StLnL0.26StLSt0.01OOL1.78POP0.22StLnSt0.01PLnL1.74PLO0.2OPO0.01UUU79.68SSU0.71SUU14.22SSS0.03
注:UUU，三不饱和脂肪酸甘油三酯；SSU，一不饱和二饱和脂肪酸甘油三酯；SUU，一饱和二不饱和脂肪酸甘油三酯；SSS，三饱和脂肪酸甘油三酯。
2.4 牡丹籽油脂肪酸官能团组成分析
利用拉曼光谱测量系统对牡丹籽毛油样本重复测量3次，取平均光谱如图3所示。结合图3和表5可知，牡丹籽油具有11个特征峰，其分子结构显著特征是含有酯基及碳碳双键。1 657 cm-1处拉曼位移为C
C伸缩振动的特征峰，强度高。拉曼位移是CO拉伸振动的特征峰，在1 747 cm-1处强度最低。在1 439 cm-1处，拉曼位移是强度中等的C—H剪切弯曲振动的特征峰。1 301和1 265 cm-1处有一组肩峰。拉曼位移为1 081 cm-1是C—C拉伸振动产生的特征峰，强度弱。在866 cm-1处是C—C拉伸振动的特征峰。在1 301 cm-1处是弱强度的C—H扭曲振动的特征峰。拉曼位移1 265 cm-1为C—H弯曲振动时产生的特征峰，强度中等。
图3 牡丹籽油的拉曼光谱
Fig.3 Raman spectroscopic map of peony seed oil
1 265 cm-1处的特征峰常被用来估计顺式不饱和脂肪酸的总含量，如果样品中存在反式双键，则在这个波段没有吸收峰[30]。由于在相同波长下，不同植物油拉曼光谱的光谱形态差异显著，谱峰得到有效分离，可用于鉴别各类植物油；基于全波段光谱信息和形态建立的多步聚类分析模型还可准确鉴定各种类型的掺伪植物油[31]。
表5 牡丹籽油拉曼光谱主要特征峰
Table 5 Main characteristic peaks of Raman spectra of peony seed oil
拉曼位移/cm-1分子基团官能团振动方式强度866—(CH2)n—C—C伸缩振动弱1 081—(CH2)n—C—C伸缩振动弱1 265cis RHCCHRC—H弯曲振动中等1 3010C—H扭曲振动弱1 4390C—H剪形弯曲振动中等1 657cis RHCCHRCC伸缩振动强1 747RCOORCO伸缩振动极弱2 8530C—H伸缩振动(对称)极强2 8980C—H伸缩振动(对称)极强2 9320C—H伸缩振动(不对称)极强3 013RHCCHRC—H伸缩振动(不对称)强
3 结论
牡丹籽毛油脂肪酸组成有12种，主要为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸，其不饱和脂肪酸含量为(77.51±1.51) g/100 g。
由胰脂酶水解法测定牡丹籽油甘三酯Sn-2位脂肪酸分布表明：亚麻酸、棕榈酸，硬脂酸主要分布在Sn-1、Sn-3位上；油酸主要分布在Sn-2位上，油酸以单甘油酯的形式在体内被很好地吸收。亚油酸在Sn-1、Sn-2、Sn-3位上分布较平均。牡丹籽油甘油三酯中Sn-LOLn含量最高，为15.64%。
牡丹籽油的拉曼光谱表明，牡丹籽油有11个主要特征峰，其分子结构显著特征是含有酯基及碳碳双键。值得注意的是，1 265 cm-1处的特征峰说明牡丹籽油几乎不含反式脂肪酸。
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