玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)又称F2毒素，主要是由镰孢属菌种产生的一种次级代谢产物。产ZEN的霉菌主要为田间霉菌，分布较广，易污染玉米、小麦、大麦、燕麦和小米等谷类作物，我国大部分地区都适宜其生长[1]。ZEN可引发人的中枢神经系统和动物的生殖系统紊乱[2-3]。因此对于食用这些谷物的人和动物而言，危害巨大。
呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇，为镰刀菌属的禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等的次级代谢产物，是较为常见的一种真菌毒素，其广泛存在于谷物中，如玉米、小麦、大麦等。每年全世界谷物类粮食都易受到DON的困扰，造成了极大的经济损失[4-5]。人和动物如果长期摄入DON可抑制体内蛋白质的合成，对人体有一定的危害作用，会造成呕吐、腹泻、厌食、恶心、神经紊乱等毒性效应[6-8]，欧盟分类标准为三级致癌物。
电子束辐照(electron beam irradiation，EBI)作为辐照技术中的一种，其原理为利用电子加速器产生的低能或者高能电子束射线，直接作用在分子上，使分子改性。EBI在真菌毒素降解领域具有广泛应用前景[9]。EBI作为辐照技术的一种，相比于γ辐照，更具便捷性、经济性和安全性。罗小虎等[10]研究表明EBI对玉米中黄曲霉毒素B1具有良好的降解作用。Supriya等[11]利用10和15 kGy EBI处理刀豆，在室温下贮存6个月，发现2种黄曲霉毒素被完全去除。郭东权等[12]以310 μg/kg的赭曲霉毒素A标品为研究对象，经过5 kGy EBI处理，降解率可达93.19%。此外，彭春红等[13]还对赭曲霉毒素A经EBI处理后的产物进行了分析，并对6种产物结构和毒性进行了分析。ASSUNÇ
O等[14]工接种Aspergillus flavus至坚果中，随后对坚果中的黄曲霉毒素B1进行了EBI处理，在5和10 kGy剂量下，毒素降解率分别达到53.32%和65.66%。张昆等[15-16]研究表明EBI对DON溶液中毒素的降解效果明显，降解率随剂量的增加而升高。高浓度的DON溶液在1～10 kGy辐照剂量时，降解效果比较好，而低浓度的DON在10～20 kGy辐照剂量时，降解效果比较好。前人的研究表明，EBI对于常见真菌毒素污染物均具有良好的降解效果，但尚未见EBI同时降解混合毒素的研究。
食品是国民基础行业，安全生产是食品行业的关键问题，重中之重。然而，我国大宗粮食如玉米、水稻和小麦中，真菌毒素检出率和超标率居高不下，玉米所受真菌毒素污染尤为严重。随着真菌毒素污染造成的食品安全问题暴露于公众视野[17-18]，研究人员不断寻求真菌毒素污染粮食降解再利用的方法，以尽可能减少国民经济损失和安全隐患。本文基于前人研究，探究EBI对ZEN和DON单一以及混合标品的降解情况，同时在玉米浆及玉米粉中进行了效果验证，探究毒素降解及相互作用规律，促进EBI在降解玉米中真菌毒素的应用，缩短理论研究与工业实际生产之间的距离，为提高玉米原料的利用率提供新的解决思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
DON和ZEN自然污染玉米，江苏泰兴；DON和ZEN标准品(纯度≥99.8%)、乙酸(色谱纯)，百灵威科技有限公司；甲醇、乙腈(色谱纯)，美国Fisher Scientific公司；实验用超纯水(电阻≥18.2 MΩ/cm)，美国Millipore公司；N2(纯度≥99.8%)，无锡新南化学气体有限公司；除已注明外，其他分析纯试剂均购自国药集团化学试剂公司。
1.2 主要仪器与设备
高效液相色谱仪1260系列带紫外和荧光检测器、ZORBAX SB-aq色谱柱(150 mm×4.6 mm；粒径5 μm)、BEM固相萃取柱(12165001B)，美国安捷伦公司；Mycosep 227多功能净化柱,ROMER国际贸易(北京)有限公司，Simplicity UV型超纯水仪,美国Millipore公司；EBI加速器(AB5.0),无锡爱邦辐射技术有限公司；水分分析仪MB 25,奥豪斯仪器(上海)有限公司；SCIENTZ-150高压均质机,宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 高效液相色谱检测DON和ZEN方法
(1)DON和ZEN标准溶液的配制
将DON和ZEN标准品溶于甲醇溶液(色谱纯)，制成质量浓度为100 μg/mL的标准储备液，-18 ℃保存。将100 μg/mL的标准储备液用甲醇稀释成20 μg/mL的标准工作液，-4 ℃保藏。
(2)玉米浆中DON和ZEN含量测定
玉米浆制作工艺参考郭成宇等的方法[19]，m(玉米)∶m(水)=1∶3的比例进行混合，2次磨浆，均质压力为30 MPa，均质温度为40 ℃，均质2次，4 ℃下于自封袋中储藏待用。
玉米浆中DON和ZEN提取：称取25.00 g玉米浆样品到250 mL锥形瓶中，加入100 mL 84%(体积分数)乙腈溶液，以200 r/min在恒温摇床(30 ℃)上振荡30 min后，过滤得到提取液。
DON和ZEN净化方法：分别取6 mL样品提取液过Mycosep 227多功能净化柱和BEM固相萃取柱，各收集4 mL净化液，50 ℃条件下N2吹干，残余物用1 mL甲醇复溶，涡旋振荡30 s，过0.22 μm有机针孔滤膜，收集滤液于进样瓶中，样品待测。
③液相色谱条件
DON：ZORBAX SB-aq色谱柱(150 mm×4.6 mm；粒径5 μm)；流动相：V(乙腈)∶V(水)=6∶94；流速0.9 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测器检测波长218 nm[20]。
ZEN：ZORBAX SB-aq色谱柱(150 mm×4.6 mm；粒径5 μm)；流动相：V(甲醇)∶V(水)=60∶40；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；荧光检测波长：激发波长274 nm，发射波长440 nm[1]。
1.3.2 EBI处理毒素标准品
(1)EBI处理单一毒素：取一定量的DON和ZEN标准溶液，分别用甲醇配制成质量浓度分别为0.1、1.0和10 μg/mL的溶液，取1 mL于10 mL聚乙烯离心管中。分别在0、2、4、6、8和10 kGy下进行辐照，加速电子能量5 MeV，束流20 mA，剂量率2 kGy/s。
(2)EBI处理混合毒素：取毒素标准溶液，用甲醇配制为终质量浓度1 μg/mL的ZEN-DON混合溶液，取1 mL置于10 mL聚乙烯离心管。分别在0、2、4、6、8和10 kGy下辐照。
1.3.3 EBI处理加标玉米浆
在玉米浆中加入ZEN和DON标准溶液，混合均匀，使其在玉米浆中终质量浓度为1 μg/mL，分别得到单一毒素和混合毒素加标玉米浆，4 ℃放置过夜。将加标样品铺平至厚度≤1 cm后，在20 kGy剂量下进行EBI处理。以未加标样品作为空白，检测其回收率。
1.3.4 EBI处理自然污染玉米
以250 g为单位，将不同水分含量(14.2%，19.8%)的玉米粉(自然污染玉米籽粒磨粉过30目筛)分装入聚乙烯袋中，铺平至厚度≤1 cm，于0、10、20、30、40和50 kGy剂量下EBI处理，以人工污染玉米粉为对照。辐照后的样品于4 ℃下储藏待测。
1.3.5 玉米水分含量测定
按照国标GB/T 5009.3—2010测定玉米粉水分含量。用于EBI处理的玉米粉初始水分含量为14.2%，通过人工加湿获得水分含量为19.8%的玉米粉样品。
2 结果与分析
2.1 EBI降解单一毒素的效果
不同浓度下单一毒素标准品的EBI降解效果如图1所示。结果表明，ZEN和DON降解率均随EBI剂量的增加而增加。
图1 不同剂量EBI处理对ZEN(a)和DON(b)标品的降解效果
Fig.1 The degradation effect of ZEN (a) and DON (b) by EBI at different doses
当辐照剂量为0～4 kGy时，DON降解率缓慢增加，6～8 kGy辐照剂量下，降解率迅速上升，10 kGy剂量下，0.1 μg/mL的DON降解率达到100%，其他2种浓度下，DON降解率分别为76.04%和71.86%。张昆等[13]发现EBI处理DON纯品，随着辐照剂量的增加，降解率逐渐升高，与本研究结果相同。辐照剂量0～10 kGy下，ZEN的降解率一直呈快速增加状态，当剂量为10 kGy时，3种不同浓度的ZEN样品降解率分别达到了100%、89.31%和77.67%。结果表明，浓度对EBI降解毒素的影响存在显著性差异(P<0.05)。
2.2 EBI降解ZEN-DON混合溶液效果
以单一毒素降解率为对照，EBI对ZEN-DON混合溶液的降解效果如图2所示。结果表明，1 μg/mL质量浓度下，混合溶液中ZEN和DON降解率与EBI呈剂量依赖性；ZEN降解效果明显减弱，当剂量为6 kGy时降解率差值达到最大，由单一降解时的70.27%降为28.57%；0～8 kGy时，DON降解趋势未发生明显变化，2种毒素共存体系状态下，DON对ZEN的降解存在较强的抑制作用，ZEN对DON的降解效果影响不显著(P>0.05)。
图2 不同剂量EBI处理对ZEN-DON混合溶液的降解效果
Fig.2 The degradation effect of mixed solution of ZEN-DON by EBI at different doses
2.3 EBI降解玉米浆中毒素的效果
玉米浆中ZEN和DON的加标回收率如表1所示，以未加标玉米浆为空白，扣除其本底浓度，回收率均高于80%。
表1 玉米浆中ZEN和DON的加标回收率
Table 1 Recovery of spiked ZEN and DON in corn syrup
毒素种类分组添加量/(mg·kg-1)检测值/(mg·kg-1)回收率/%ZENZEN1.00.87±0.0387.25ZEN+DON1.00.84±0.0184.05DONDON1.00.91±0.0390.69ZEN+DON1.00.89±0.0189.14
由于玉米浆对电子束穿透性具有一定阻隔作用，加之EBI作用于水溶液后产生的自由基和水合离子也可与玉米成分发生反应，因此选用0～50 kGy的辐照剂量降解玉米浆中的毒素。图3所示为较大辐照剂量下，EBI对1000 μg/kg玉米浆中ZEN和DON的降解效果。与2.1中结果类似，ZEN和DON的降解率均随EBI剂量的增加而增加，其中ZEN降解率大于DON。剂量为50 kGy时，ZEN和DON的降解率分别为92.15%和72.08%。
由图3可知，10 kGy剂量下，ZEN在玉米浆中的降解率为55.21%，显著低于其标准品溶液的降解率(89.31%)。齐丽君等[1]的研究结果表明，50 kGy EBI处理可导致玉米籽粒色度增加，脂肪酸值升高，氨基酸含量下降。由此可知，EBI产生的活性物质可与玉米组分发生反应，从而导致与毒素分子发生反应的自由基和水合电子浓度下降，毒素降解率降低。此外，该研究中，50 kGy EBI剂量下，玉米样品仅氨基酸含量和玉米淀粉糊化特性变化显著(P<0.05)，其它理化性质无明显变化。
图3 不同剂量EBI对玉米浆中ZEN和DON的降解效果
Fig.3 The degradation effect of ZEN and DON by EBI at different doses in spiked corn syrup
剂量-降解率曲线，最大程度地反映了混合毒素同时降解的相互作用，选取20 kGy作为混合毒素的辐照剂量，对混合毒素加标玉米浆进行辐照处理，结果如图4所示。ZEN和DON混合加标的玉米浆经EBI处理后，相较于单一毒素加标样品，ZEN的降解率由70.98%降至约60%，呈明显降低，DON降解率则略微升高，但变化不显著(P>0.05)，说明在EBI处理过程中，DON对ZEN的降解具有抑制作用。
图4 EBI处理(20 kGy)对混合加标玉米浆中ZEN和DON的降解效果
Fig.4 The degradation effect of ZEN and DON in spiked corn syrup by EBI (20 kGy)
2.4 EBI降解自然污染玉米中毒素的效果
EBI对单一加标玉米粉中ZEN(1203.72 μg/kg)和DON(724.55 μg/kg)的降解效果如图5所示。14.2%水分的玉米粉中ZEN和DON降解率均呈剂量依赖性，50 kGy剂量下，二者降解率分别达71.10%和49.31%；当水分含量提高至19.8%时，2种毒素降解率均进一步增加，且辐照剂量越大，降解率增加越显著，50 kGy时，ZEN和DON降解率分别为89.05%和70.04%。以上结果表明，水分含量对玉米粉中2种毒素的EBI降解具有显著影响，导致该现象的原因可能为：相同剂量下，随水分含量增加，反应体系中自由基和水合电子含量增加，因此增大了反应活性物质与毒素分子的碰撞机率。
图5 EBI辐照对不同水分含量玉米粉中ZEN(a)和DON(b)的降解效果
Fig.5 The degradation effect of ZEN(a) and DON(b) in corn powder with different moisture content by EBI
根据图5所示结果，选取30 kGy EBI处理不同水分含量的ZEN(1189.73 μg/kg)和DON(756.10 μg/kg)自然污染玉米粉，结果如图6所示。
a-14.2水分含量；b-19.80水分含量
图6 EBI处理(30 kGy)对不同水分含量玉米粉中ZEN和DON的降解效果
Fig.6 The degradation effect of ZEN and DON in corn powder with different moisture content by EBI (30 kGy)
图6(a)中，14.2%水分含量下，自然污染样品中ZEN和DON降解率均显著低于单一加标玉米粉(P<0.05)，而图6(b)水分含量19.8%的玉米粉中，ZEN降解率仍显著低于对照组(P<0.05)，DON降解率则略微高于单一加标样品。由此可知，毒素共同污染玉米粉中，ZEN和DON的降解规律显著不同于单一污染样品，高水分含量下，DON对ZEN的EBI降解存在抑制现象，而低水分含量下2种毒素降解效果较差，推测原因可能为EBI激发水分子产生的自由基和水合电子较少，由此导致ZEN和DON竞争活性物质。
3 结论
本文考察了EBI对谷物中常见真菌毒素DON和ZEN的降解效果，并分析两者同时降解的相互作用，为EBI在粮食真菌毒素降解中的应用提供了理论参考。研究结果表明，高水分含量下，DON对ZEN的EBI降解有一定程度的抑制作用，实际工业应用中对两者同时存在的情况需酌情加大辐照剂量，以达到预期降解效果。
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