芒果原产于东南亚热带地区，风味独特，营养价值较高，特别是芒果所含有的VC和VA的前体胡萝卜素的含量特别高，有“热带水果之王”的美誉。芒果品种繁多，在我国云南、广西、广东、福建、台湾和海南等省份广泛种植，是我国极为重要的热带水果，经济价值较高[1-2]。芒果生长在高温高湿地区，果实容易受到微生物的侵染，其又属于呼吸跃变型水果，导致芒果不易存储，易于腐烂变质[3]。我国国土面积辽阔，很多水果需要从出产地运输到其他地方销售，而芒果的这一特点，造成芒果在运输和储存过程中发生较大损耗，严重影响芒果的经济效益[4]。目前，已有多种技术和材料被用于芒果采后保鲜，它们基本上都是从不同方面降低芒果的新陈代谢，以达到延缓芒果的失水、腐烂和褐变等目的。研究者多以壳聚糖、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠和魔芋葡甘聚糖等天然大分子多糖类材料为覆膜剂，与柠檬酸、CaCl2或抗坏血酸等材料进行复配，制备成复合涂膜保鲜剂对水果进行保鲜[4-7]。随着人们生活水平的提高，加强水果保鲜技术的研发，开发出安全、高效、低廉的芒果保鲜技术，对产业发展具有重要意义。
碳量子点(carbon dots, CDs)，是一种尺寸小于10 nm的碳纳米颗粒，与传统半导体量子点不同的是，它不会引起环境、健康及生物毒性问题[8]。碳量子点光学性质稳定，且表面富含多种官能团(如：羧基、羟基和羰基等)，易于实现表面功能化，从而使其具有一定的化学特性[9-11]。碳量子点具有良好的水溶性，优异的生物相容性，低毒性，出色的光稳定性和高量子产率，已经广泛应用于生物成像、化学传感和光催化等诸多领域[12]。目前，已有研究者利用光催化技术催化降解果蔬储藏期间产生的乙烯，并通过光催化作用达到抑制果肉褐变的目的[13-14]。但是将碳量子点应用于水果保鲜上的研究，尚未有所报道。碳量子点，除了在光催化、生物成像等领域已经得到广泛应用之外，也有研究者将碳量子点进行掺杂化学改性，而改性的碳量子点在微生物抑菌、杀菌方面表现出较大优势[15-16]。
此研究中，我们选择以海带作为碳量子点的合成材料，与天然大分子多糖，如壳聚糖、柠檬酸、抗坏血酸和CaCl2等材料进行复配，制备成纳米复合涂膜剂用于芒果保鲜，并通过各项指标研究其保鲜效果，以期为芒果保鲜提供新的技术方法与思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
芒果，由云南省农业科学院农产品加工研究所提供，大小均匀、成熟度基本一致，并且表面无损伤、无虫害、未经化学药液处理；海带(市售)，购自附近超市，清水洗净后，备用。
壳聚糖、冰醋酸，均为国产食品级；柠檬酸、抗坏血酸、乙二胺、CaCl2均为分析纯，购自上海麦克林生物科技有限公司；黑曲霉(Aspergillus niger)，由北京北纳创联生物技术研究院提供。
1.2 仪器与设备
SX2-2.5-10高温马弗炉，重庆市松朗电子仪器有限公司；FA1004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；IKA RW 20 digital机械搅拌器，德国IKA集团；HC-3018R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；TU-19型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；pHS-3B酸度计，梅特勒-托利多仪器有限公司；VS-1300型洁净工作台，苏州净化设备有限公司；Tecnai G2 F20型透射电子显微镜，美国FEI公司；D/Max 2200型X射线衍射仪，美国Rigaku公司；Hitachi S-3400N扫描电子显微镜，日本日立公司。
1.3 方法
1.3.1 碳量子点的制备
称取20.0 g洗净的海带，剪碎，加入100 mL去离子水后打碎。然后加入0.5 mL乙二胺混匀，再将其转移到150 mL聚四氟乙烯内衬的反应釜中，置于马弗炉中，在180 ℃下反应6 h。待反应结束后冷却到室温，最后，所得溶液于10 000 r/min条件下离心20 min，接着用0.22 μm滤膜过滤以除去不溶性颗粒，即制得海带碳量子点溶液。
1.3.2 涂膜剂的制备
在弱酸性条件下(100 mL H2O中加0.2 mL冰醋酸)，将涂膜材料——壳聚糖溶解，并根据以下配比制备涂膜剂：涂膜剂Ⅰ，10 g/L壳聚糖；涂膜剂Ⅱ，15 g/L壳聚糖；涂膜剂Ⅲ，2 g/L壳聚糖；涂膜剂Ⅳ，15 g/L壳聚糖+4 g/L CaCl2+4 g/L柠檬酸+5 g/L抗坏血酸；涂膜剂Ⅴ，15 g/L壳聚糖+4 g/L CaCl2+4 g/L柠檬酸+5 g/L抗坏血酸+1.5%(体积分数)海带碳量子点(每100 mL涂膜剂溶液中含1.5 mL碳量子点溶液)；涂膜剂Ⅵ，15 g/L壳聚糖+4 g/L CaCl2+4 g/L柠檬酸+5 g/L抗坏血酸+3.0%(体积分数)海带碳量子点(每100 mL涂膜剂溶液中含3 mL碳量子点溶液)；
以不作处理的为对照组。
1.3.3 保鲜处理与测定方法
芒果经过自来水冲洗，晾干明水后，进行分组，每组50个。首先，将6组芒果分别放入不同的涂膜剂中，浸泡2 min，使涂膜剂均匀覆盖在芒果表面。捞出后，放于通风处自然晾干。将上述处理好的芒果放置于托盘，室温(25℃)下保存。对照组不作处理，直接放置于室温条件下保存。所有上述试验均重复3次。
上述芒果，每组分为2份，第一份30个，每天对其进行称重，并统计其腐烂个数，计算其腐烂率；第二份20个，用于测定分析芒果在储藏期间的生理生化指标情况。主要测定指标：(1)VC含量变化(2,6-二氯酚靛酚滴定法测定)；(2)芒果总糖(手持糖量计测量)和含酸量变化(滴定法测量)；(3)过氧化物酶活性[17]。
1.4 菌种的分离培养和抑菌试验
事先按照文献中方法配制LB培养基[18]和PDA培养基。试验中，以75%酒精、无菌水先后清洗芒果表皮3次，然后以无菌镊子取芒果表皮腐烂的部分，然后以5 mL生理盐水清洗腐烂表皮，此步骤重复3次，最后收集洗脱液(此过程在酒精灯火焰旁操作，防止空气中的微生物污染洗脱液)。
真菌的分离：取100 μL上述洗脱液，使用涂布环均匀接种到LB培养基上(在酒精灯火焰旁操作)，37 ℃倒置培养48 h，观察培养基上细菌和真菌的形态。再使用消毒牙签挑选培养基上的真菌转移到PDA培养基上于28 ℃培养箱中培养，并进行转接、纯化。将此纯化的真菌进行培养，作为真菌对照组Ⅱ。
试验分组：对照组Ⅰ取5 mL上述含菌洗脱液，加1 mL无菌水，混匀备用。试验组Ⅰ取5 mL上述含菌洗脱液，加1 mL碳量子点(2种不同浓度2.5 mg/L和5 mg/L)，混匀备用；试验组Ⅱ取5 mL上述含菌洗脱液，加1 mL15 g/L壳聚糖溶液，混匀备用；试验组Ⅲ取5 mL上述含菌洗脱液，加1 mL15 g/L壳聚糖(含4 g/LCaCl2+4 g/L柠檬酸+5 g/L抗坏血酸)溶液，混匀备用；试验组Ⅳ取5 mL无菌水，加入1 mL碳量子点(浓度为5 mg/L)，混匀备用。
对于实验组Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ以及对照组Ⅰ，分别取100 μL的含菌溶液，使用涂布环接种到LB培养基上，37℃倒置培养48 h后，观察期抑菌效果。肉眼观察菌体生长情况，试验组有菌落生长则为无抑制作用，无菌落生长则为有抑制作用。对于试验组Ⅳ，取100 μL溶液，涂布于经过真菌接种之后的培养基上。观察真菌生长状况。
1.5 孢子萌发率的测定试验
采用孢子萌发法进行碳量子点的抑菌效果研究，在培养皿中间的凹玻片中分别加入50 μL的黑曲霉孢子悬液和50 μL不同浓度的碳量子点溶液，浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5和5 mg/L，28 ℃培养。每个玻片孢子总数为100个，当对照组孢子萌发率为70%～80%时，使用显微镜观察不同碳量子点浓度下孢子的萌发数，并计算孢子萌发抑制率,如公式(1)、(2)所示。
孢子萌发率
(1)
孢子萌发抑制率
(2)
2 结果与分析
2.1 海带碳量子点的表征和芒果表面真菌形态的观察
图1-a为所制备的海带碳量子点的高分辨透射电镜图(TEM)，用于分析碳量子点的形貌和粒径分布。如图所示，海带碳量子点呈球形，尺寸均匀，且分散性好，平均粒径为3.1 nm。图1-a中插图显示，碳量子点的晶格间距为0.23 nm，与石墨烯的晶体结构相对应[19]。研究中，X射线衍射图谱(XRD)也被用于进一步研究海带碳量子点的组成。如图1-b所示，碳量子点在2θ=23.6°出现一个较宽的峰，这与石墨烯的结构相对应[20]。上述结果均表明，海带成功合成了碳量子点。图1-c为芒果表面分离纯化的真菌的扫描电子显微镜(SEM)图。芒果贮藏期病害主要是病原物，主要有曲霉病、炭疽病和蒂腐病等[21]。芒果曲霉病病原菌属于半知菌亚门，分别为黑曲霉和黄曲霉，其中黑曲霉最为常见[22]，通过与黑曲霉真菌形态等相对比，可知芒果表皮分离的真菌是黑曲霉。
a-碳量子点高分辨透射电镜图；b-碳量子点X衍射图谱；c-芒果表面的真菌扫描电子显微镜图；d-碳量子点对黑曲霉孢子萌发的抑制率
图1 碳量子点和芒果表皮上真菌的表征与碳量子点对真菌的抑制效果
Fig.1 Characterization of carbon dots and fungi, and inhibition effect of CDs on fungi
由图1-d可知，随着碳量子点浓度的升高，其对黑曲霉孢子萌发抑制率显著提高。当碳量子点浓度为5 mg/L时，孢子萌发抑制率为82.06%。
2.2 碳量子点的抑菌效果研究
图2-b和2-c所示分别为试验组Ⅰ中2.5 mg/L和5 mg/L的碳量子点的抑菌效果，发现与对照组Ⅰ相比，碳量子点的加入能显著抑制菌落的生长，并且随着浓度的增加，抑菌效果增加。与对照组Ⅰ相比，加1 mL 5 mg/L的碳量子点时，培养基表面已无细菌生长(见图2-c)；而加入1 mL 2.5 mg/L碳量子点时，仍有极个别菌落出现(见图2-b)。图2-d和2-e所示为抑菌研究试验组Ⅱ和试验组Ⅲ结果，发现壳聚糖具有一定的抑菌效果，可能原因是壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑菌作用的结果[23]。试验组Ⅲ的结果，从侧面说明CaCl2、柠檬酸和抗坏血酸的加入，并没有进一步提高抑菌效果。以上结果说明，海带碳量子点能有效限制芒果表面细菌的生长。
图2-f和2-g所示为真菌对照组Ⅱ和试验组Ⅳ的抑菌效果图。在相同条件下，加入5 mg/L的海带碳量子点之后，与对照组Ⅱ相比，抑菌效果明显，PDA培养基上只出现极个别菌落。此结果表明，海带碳量子点对芒果表面分离出的真菌有明显的抑制作用。
a-取自芒果表面的细菌培养结果(对照组Ⅰ)；b和c-碳量子点的抑菌效果图(试验组Ⅰ)；d和e-不同涂膜剂的抑菌效果图(试验组Ⅱ和试验组Ⅲ)；f-芒果表面真菌培养结果(对照组Ⅱ)；g-碳量子点对真菌的抑菌效果图(试验组Ⅳ)
图2 碳量子点的抑菌效果研究
Fig.2 Study on the antibacterial effect of CDs
2.3 涂膜剂对芒果理化指标的影响
2.3.1 不同涂膜剂对芒果失水率的影响
芒果水分的散失，会造成其表皮干瘪。由图3可知，经过不同的涂膜剂处理之后，会显著降低芒果的失水率。在室温保存8 d后，对照组芒果水分损失高达13.30%，而试验组中芒果水分损失最大也只有8.91%。保存18 d之后，试验组(涂膜剂Ⅴ)的芒果几乎无皱纹出现，而对照组芒果已出现明显褶皱且腐烂。结果表明，随着壳聚糖含量的增加，在一定程度上，保水效果也逐渐增加。但壳聚糖含量的增加，也会导致涂膜剂的黏度增加，涂层也变厚，涂布效果较差，不利于实际操作。在放置多天之后，2.0%壳聚糖含量的涂膜剂涂层变脆，轻微碰撞之后涂层即破损并出现裂纹。故研究中选择1.5%的壳聚糖作为成膜材料。
图3 不同涂膜剂对芒果失水率的影响
Fig.3 Effect of different coatings on water-loss rate of mango
2.3.2 不同涂膜剂对芒果腐烂率的影响
芒果本身属于呼吸跃变型水果，再加上其生长在高温高湿的环境中，易于受到微生物、细菌等的侵扰，造成芒果不易储存，易于腐烂。试验中，我们分别用上述5种涂膜剂处理芒果。由图4可以看出，在放置20 d后，经过复配涂膜剂处理的试验组(腐烂率12.1%～22.3%)芒果腐烂率明显低于未经处理的对照组(腐烂率73%)。
图4 不同涂膜剂对芒果腐烂率的影响
Fig.4 Effect of different coatings on rotting rate of mango
涂膜剂Ⅰ和涂膜剂Ⅲ处理10 d之后芒果保鲜结果表明，单独使用壳聚糖作为涂膜剂会出现褐变现象。与之相反，其他复配涂膜剂涂膜的试验组芒果则没有出现褐变。其原因可能是，CaCl2、柠檬酸和抗坏血酸的加入，能有效防止褐变产生[5, 24]。到第20天时，涂膜剂Ⅳ试验组腐烂率为22.3%，而涂膜剂Ⅴ和涂膜剂Ⅵ试验组在20 d后腐烂率才达到12.1%～13.4%。结果表明，加入少量碳量子点后，即能显著提高涂膜剂的保鲜效果。其原因可能是，碳量子点具有一定的抑菌、杀菌作用，能抑制或杀灭芒果表面可能存在的细菌等，从而降低芒果的腐烂率[14-15]。
2.3.3 VC含量的变化
贮藏期间，芒果中VC的含量，会随着时间的增长逐渐出现下降的趋势。由图5可知，经过不同涂膜剂处理的芒果，VC含量明显高于对照组。原因可能是，经过涂膜剂处理过后的芒果，表面会形成一层膜，在膜内层会形成低氧气、高二氧化碳浓度的环境，可以有效降低VC的氧化速度[25-26]。但单独使用壳聚糖作为涂膜材料时，与其他试验组相比，芒果中VC含量下降稍快。第8天时，涂膜剂Ⅱ试验组中VC含量为43.16 mg/100 g，涂膜剂Ⅳ试验组中VC含量为47.32 mg/100 g，而涂膜剂Ⅴ试验组中维生素含量最高，含量为54.22 mg/100 g。此结果说明，在壳聚糖成膜材料中复配少量碳量子点后，能进一步减缓芒果VC含量的降低。其原因可能是：一方面，通过在涂膜剂中加入抗坏血酸、柠檬酸和CaCl2，能有效抑制芒果的褐变反应，降低芒果中抗坏血酸的氧化[5, 22]；另一方面，可能是海带碳量子点具有一定的抑菌、杀菌作用，通过抑制或杀菌作用，降低细菌代谢产物的产生，最终达到延缓VC氧化的目的。
图5 不同涂膜剂对芒果中VC含量的影响
Fig.5 Effect of different coatings on VCcontent in mango
2.3.4 芒果中总糖和含酸量的变化
芒果的呼吸作用会消耗总糖和酸，其含量的变化速度也可用来反映呼吸作用的强弱。芒果采后的贮藏期间，总糖含量首先会明显上升，达到一定峰值后会逐渐降低并趋于平稳。由图6可知，对照组在第4天总糖即达到峰值，而涂膜剂处理后，在第5天或6天总糖才到达峰值。相对来讲，涂膜剂Ⅴ和涂膜剂Ⅵ试验组中，芒果总糖达到峰值的时间比其他组稍慢，达到峰值后下降的趋势也相对缓和，保鲜效果最好。此外，由图7可以看出，在第8天时，涂膜剂Ⅱ、涂膜剂Ⅳ、涂膜剂Ⅴ和涂膜剂Ⅵ试验组含酸量，分别为0.38、0.48、1.39和0.53 g/100 g，对照组芒果含酸量仅为0.17 g，差异显著。酸度以柠檬酸计，每100 g样品。结果表明，涂膜剂能有效降低或延缓芒果中酸的转化与降解过程。
图6 不同涂膜剂对芒果中总糖含量的影响
Fig.6 Effect of different coatings on total sugar content in mango
图7 不同涂膜剂对芒果中酸含量的影响
Fig.7 Effect of different coatings on acid content in mango
2.3.5 过氧化物酶活性的变化
芒果在呼吸跃变之前，组织中存在许多酶抑制剂，酶活性的变化与呼吸作用密切相关。但芒果成熟后，组织中的酶抑制剂会逐渐失活，酶活性则会增加，最终会加快芒果的成熟。如图8所示，对照组芒果中过氧化物酶活性变化最大，而经过不同涂膜剂处理后，均能在一定程度上抑制过氧化酶的活性。
图8 不同涂膜剂对芒果中过氧化物酶活性的影响
Fig.8 Effect of different coatings on peroxidase activity in mango
3 结论
本研究利用天然高分子多糖物质—壳聚糖为涂膜材料，和天然绿色的海带为碳量子点合成原料，先通过水热法制备海带碳量子点，然后再将少量碳量子点与柠檬酸、抗坏血酸和CaCl2等材料进行复配，制备出了碳量子点/壳聚糖涂膜剂。该涂膜剂能有效降低芒果的腐烂率和失水率，抑制了VC、酸和总糖含量的下降，延缓了芒果的后熟过程，最重要的是合成的海带碳量子点，能够有效抑制芒果表面的细菌和真菌的生长。并且，该种纳米乳涂膜剂制备简单、原料易得、无毒无害、天然绿色，对环境无污染，具有良好的保鲜效果。将无毒无害的碳量子点作为复配材料，应用于果蔬涂膜保鲜材料，具有很大的发展潜力。
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