谢瓦散囊菌CICC 41584产香特性及在浓香型白酒大曲生产中的应用

中国白酒是世界著名的六大蒸馏酒之一，香型分为清香型、酱香型和浓香型[1],深受广大消费者喜爱。浓香型白酒以其“窖香浓郁、绵柔甘洌、香味协调”的酒体风格而闻名，以己酸乙酯为主体香[2-3]。白酒风味及酒体设计向“淡、雅、柔”方向发展，茶香风味物质对白酒风味的调节，可促进白酒香型的风味提升，使白酒酒体风味满足新兴消费需求[4-5]。大曲作为白酒酿造过程中的糖化、发酵和增香剂，含有多种微生物和生物酶，对白酒的风味和口感起关键性作用[6]。微生物是制曲过程中糖化发酵的动力，也是大曲生香的重要来源，是酿造白酒的酒体风味形成的重要物质基础。

散囊菌属(Eurotium)真菌大量存在于传统发酵食品生产过程中，具有产茶香、产多种生物酶等性能[7-11]，在酿酒过程中发挥着重要作用，对大曲的风味有积极贡献，是一种重要的功能微生物类群。目前，在白酒酿造领域，散囊菌属在清、浓、酱香型白酒大曲中均有分离到，如茯砖茶中的“金花菌”-“冠突散囊菌(Eurotium cristatum)”，可产生芳樟醇氧化物、L-芳樟醇、1-辛烯-3-醇等多种风味物质，赋予茯砖茶特有的菌花香气。谢瓦散囊菌(Eurotium chevalieri)为浓香型和酱香型大曲中的优势真菌[12-13]，目前相关研究主要集中在菌种的分离鉴定水平，对其风味物质的分析及茶香风味物质在大曲固态发酵中的作用还未见报道，对于微生物茶香风味物质对大曲及酿造白酒的酒体风味调节研究还处于空白阶段。

本研究以分离自中高温大曲的产香E. chevalieri CICC 41584为研究对象，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用方法检测该菌株液体摇瓶发酵液中的挥发性风味物质，结合感觉阈值和相对气味活度值(relative odor activity value, ROAV)确定其关键性风味物质，并将该菌种以菌剂形式应用于白酒大曲生产中，通过对强化大曲风味物质分析揭示该菌株对大曲风味品质的提升效果，为后续白酒风味品质的改善提升提供了可行性思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Eurotium chevalieri CICC 41584分离于山东扳倒井股份有限公司浓香型白酒中高温大曲，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC)。

1.1.2 试剂及耗材

成品曲，山东扳倒井股份有限公司；麦芽浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；蔗糖等其他试剂为国产分析纯。

察氏琼脂培养基(czapek dox agar, CDA)、麦芽浸粉肉汤培养基(malt extract broth, MEB)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA),北京陆桥技术有限公司。

种子液培养基：麦芽浸粉20 g/L，蔗糖40 g/L，121 ℃灭菌15 min。

发酵培养基：在MEB培养基中添加葡萄糖40 g/L，自然pH，121 ℃灭菌15 min。

麸皮固体培养基：麸皮25 g，与蒸馏水1∶1混合，121 ℃灭菌60 min。

1.2 仪器与设备

BHG-8082型恒温培养箱、THZ-98C恒温振荡培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；ESCO B2型二级生物安全柜，北京五洲东方科技发展有限公司；固相微萃取装置(备有85 μmPA萃取头)，美国SupeLco公司；气相色谱-质谱联用仪，岛津GC/MS-QP2010 Plus。

1.3 试验方法

1.3.1 液体摇瓶发酵培养基的风味物质测定

1.3.1.1 菌株发酵液样品制备

挑取1环活化好的菌株接入种子液培养基中，以2%接种量接入含有40 g/L葡萄糖的100 mL MEB发酵培养基中，于28 ℃、120 r/min条件下恒温振荡培养10 d。

1.3.1.2 挥发性风味物质固相萃取

取发酵液5 mL，并加入2 g NaCl，置于20 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入手动进样器，在温度60 ℃左右顶空萃取40 min后取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口，热解吸3 min进样，进行GC-MS分析。

1.3.1.3 气相色谱和质谱条件(GC-MS)

气相色谱条件：CP-WAX57CB毛细管柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)，柱温采用程序升温，初温35 ℃，保持3 min后以3 ℃/min升温至80 ℃，再以9 ℃/min升到200 ℃，保持20 min。载气为高纯He(99.999%)，流速1.0 mL/min；进口温度230 ℃，不分流进样1 min。质谱条件：电子电离源(elctronic ionization, EI)，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，质谱扫描范围50～500 amu。

1.3.1.4 定性定量方法

将得到的挥发性风味物质的质谱数据与NIST14标准库进行对照匹配，取匹配度大于80的化合物保留分析，用于定性分析；定量分析采用峰面积归一化法计算各成分相对百分含量。

1.3.2 Eurotium chevalieri CICC 41584在浓香型白酒大曲生产中的强化应用

1.3.2.1 Eurotium chevalieri CICC 41584菌剂制备

挑取1环活化好的菌株接入种子液培养基中，将种子液以10%接种量接种于麸皮固体培养基，28 ℃培养14 d，培养期间观察有无杂菌污染。随机选取1瓶培养好的麸皮培养物称取5 g，稀释10倍，吸取1 mL涂布于PDA平板上，28 ℃培养5 d，未观察到有杂菌生长；检验合格后，用无菌长柄勺将麸皮培养物扣取至无菌的2 L烧杯中，摇匀，称取1 g培养物溶解于2 mL无菌蒸馏水中，显微镜检无杂菌孢子。将麸皮培养物转入20 L旋转蒸发仪旋瓶中，40 ℃水浴真空干燥24 h，水分控制到8%～10%(水分测定为8.7%)。通过250 W微型粉碎机粉碎30 s，过20目筛，菌粉封装于无菌自封袋中，共141 g。称取上述菌粉产品按照GB4789(霉酵计数方法)进行计数，其活菌落数为107～108 CFU/g。

1.3.2.2 Eurotium chevalieri CICC 41584强化方式及取样方法

取上述制备好的Eurotium chevalieri菌粉100 g溶解于15 L含20 g/L NaCl无菌蒸馏水中，采用微生物强化技术，将Eurotium chevalieri菌剂应用于浓香型白酒中高温大曲生产过程中。实验室前期通过表面喷洒和内部混料2种方式对中高温大曲进行了强化，对成品曲质量进行评价。结果表明内部混料方式强化大曲质量优于喷洒方式，后续强化试验研究采用内部混料方式。

将不添加Eurotium chevalieri菌剂的一房大曲作为对照，另一房大曲通过内部混料方式添加Eurotium chevalieri菌剂，加入8～9 mL终浓度为1.2×105 CFU/mL的菌液，每个曲房大约1 700块。为保证采样均一性，使用五点法结合四分法进行采样[14-15]。具体采样方式：在曲房的四角和中间5个位置各取1块长势良好的成品曲块，粉碎后混合均匀，四分法进行采样，供后续试验使用。

1.3.3 强化大曲感官指标测定

根据文献中大曲评价方法的描述对强化成品曲和对照成品曲进行感官指标评价[14]。

1.3.4 强化大曲风味物质测定

取粉碎均匀成品曲1 g，根据上述方法对强化大曲和对照大曲挥发性风味物质进行测定分析。

1.3.5 特征香气成分评价方法

参考刘登勇等[16]的方法，特征香气成分评价采用气味活度值法(odoractivity value, OAV)评价各挥发性成分对样品总体香气的贡献，即气味OAV为各香气组分的浓度(C)与感觉阈值(T)的比值：OAV=C/T。当OAV<1时，说明该物质对总体香味无影响；当OAV>1时，说明该物质可能对总体香味有直接影响；在一定范围内，OAV值越大说明该物质对总体风味贡献越大。

采用峰面积归一化法计算得到的挥发性香气组分浓度为相对浓度(Cr)，用相对浓度代替绝对浓度。将OAV值最大的香气组分作为标准，其他组分的OAV值与之相比，进而定义为相对气味活度值(relative odor activity value, ROAV)[16-18]，即各化合物的ROAVi为各香气组分的OAVi值与OAVmax值最大的香气组分的比值，即ROVAi=(OAVi/OAVmax)×100。

本研究认为ROAV≥1的组分为所分析样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV<1的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用[16-18]。

2 结果与分析

2.1Eurotium chevalieri CICC 41584发酵液风味物质测定

Eurotium chevalieri CICC 41584接种于发酵培养基中，28 ℃振荡培养10 d后，发酵液嗅觉感官为茶香、青草香，通过HS-SPME-GC-MS方法对发酵液挥发性风味物质进行检测，鉴定结果见表1。Eurotium chevalieri发酵液共检测到45种挥发性物质，其中醇类21种，醛类3种，酮类3种，酯类4种，酚类2种，烃类9种，酸类1种，其他2种。

注：阈值为酒精水溶液中的嗅觉阈值；“-”表示因为未查到该化合物的感觉阈值；“/”表示该化合物为非风味物质。下同。

对Eurotium chevalieri发酵液挥发性物质进行特征风味物质成分分析，共有16种物质与茯砖茶中风味物质一致[20-23]，其中7种物质是茯砖茶中普遍存在的风味物质，包括1-辛烯-3-醇、芳樟醇、香叶醇、橙花叔醇、苯乙酮、香叶基丙酮、棕榈酸甲酯。另外检出了2,4-二叔丁基苯酚、十七烷、十六烷、柏木醇、十八烷、正辛醇(1-辛醇)、萜品醇(松油醇)、癸醛、壬醛。

由表1可知，1-辛烯-3-醇、芳樟醇(里哪醇)、癸醛和香茅醇的ROAV值均大于1，是Eurotium chevalieri发酵液中关键风味化合物。其中，1-辛烯-3-醇具有青草香、水果香、蘑菇香和油脂风味[19]，芳樟醇具有绿茶青香、木青气息、玫瑰的花香[24]，葵醛具有醛香、蜡香、脂肪、柑桔香气[25]，香茅醇具有糖果香、玫瑰香、柑橘香[17]，这些关键风味物质为发酵液独特的风味特征做出了主要贡献。芳樟醇、橙花叔醇等萜烯类物质不仅是呈香物质，也是健康生物活性成分[26]。另外，橙花叔醇含量为0.72%，具有干甜而少清，带有像玫瑰、铃兰和苹果花的气息，微带木香，香气持久等特征[27]；柏木醇含量为3%，具有温和的柏木芳香，该类物质会使白酒香气更加复合、浓郁、绵柔[28]，也对发酵液风味具有重要贡献。发酵液中的香气物质1-辛烯-3-醇和芳樟醇的ROAV值分别为100和26.87，ROAV值较高，为风味主导成分，表现为茶香型风味，符合菌种发酵液的茶香嗅觉风味。

2.2 强化大曲感官评价结果

对成品曲进行大曲表观观察(图1)，并进行感官评价。结果表明，对照大曲未见黄色菌斑，强化大曲内部具有大量金黄色菌斑(Eurotium chevalieri)，断面整齐，较泡气，曲香浓郁纯正，无异味且具有茶香风味，具体感官描述见表2。综合对照大曲和强化大曲的表观形态，得出Eurotium chevalieri CICC 41584强化大曲在感官指标方面明显优于对照大曲，且强化大曲达到优级曲水平，Eurotium chevalieri CICC 41584强化提高了大曲品质。

2.3 强化大曲风味物质测定结果

采用HS-SPME-GC-MS方法检测强化大曲与对照大曲的挥发性风味物质成分，并根据香气阈值和ROAV对其进行主体香气成分评价，结果见表3。由表3可知，强化大曲检测出55种挥发性风味物质，其中醛类3种、醇类18种、酮类5种、酯类4种、吡嗪类8种、酸类8种、烃类7种、酚类1种、其他1种；对照大曲检测出55种挥发性风味物质，醛类4种、醇类16种、酮类4种、酯类6种、吡嗪类8种、酸类5种、烃类8种、酚类2种、其他2种。

注：阈值为酒精水溶液中的嗅觉阈值；“-”表示因为未查到该化合物的感觉阈值和未检测出此物质；“/”表示该化合物为非风味物质。

对大曲特征香气物质成分进行分析，强化大曲中的1-辛烯-3-醇、芳樟醇(里哪醇)、异戊醛、乙酸、异戊酸和4-乙基愈创木酚ROAV值大于1，是强化大曲的关键风味物质。3-羟基-2-丁酮、正丁醇、2,6-二甲基吡嗪、异丁酸、油酸乙酯ROAV值在0.1～1之间，对强化大曲的总体风味起修饰作用。在对照大曲中异戊醛、3-羟基-2-丁酮、2,6-二甲基吡嗪、糠醇、β-苯乙醇、乙酸、异戊酸、4-乙基愈创木酚ROAV值>1，为关键风味化合物。此外，2,3-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、正丁醇、苯甲醛、苯甲醇、油酸乙酯ROAV值在0.1～1之间，为对照大曲的总体风味具有重要的贡献作用。

结合菌株发酵液风味物质分析，强化大曲检测出关键性风味物质1-辛烯-3-醇、芳樟醇，且ROAV值较高，为强化大曲主导型风味物质，赋予大曲清香、青草香风味；对照大曲未检测出1-辛烯-3-醇和芳樟醇。Eurotium chevalieri CICC 41584强化大曲曲香浓郁，主导型风味物质更接近于发酵液主导风味物质。

对强化大曲风味物质中的功能因子进行分析，结果见表4。一些醇类、酸类等健康因子对大曲风味贡献较小，但含量高于对照大曲。在强化大曲中检测到的活性戊醇、异戊醇和α-苯乙醇峰面积明显高于对照大曲，分别是对照大曲的3.25、1.67和4.84倍，这些醇类化合物的风味阈值普遍较高，对大曲整体风味贡献较小。强化大曲中正丁醇峰面积比对照大曲提高144.91%，对大曲具有助香作用，对形成酒的风味和促使酒体丰满、浓厚起着重要的作用。强化大曲中的乙酸和4-乙基愈创木酚峰面积明显高于对照大曲，比对照大曲分别提高了86.25%和19.25%，且在对照大曲中未检测出芳樟醇。这3种物质都为关键风味物质并具有多种活性功效。芳樟醇具有抗菌、抗病毒及抗炎等活性功效[26]，乙酸具有促进胃液分泌、帮助消化、降血脂、降胆固醇、扩张血管、延缓血管硬化等功能[29]，Eurotium chevalieri产生健康因子阿魏酸，经菌株强化之后会转化为4-乙烯基愈创木酚，4-乙烯基愈创木酚具有较好的抗氧化、抗肿瘤和增强人体免疫力的作用[30]。强化大曲香叶基丙酮峰面积为89 618.391 62，是对照大曲的1.1倍，菌种摇瓶发酵液产生香叶基丙酮物质，经强化之后大曲中香叶基丙酮含量提高。强化大曲2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪和四甲基吡嗪峰面积分别达到335 701.026 9、2 227 155.516和848 127.033 8，分别比对照大曲提高7.90%、47.59%和43.73%，明显高于对照大曲，这些物质都是白酒健康因子，具有抗氧化，增强免疫力等功效[26]。强化大曲2,3-丁二醇含量降低，可经过一系列转化生成乙酸和四甲基吡嗪[31]。Eurotium chevalieri CICC 41584强化大曲有助于提高大曲品质，为进一步研究白酒风味奠定基础，对改善酒体风味提供理论参考。

3 结论

本研究解析了Eurotium chevalieri CICC 41584发酵液茶香关键风味物质组成情况，Eurotium chevalieri CICC 41584可产生以1-辛烯-3-醇、芳樟醇(里哪醇)、癸醛、香茅醇为关键挥发性风味化合物，其中1-辛烯-3-醇和芳樟醇(里哪醇)ROAV值分别为100和26.87，对发酵液风味贡献巨大，表现为茶香型风味。将该菌株强化于白酒大曲中，对比分析了强化大曲和对照大曲关键挥发性风味物质，强化大曲关键风味物质为1-辛烯-3-醇、芳樟醇、异戊醛、乙酸、异戊酸、4-乙基愈创木酚，其中1-辛烯-3-醇、芳樟醇ROAV值较高，为主导型风味，与Eurotium chevalieri纯菌种发酵液主导茶香型风味物质1-辛烯-3-醇和芳樟醇结果一致。揭示了该菌株对大曲风味品质的提升效果，为后续的白酒风味品质改善提供理论基础。

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