鱼露又叫鱼酱油或虾酱油，主要是以低价值的鱼虾类(如沙丁鱼、鯷鱼、小虾等)或水产品加工副产物(鱼头、鱼内脏、虾头等)为原料，与食盐按照一定的比例混合，通过原料中自身内源酶和微生物的共同作用，经过长时间(6～12月甚至更长时间)发酵后得到的一种调味品[1-3]。鱼露滋味鲜美、香气浓郁、营养丰富，富含人体所必需的8种氨基酸、生物活性肽和牛磺酸，还含有矿物质元素及多种维生素，深受国内外人民的喜爱[4-5]。

目前生产鱼露所使用的发酵方法主要有3种：传统发酵法、快速发酵法和复合发酵法。传统发酵法生产的鱼露色泽红亮、风味浓郁，缺点在于生产周期长、含盐量高[6]。针对传统发酵法的弊端，快速发酵法逐渐成为鱼露生产技术的研究热点。一些学者研究了保温发酵[7]、外加酶发酵[8]、加曲发酵[9]等方法，可以缩短鱼露的生产周期，同时降低产品盐度。快速发酵得到的产品，由于发酵时间不足，其风味远低于传统法生产的鱼露，因此近些年多采用传统发酵与快速发酵结合的方法[10]。白政泽等[11]以秋刀鱼为原料，采用加曲和保温复合发酵法生产鱼露，所得产品富有鱼露特殊香气，能达到商品要求，并且大大缩短了发酵周期。张雪花等[12]采用复合发酵法，以鲢鱼及其加工副产物为原料，添加不同的酱油曲作为种曲，大大缩短了发酵时间，得到了风味良好的鱼露。目前国内外关于鱼露的研究多集中在制备工艺和品质优化，而关于鱼露中鲜味物质含量和组成的研究鲜有报道。

远东拟沙丁鱼(Sardinops sagax)，又名斑点莎脑鱼，价格低廉且资源丰富，年捕捞量达500万t左右，通常加工为饲料，其资源并未得到充分利用[13]。本文以远东拟沙丁鱼为原料，通过传统发酵法、快速发酵法和复合发酵法制备鱼露，采用感官评价和理化指标来分析3种发酵鱼露中鲜味物质的差异，以期为改进鱼露的生产技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

远东拟沙丁鱼(Sardinops sagax)，购于广东省茂名市博贺港，选择平均体长15～18 cm的沙丁鱼，置于加冰的密封泡沫箱中运至实验室，然后分装保存于-20℃备用。食盐(食品级)，市售；面粉、豆粕，广东正大康地有限公司；米曲霉AS3.951，购于中国微生物菌种保藏中心；风味蛋白酶，广西南宁东恒华道生物科技有限责任公司；甲醇、乙腈，均为色谱纯；核苷酸标准品(IMP、GMP、ATP、ADP、AMP、HxR、Hx，纯度≥99.0%)，美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

BSC-250型恒温培养箱，上海博讯实业有限公司；L-8900型氨基酸分析仪，日本Hitachi公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；LS-50LD型蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；自动凯氏定氮仪，德国Thermo公司；PB-10型酸度计，德国SartoriuS公司；CF16RX型高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；MBL50型高速均质机，上海默格机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 豆粕大曲制备

参照FENG等[14]的方法，稍作改动。取米曲霉AS3.951接种于豆汁斜面培养基上，置于30 ℃的恒温培养箱中培养3 d，待菌种活化至斜面长满绿色孢子后，取出备用。将60 g豆粕，15 g面粉和55 mL的水混合均匀，装入三角培养瓶中，于121℃灭菌30 min，然后冷却至40 ℃以下。将米曲霉接种于三角培养基中，摇匀后置于30 ℃的恒温培养箱中培养16 h，待菌体长出后摇动培养基，再次培养24 h，直至菌种长满曲料。

1.2.2 鱼露制备工艺

本研究分别采用传统发酵法(traditional fermentation，TF)、快速发酵法(rapid fermentation，RF)和复合发酵法(compound fermentation，CF)制备远东拟沙丁鱼鱼露，主要步骤如下：

(1)传统发酵法

鱼露由广东省惠州大亚湾东泳鱼露厂有限公司提供。冷冻沙丁鱼先经过解冻、清洗，沥干水分后添加质量分数为25%的食盐混合均匀，于(30±5)℃温度下自然发酵12个月，发酵期间每隔2 d搅拌1次。发酵结束后将发酵液搅拌混匀，用定性滤纸过滤，取滤液保存于4℃备用。

(2)快速发酵法

参照XU等[15]的方法，稍作改动。沙丁鱼解冻、清洗并沥干水分，先通过绞肉机粉碎成小块，然后按m(沙丁鱼)∶m(水)=1∶0.6加入蒸馏水混合，经均质机粉碎成肉糜。按鱼体重的0.2%加入风味蛋白酶，于50℃下搅拌酶解6 h，然后85℃灭酶20min。肉糜冷却至30 ℃以下，然后按一定比例与豆粕大曲(m(沙丁鱼)∶m(豆粕大曲)=1∶0.2)混合，于40 ℃静置30min，然后按照混合物质量的10%加入食盐，混合均匀后置于35 ℃的恒温培养箱，静置发酵30 d，发酵期间每隔2 d搅拌1次。发酵结束后将发酵液先用200目纱布过滤，然后用定性滤纸过滤，取滤液保存于4℃备用。

(3)复合发酵法

参照JOUNG等[16]的方法，稍作改动。将冷冻沙丁鱼先解冻、清洗、沥水，用绞肉机切成小块，然后按照一定比例m(沙丁鱼)∶m(蒸馏水)∶m(食盐)=1∶0.5∶0.2添加蒸馏水和食盐，用均质机粉碎成肉糜，然后按一定比例与豆粕大曲m(沙丁鱼)∶m(豆粕大曲)∶m(食盐)=1∶0.2混合，于40 ℃静置30 min。混合物装于发酵罐中，于(30±5)℃温度下自然发酵210 d，发酵期间每隔2 d搅拌1次。自然发酵结束后，发酵罐转移至45℃的恒温培养箱，继续保温发酵15 d。发酵结束后将发酵液先用200目纱布过滤，然后用定性滤纸过滤，取滤液保存于4 ℃备用。

1.2.3 样品调配

3种发酵鱼露含水质量分数分别为：TF (67.54±1.35)%，RF (83.27±2.51)%，CF(78.86±1.09)%。由于样品间的水分含量差异较大，无法直接比较三者鲜味物质的差异，因此以含水量最高的RF为基准，将其他2种鱼露稀释至水分含量为83.27%。调配好的样品储存于4 ℃备用。

1.2.4 感官评价

鱼露的感官评价参考JIANG等[17]的方法，采用定量描述分析法。感官评价前，3种鱼露置于60℃恒温水浴加热10 min，然后稀释10倍并用统一的容器盛装50 g，随机取样进行感官评价。感官评定小组由12人组成(6男6女，年龄20～25岁)，根据感官评定标准(表1)，先多次对风味描述进行统一认定和培训，然后对每个样品的风味特征(鲜味，咸味，腥异味，香味，醇厚感，后味)进行评分，每项总分为10分，逐项评分后取平均值。在评价前12 h，禁止评价员吸烟、饮酒，吃刺激性食物。

1.2.5 总氮含量的测定

总氮的测定参照GB/T 5009.5—85中凯氏定氮法。

1.2.6 氨基态氮含量测定

氨基态氮含量的测定参考NILSANG等[18]的方法。

1.2.7 小分子肽含量的测定

小分子肽含量的测定参考JANG等[19]的方法。

1.2.8 游离氨基酸测定

鱼露中游离氨基酸含量的测定参考李锐等[20]的方法。

1.2.9 呈味核苷酸测定

呈味核苷酸含量的测定参考李锐等[20]的方法。

1.2.10 味精当量的测定

味精当量(equivalent umami concentration，EUC)的测定参考YAMAGUCHI等[21]的方法。

1.2.11 滋味强度值的测定

滋味强度值(taste activity value，TAV)的测定参考YAMAGUCHI等[21]的方法。

1.3 数据处理

实验结果用平均值±标准偏差表示(n=3)，使用Origin 8.0和SPSS 22.0 软件进行作图和数据分析。

2 结果与分析

2.1 三种远东拟沙丁鱼鱼露的感官评价

通过鲜味、咸味、腥异味、香味、醇厚感和后味5个方面来评价3种鱼露的感官特征，结果如图1所示。

据报道，咸味和鲜味是鱼露呈味的主体。鱼露中的咸味物质以NaCl主，而鲜味主要来自于发酵过程中产生的鲜味和甜味氨基酸。此外，谷氨酸与呈味核苷酸及其钠盐的协同作用，以及小分子肽的增鲜作用，对鱼露中的鲜味均有一定影响[22]。结果表明，不同发酵方法制备的鱼露整体呈味特征都以鲜咸味为主。TF在鲜味、醇厚感和后味这3个方面要优于其他2种鱼露，其香味和腥异味的评分要稍弱于CF，而咸味的评分最低，可能是由于在发酵过程中添加大量食盐导致最终产品咸味过重。有研究表明，发酵过程中高盐浓度虽然抑制了鱼自身蛋白酶活性，延长了发酵时间，但有利于嗜盐和耐盐微生物产生风味物质，且发酵时间越长，风味越好[23]。RF在生产过程中通过酶解和加曲的方法，加速蛋白分解从而大大缩短了发酵周期，同时降低了产品的含盐量，咸味的评分要高于其他2种鱼露，但其他5种感官特征评分均为最低，风味整体较差。CF在香味和腥异味的评分最高，鲜味和醇厚感稍弱于TF，而在后味和咸味的评分较低。CF整体风味要优于RF，但在鲜味和后味与TF尚有一定差距。

2.2 三种远东拟沙丁鱼鱼露中总氮、氨基态氮和小分子肽的含量

鱼露中总氮、氨基态氮和小分子肽含量是影响产品整体滋味和口感的重要因素。总可溶性氮含量是评判鱼露质量好坏的重要参考标准，其主要来源于小分子肽、游离氨基酸等蛋白类氮以及尿素、三甲胺、二甲胺等非蛋白类氮[17]。如图2所示，根据鱼露的商业标准SB/T 10324—1999，3种鱼露产品均达到鱼露的商业一级标准。其中RF的总氮含量最高，为3.54 g/100 g，其次为TF(2.98 g/100 g)，CF的含量最低(2.38 g/100 g)。鱼露中的氨基态氮用来反映产品中小分子肽和氨基酸总体水平的重要指标，其含量对于产品的风味层次和醇厚感有重要影响[24]。小分子肽是一种分子质量介于氨基酸与蛋白质之间的物质，其鲜味要弱于氨基酸，能与其他呈味物质相互协调赋予食物可口的味觉和令人愉悦的后味，如Glu-Glu与IMP有协同效应[25-26]。

由图2可知，在3种鱼露中，TF中氨基态氮和小分子肽的含量最高，分别为0.94、1.43 g/100 g。RF中的总氮含量最高，但其氨基态氮(0.45 g/100 g)和小分子肽(0.77 g/100 g)的含量要低于其他2种鱼露，CF介于2种鱼露之间，含量分别为0.87、1.12 g/100 g。根据前人的报道，鱼露中氨基酸的代谢过程与发酵过程中微生物活动密切相关。发酵液中大多数耐盐酵母菌、耐盐乳酸菌和醋酸菌等都有脱氨和脱羧作用[23]。在微生物的作用下，鱼体中蛋白质被降解，氨基酸和小分子肽的含量随着发酵时间延长而增加。TF在生产过程中蛋白得以充分降解，能积累大量鲜味物质，产品风味浓郁。CF由于发酵时间不足，鲜味物质含量要稍低于传统发酵产品。而RF通过加曲和酶解的方法可以达到更高的总氮含量，但其中对呈味有重要作用的氨基态氮和小分子肽的含量并没有得到显著提升，这与感官评价的分析结果相一致。

2.3 三种远东拟沙丁鱼鱼露中游离氨基酸的含量

游离氨基酸是鱼露中鲜味物质的重要组成部分，也是评价其营养价值的重要标准，同时能与食品体系中的其他成分协同，影响其整体风味。在食品体系中，游离氨基酸的呈味特性与其含量、阈值密切相关。氨基酸中有一些能呈现特殊鲜味和甜味的L型天然氨基酸，如谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)，其中谷氨酸一钠(MSG)是鲜味物质的典型代表[27]。除此之外，苯丙氨酸和酪氨酸具有特殊的鲜甜味，对鱼露的整体鲜味也有重要作用。

3种发酵鱼露中游离氨基酸含量如表2所示。TF中游离氨基酸总量最高(108 695.08 mg/kg)，其次为CF(84 521.13 mg/kg)，而RF中总量最低(67 893.44 mg/kg)。根据GAO等[28]对不同游离氨基酸的呈味特性进行分类， 3种发酵鱼露中，TF中鲜甜味氨基酸的比例最高，占总量的48.2%，这可能是其风味要优于其他两种鱼露的主要原因。在RF中，必须氨基酸的比例要高于其他2种产品，占总量的43.04 %，营养价值最高。在TF中，谷氨酸对整体的滋味贡献最大，TAV值高达57.42，其次为赖氨酸和丙氨酸(26.46和17.35)。在RF中，苦味氨基酸的比例为47.44%，而鲜甜味氨基酸的比例仅为22.31%，对其滋味贡献最大的氨基酸为精氨酸，TAV值为17.57，其次为谷氨酸(15.07)。RF中苦味氨基酸比例过高，是造成其风味较差的重要原因。在CF中，鲜甜味氨基酸的比例为34.53%，苦味氨基酸比例为31.52%，对其滋味贡献最大的氨基酸为精氨酸，TAV值为31.17，其次为谷氨酸(28.40)。精氨酸是略带苦味的氨基酸，在较低浓度时与其他氨基酸相互协调，可以增加产品的醇厚感，但浓度过高，会产生苦味[29]。由这些结果可知，在传统发酵过程中，鱼露能积累较多的鲜甜味氨基酸，形成鲜美醇厚的滋味。而快速发酵法虽然能加速蛋白的水解，但同时产生较多的苦味氨基酸，影响鱼露的产品风味。复合发酵产品中鲜甜味氨基酸与苦味氨基酸含量基本持平，其风味较协调。

注：鲜味氨基酸包括天门冬氨酸、谷氨酸；甜味氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸；必需氨基酸包括赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸；(+)为表示味道令人愉悦，(-)为表示味道不好。下同。

2.4 三种远东拟沙丁鱼鱼露中呈味核苷酸及其关联化合物的含量

核苷酸及其关联化合物是影响鱼露中鲜味的另一关键成分。一般认为，鸟苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)具有突出的鲜味，是食品工业中常用的鲜味剂[27]。其中IMP具有呈味力强，呈味丰富等特点，一般认为是鱼露发酵过程中耐盐微生物的核苷酸酶分解作用产生的。AMP具有协调整体滋味的作用，能够压抑苦味增强整体的醇厚感，使食物产生较为柔和的甜味和鲜味。ATP降解得到的一种最终产物——次黄嘌呤会产生苦味，会使产物整体滋味变差[30-31]。

由表3结果可知，CF中核苷酸总量最高，为796.64 mg/kg，其次是TF，含量为775.82 mg/kg，而RF中含量最低，为579.86 mg/kg。与鲜味有着密切联系的核苷酸有GMP、IMP和AMP，鱼露中GMP对风味贡献最高，其中TF和CF中GMP的TAV值大于1，分别为1.71和2.64，对产品的鲜味有贡献作用。研究表明，鱼露中核苷酸的含量与自身降解作用以及微生物的次级代谢活动密切相关。据报道，在鱼虾贝等生物体内，ATP的降解存在两条途径[32]：(1)ATP→ADP→AMP→ADR→HxR →Hx；(2)ATP→ADP→ AMP→IMP→HxR→Hx。核苷酸的降解途径以及降解程度对其含量和组成有较大影响。有研究表明，在鱼露发酵中后期，耐盐微生物在胞内积累大量的小分子极性物质，如甘油、单糖、氨基酸、核苷酸及它们的衍生物作为渗透调节物质，帮助细胞从高盐环境中获取水分[2]。这些次级代谢产物的积累，能促进鱼露风味的形成。伍蓉莉等[33]从鱼露中分离出1株表皮葡萄球菌和4株嗜盐四联球菌，这些细菌具有产生核苷酸的能力。UCHIDA等[34]研究发现，鱼露发酵过程中微生物的生物合成途径能产生核苷酸，高盐环境和延长发酵时间有助于鱼露积累更多的核苷酸物质。发酵过程中含盐量和发酵时间的不同，可能是造成3种发酵鱼露中核苷酸含量差异的原因。

注：ND表示无检出。

2.5 三种远东拟沙丁鱼鱼露中的味精当量

呈味核苷酸与鲜味氨基酸之间存在协同作用，相当于一定浓度的味精所产生的鲜味强度，这种分析方法广泛应用于食品鲜味特征的研究中。有报道指出，IMP可以与甜味氨基酸(丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸)产生协同作用，使鲜味增强，甜味抑制剂也不能阻止这种效应[21]。EUC值是基于游离氨基酸与呈味核苷酸之间相互作用，并以此进行大量的感官试验后得到的综合滋味评价指标，在食品领域得到广泛应用和认可。3种发酵鱼露中EUC值如图3所示，其EUC值均在10 g MSG/100 g以上，而TF中EUC值最高，为33.42 g MSG/100 g，其次为CF中EUC值为18.96 g MSG/100 g，RF中EUC值最低，为10.12 g MSG/100 g。味精的阈值仅为 3×10 -4 g/mL，TF中EUC分别为RF和CF的3.3倍和1.76倍，因此TF的鲜味程度远高于其他2种鱼露。

3 结论

鲜味是鱼露质量的重要参考标准之一。本实验对传统发酵法、快速发酵法和复合发酵法3种工艺生产的鱼露中鲜味物质进行比较分析，结果表明，3种鱼露的感官特征均以鲜咸味为主，其中TF在鲜味、醇厚感和后味的评分最高。3种鱼露总氮含量均达到鱼露商业一级标准，其中RF的总氮含量最高，而TF中氨基态氮和小分子肽的含量高于其他两种鱼露。TF中鲜甜味氨基酸的比例最高，占总量的48.2%。TF中鲜甜味氨基酸的比例最高，占总量的48.2%，其中谷氨酸对其整体的滋味贡献最大，TAV值高达57.42，而RF和CF的鱼露中精氨酸TAV值最高，分别为17.57和31.17。核苷酸中GMP对鱼露滋味有重要影响，其中TF和CF中GMP的TAV值大于1，分别为1.71和2.64。3种鱼露的EUC值均在10 g MSG/100 g以上，TF中EUC值最高，为33.42 g MSG/100 g。

快速发酵鱼露在风味方面远远不如传统发酵法，复合发酵法兼顾了传统发酵和快速发酵的优点，但在总体风味上与传统发酵鱼露尚有一定差距。低盐化、风味化是今后鱼露生产的发展趋势，采取相关有效措施改良速酿工艺，筛选产蛋白酶活力高、发酵产物鲜味醇厚、香味浓郁的菌种，优选多种发酵方法相结合，将会成为研究鱼露发酵的新方向。

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Umami substances comparison of Sardinops sagaxp fish sauces prepared by three fermentation processes

LI Rui1, ZHANG Hailing2, LI Xuyan1, SUN Yulin1, LI Xinghua3, LI Xiang3*

1(School of Life Science and Technology, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China) 2(College of food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China) 3(Sichuan Tourism University, Chengdu 610100, China)

Abstract The effects of three fermentation methods on umami substances of fish sauces were investigated. Sardinops sagaxp fish was used to prepare fish sauces by traditional fermentation (TF), rapid fermentation (RF) and mixed fermentation (CF) methods, respectively. Umami substances of fish sauces were analyzed by sensory evaluation and physicochemical characteristics. The results indicated that the main sensory characteristics of three fish sauces were umami and saline taste. The overall flavor of fish sauces made by TF was better than others. The total nitrogen content of three fish sauces met the commercial standard. The total nitrogen content of RF was the highest. The contents of amino nitrogen and small molecular peptides in TF were the highest. The proportion of umami and sweet amino acids in TF was the highest, accounting for 48.2% of the total amount. In TF fish sauce, glutamic acid made the largest contribution to the overall taste and its taste activity value (TAV) reached 57.42. In RF and CF fish sauces, arginine made the largest contribution to the overall taste, and the TAV reached 17.57 and 31.17, respectively. Among nucleotides, GMP played an important role in the taste of fish sauces. In TF and CF, TAV values of GMP were more than 1, and reached 1.71 and 2.64, respectively. Equivalent umami concentration (EUC) of three fish sauces were more than 10 g MSG/100 g, and EUC of TF (33.42 g MSG/100 g) was the highest. This study provided a theoretical basis for the optimization of fish sauce production process.

Key words Sardinops sagaxp; fish sauce; fermentation; umami substance

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.021390

第一作者：硕士，讲师(李想教授为通讯作者，E-mail:578180838@qq.com)。

基金项目：国家自然科学青年基金(31801148);广东省教育厅特色创新项目(2018KTSCX127)；广东省自然科学基金(2017A0 30307029)；湛江市科技计划项目(2017A03023)

收稿日期：2019-06-18，改回日期：2019-08-04