植物中含有的多酚等活性成分由于其安全、生理活性优良等特点[1],在食品及化妆品中应用渐广,其提取分离技术也随之发展成为研究热点。不同种类果蔬所含多酚的稳定性具有一定差异,近年来有研究证实紫甘薯中花色苷较稳定[2],耐光耐热性能优于苹果、草莓中花色苷[3]。紫甘薯肉色呈紫色,富含多酚化合物,具有良好的保健功效[4]。多酚在植物内的存在形式通常有游离酚和结合酚2种[5],游离酚对水和有机溶剂有良好溶解性,与基质中其他大分子不发生互作,结合酚难萃取,是与基质中其他物质发生互作的多酚[6]。多酚的存在形式能够影响提取的难易程度,因结合酚难直接萃取,在传统酚类物质提取的研究中易被忽略,这使得多酚提取损失增大。因此对结合酚提取的工艺研究能够为实际生产中多酚的提取提供理论基础,有利于提高多酚提取原料的利用度,降低生产成本。
食品中的结合酚多为多酚与细胞壁、多糖类物质结合形成[7],单采用溶剂萃取无法得到,因此需先经水解使细胞壁等物质与多酚分离后再萃取。现有的水解方式有酸水解法、酶水解法、碱水解法,其中碱水解法为研究最多的结合酚提取方式,酸水解法与酶水解法相对较少[8],但对于上述3种水解方式目前尚未明确哪种最优,关于水解方式对结合酚提取的影响仍需进一步探究。因此本研究通过正交试验法联合响应面法对紫甘薯结合酚的提取工艺进行优化。
山东紫罗兰紫甘薯、河北赤霞珠红葡萄、江西信丰脐橙、乾县红富士苹果、丹东九九草莓(采收时间:前三者为2018年10月、后两者为11月),市售;乙酸乙酯、甲醇,天津北科化学品有限责任公司;HCl、NaOH、Na2HPO4,北京新光化工试剂厂;纤维素酶(10 μg/mg),日本Solarbio;6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶基三嗪(TPTZ),美国Sigma-Aldrich;FeCl3、乙醇、H2SO4、福林酚试剂、Na2CO3,沈阳化学试剂厂;没食子酸、柠檬酸、醋酸钠,上海吉至生化科技有限公司。
FD 5-3型冷冻干燥机,美国SIM公司;GL-25 MS超速高速冷冻离心机,上海盛析仪器设备有限公司;旋转蒸发仪,上海皖宁精密科学仪器有限公司;TU-1800紫外-可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;PHS-25型酸度计,上海仪电科学仪器股份有限公司;AL 204型分析天平,梅勒特-托利多仪器有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅,双捷试验仪器厂;增力电动搅拌器,江苏金城国胜仪器厂。
1.3.1 游离酚及结合酚提取工艺
1.3.1.1 游离酚提取
参考谭畅[9]的方法并稍加修改。将紫甘薯或红葡萄、草莓、橙子、苹果的可食用部分洗净并切为小块薄片,经冻干后粉碎过50目筛。取20 g冻干粉溶于500 mL体积分数为60%的乙醇溶液,在50 ℃中水浴2 h以提取游离酚。于4 000 r/min离心25 min,取上清液并用1 mol/L的NaOH溶液调节pH为7,以体积比1∶1加入乙酸乙酯萃取,45 ℃旋转蒸发萃取液后溶于体积分数为50%的甲醇溶液,再转移至50 mL容量瓶内定容,得游离酚的样品溶液。冻干粉经游离酚提取后,所得残渣干燥(含结合酚)备用。
1.3.1.2 结合酚提取-酸水解法
将1.3.1.1所得残渣以设定液料比加入体积分数为10% H2SO4溶液中,在设定温度水解相应时间后以4 000 r/min离心25 min,萃取及样品溶液制备等步骤与上述游离酚提取相同。
1.3.1.3 结合酚提取-酶水解法
取1.3.1.1中残渣与300 mL质量分数为0.5 %的柠檬酸溶液混合,再加入设定质量的纤维素酶并调节酶解pH值,于设定温度下搅拌酶解,酶解一定时间后静置冷却,以4 000 r/min离心25 min,萃取及样品溶液制备等步骤与上述游离酚提取相同。
1.3.2 游离酚及结合酚提取量测定
参考MUSCI等[10]的方法。从样品溶液中吸取2.5 mL加至25 mL容量瓶定容,并取5 mL定容后样液于试管中,加入0.5 mL福林酚试剂,再加0.5 mL Na2CO3溶液(1 mol/L),混匀后静置1 h,于725 nm测吸光度并以空白调零。样品溶液中多酚浓度以没食子酸(gallic acid equivalents, GAE)为标曲换算[10],表示为毫克没食子酸当量/mL样品溶液(mg GAE/mL),得线性方程:A=5.012C-0.014,R2=0.998 12,方程中为吸光度,为样品溶液多酚浓度。再按下述公式(1)计算游离酚或结合酚提取量,结果表示为毫克没食子酸当量/g干重(mg GAE/g DW):
多酚提取量
(1)
式中:C,多酚质量浓度,mg GAE/mL;25,容量瓶容量,mL;2.5,样品溶液吸取体积,mL;50,样品溶液总体积,mL;20,冻干粉质量,g。
1.3.3 单因素试验设计
1.3.3.1 酸水解法的单因素试验
试验固定条件为:水解时间30 h、液料比30∶1、水解温度55 ℃,保持其余条件不变,分别以水解温度、液料比、水解时间为变量进行单因素试验。考察各因素对酸水解法结合酚提取量的影响。
1.3.3.2 酶水解法的单因素试验
试验固定条件为:酶解时间50 min、酶解温度40 ℃、酶添加量0.8%、酶解pH值4.5,保持其余条件不变,分别以酶解温度、酶解时间、酶添加量、酶解pH值为变量,考察各因素对酶水解法结合酚提取量的影响。
1.3.4 正交试验设计
以单因素试验为基础,选择L9(34)正交表分别对酸水解法和酶水解法进行正交试验设计,2种方法的因素水平表如表1、表2所示。
表1 酸水解法正交试验因素水平表
Table 1 Acid hydrolysis method orthogonal experimentalfactor level table
水平因素A(水解时间) /hB(水解温度) /℃C(液料比)1205520∶12256030∶13306540∶1
表2 酶水解法正交试验因素水平表
Table 2 Enzymatic hydrolysis method orthogonalexperimental factor level table
水平因素A(酶解温度)/℃B(酶解时间)/minC(加酶量)/%D(酶解pH)140500.84.0250601.04.5360701.25.0
1.3.5 响应面法优化-酸水解法
根据单因素试验结果,对酸水解法进行BOX-Behnken Design响应面优化。选取水解时间、水解温度、液料比3因素,以结合酚提取量为响应值进行响应面优化,试验因素水平及编码如表3所示。
表3 响应面试验因素水平及编码
Table 3 Response surface test factor level and coding
编码水平因素A(水解时间) /hB(水解温度) /℃C(液料比)-1205520∶10256030∶11306540∶1
1.3.6 DPPH自由基清除能力测定—DPPH法
参考冯悦等[11]的方法。将Trolox溶于体积分数为50%的甲醇溶液中,取等量的不同浓度Trolox或稀释样品与DPPH溶液混合后于暗处反应30 min,后在517 nm测吸光值。以50%甲醇为空白,Trolox当量(trolox equivalents,TE)计算每克样品干重的DPPH自由基清除能力(mg TE/g DW)。得y(吸光值)和x(Trolox浓度)方程:y=-12.317x+0.074 0,R2=0.987 1。
1.3.7 铁离子抗氧化能力测定-FRAP法
参考SILVA等[12]的方法并稍做修改。试剂均现用现配,将醋酸钠缓冲液(pH 3.6)、TPTZ溶液(含TPTZ 10 mmol/L、HCl 40 mmol/L)、FeCl3溶液(20 mmol/L)以体积比10∶1∶1混合制得FRAP溶液并避光加热至37 ℃。取稀释样品或不同浓度Trolox与FRAP溶液以体积比1∶9混合,于37 ℃下避光保持40 min后在593 nm测吸光值,以体积分数50%甲醇为空白,Trolox为当量(mg TE/g DW),得y(吸光值)和x(Trolox浓度)方程:y=2.285x-340.131 6,R2=0.861 2。
1.3.8 紫甘薯结合酚提取物稳定性试验
1.3.8.1 pH对结合酚稳定性影响
将酸水解法提取的结合酚样品溶液pH用Na2HPO4和柠檬酸调节为1.0、3.0、5.0、7.0,并在65 ℃加热2、4 h时记录颜色、测定300~700 nm的最大吸收波长及对应吸光值。
1.3.8.2 温度对多酚保留率影响
将pH为3.0的样品溶液分别于40、60、80、100 ℃加热5 h,每1 h测定多酚保留量,并按公式(2)计算多酚保留率:
多酚保留率
(2)
1.3.9 数据统计分析
每组数据重复3次,表示为平均数±标准差。采用IBM SPSS Statistics 23进行单因素方差分析(ANOVA)及Turkey检验,显著性水平为P<0.05,Origin 2018 64 Bit和Design-Expert.V8.0.6.1作图。
酸水解法使糖苷键断裂以提取结合酚[13]。图1-A、图1-B、图1-C分别为水解时间、水解温度、液料比等影响因素的单因素试验结果。由图1-A可知,25 h之前随着酸水解法的水解时间延长,结合酚的提取量显著增加(P<0.05),这表明水解时间的延长有利于糖苷键的断裂。在25 h达到最大值后,结合酚提取量稍有降低,这可能是由于加热提取时间过长,释放的结合酚在较高的酸水解温度下降解[14]。由图1-B可知,随着水解温度的逐渐升高,依据扩散原理,温度升高时结合酚提取量应逐渐升高[15],而图1-B中结合酚提取量呈先上升后下降的趋势,这可能与多酚自身性质有关,水解温度升高有利于糖苷键断裂,但温度过高对释放出的结合酚破坏效应更明显[14]。由图1-C可知在液料比20∶1~30∶1,结合酚提取量显著升高,而随着液料比继续增大,过量的溶剂对结合酚提取不显示促进作用,这时结合酚提取量与液料比呈负相关。相似的,李兴武等[16]也发现,溶剂比例过大导致提取茶多酚浓度降低。
A-水解时间;B-水解温度;C-液料比
图1 酸水解法的单因素试验
Fig.1 Single factor experiment of acid hydrolysis
注:不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。下同。
酶水解法一般通过特定的酶水解破坏细胞壁和细胞膜[8]。图2-A、图2-B、图2-C、图2-D分别为酶解温度、酶解时间、酶添加量、酶解pH对结合酚提取量的影响。由图2-A可知,酶解温度50 ℃时结合酚的提取量最高,而其余温度提取量均较低,这表明50 ℃下纤维素酶的活性适中,结合酚的溶出提取效果最好,当温度过低或过高,纤维素酶的活性低,对细胞壁破坏程度不足,结合酚不易于溶出细胞。由图2-B可知,最适酶解时间为60 min。酶解时间越长,细胞壁破坏程度越高,但结果表明,细胞壁破坏程度过高不利于结合酚提取,这可能是由于细胞内容物对结合酚释放有阻碍作用[17],试验现象也表明酶解时间越长,酶解所得溶液越稠。由图2-C,随酶添加量的增加,结合酚提取量呈上升后平缓趋势,由此可见在底物浓度一定时,酶添加量升高有利于纤维素酶解,当酶添加量过多时,则不一定对酶解产生促进作用。由图2-D可知,结合酚提取量随酶解pH升高而逐渐降低。上述现象表明低pH环境更有利于结合酚提取,这可能是由于pH对酶活、多酚的稳定性均有影响[18-19]。
A-酶解温度;B-酶解时间;C-酶解添加量;D-酶解pH值
图2 酶水解法的单因素试验
Fig.2 Single factor experiment of enzymatic hydrolysis
正交试验可得最佳因素水平组合[18]。分别对酸水解法、纤维素酶水解法进行正交试验,对2种方法的结合酚提取效果进行分析,综合评价后选出较优方法进行响应面优化。由表4、表5可知,酸水解法中影响结合酚提取量的主次因素为:C>B>A,最佳组合为A3B2C2,对应的实际结合酚提取量为2.593 mg/g;酶水解法中影响的主次因素为: D>A>B>C,最佳组合为A2B3C3D1,对应的实际结合酚提取量为1.987 mg/g。正交试验中酸水解法结合酚提取量普遍高于酶水解法,这可能是由于酸水解法的酸性条件下多酚更加稳定,而酶水解法时纤维素酶具有专一性使结合酚提取受限[20]。如进行综合考量,酸水解法虽耗时,但具备生产稳定且提取量较高的特点,纤维素酶水解法虽用时短,但提取量较低,生产成本高,酶的回收利用系统不完善[21],因此选择将酸水解法于响应面中进一步优化。
表4 酸水解法正交试验设计结果表
Table 4 Acid hydrolysis method orthogonalexperimental design result table
试验号A(水解时间)B(水解温度)C(液料比)结合酚提取量/(mg GAE·g-1 DW)11111.76821222.58731332.21042122.35052232.00262312.07373132.31183312.01793222.593k12.1882.1431.953k22.1422.3942.510k32.3072.1002.174R0.1650.2940.557优化值A3B2C2
表5 酶水解法正交试验设计结果表
Table 5 Enzymatic hydrolysis method orthogonalexperimental design result table
试验号A(水解时间)B(水解温度)C(液料比)D酶解pH结合酚提取量/(mg GAE·g-1 DW)111111.739212221.761313331.727421321.921522131.879623211.879731231.653833121.532932311.828k11.7421.6751.7171.829k21.811.7381.741.764k31.6711.8111.7671.63R0.1390.1360.050.199优化值A2B3C3D1
2.4.1 Box-Behnken设计(BBD)及响应模型建立
选用BBD设计进行酸水解法试验设计得到表6,建立响应模型,得水解时间(A)、水解温度(B)、液料比(C)和结合酚提取量(响应值Y)的回归方程为:Y=-57.154 38+0.286 03A+1.788 4B+0.115 37C-0.002 12AB+0.000 615AC+0.000 835BC-0.003 15A2-0.014 510B2-0.002 845C2。
表6 BBD试验设计结果表
Table 6 BBD experimental design results table
试验号A(水解时间)B(水解温度)C(液料比)结合酚提取量/(mg GAE·g-1 DW)10112.41720-112.112301-12.07440002.7965-1-102.13261102.4437-1012.33781012.647910-12.439101-102.385110002.811120002.739130-1-11.93614-10-12.25215-1102.402
如表7,P=0.000 7<0.01,模型极显著;失拟项P=0.256 8>0.05,模型残差由随机误差引起;模型可反映95.53%的变化,拟合良好。对于F检验,3个因素对结合酚提取量的影响程度为:C>A>B,方程一次项(A、B、C)和二次项(B2、C2)的P<0.01,对结合酚提取量影响极显著,二次项A2对结合酚提取量影响显著。
表7 回归方程方差分析
Table 7 Regression equation analysis of variance
来源平方和自由度均方F值P值Model0.9990.1134.260.000 6A-水解时间0.07810.07824.330.004 4B-水解温度0.07410.07423.110.004 9C-液料比0.08210.08225.640.003 9AB0.01110.0113.490.120 5AC0.003 78210.003 7821.180.327 6BC0.006 97210.006 9722.170.200 8A20.02310.0237.120.044 4B20.4910.49151.13<0.000 1C20.3010.3092.960.000 2残差0.01650.003 215失拟项0.01330.004 3963.050.256 8纯误差0.002 88620.001 443总和1.0114
2.4.2 响应面分析优化及模型验证
根据回归方程得到响应面图和等高线图,由图3-a、3-b、3-e、3-f可知,随水解时间增加,不同水解温度、液料比下的结合酚提取量均呈升高趋势,这表明水解时间和温度、水解时间和液料比间交互作用均不显著。由图3-c、3-d知,在不同液料比下,结合酚提取量均随水解温度升高,呈先升高后降低的趋势,表明液料比及水解温度间交互作用不显著。
分析得到最佳因素参数为:水解时间28.19 h、水解温度60.5 ℃、液料比32.2,预测得结合酚提取量2.829 mg GEA/g DW,为方便操作设置参数为:水解时间28.15 h、水解温度60.5 ℃、液料比32,实际结合酚提取量(2.784±0.013) mg GEA/g DW,与预测值差1.6%,模型可以较好地进行预测。
a、b-水解温度和水解时间;c、d-水解温度和液料比;e、f-水解时间和液料比
图3 水解时间、水解温度和液料比对结合酚提取量交互作用影响的响应面图和等高线图
Fig.3 Response surface and contour maps of the effects
of hydrolysis time, hydrolysis temperature and liquid-to-liquid ratio on the bound phenolic compounds extraction
紫甘薯多酚可分为游离酚、结合酚[2]。在游离酚提取的基础上,再应用酸水解法工艺提取结合酚,获得总酚(即结合酚、游离酚之和)。因此游离酚量与总酚量的差异可表明酸水解法工艺对多酚提取量的影响,如表8,结合酚酸水解法提取使紫甘薯多酚提取量升高36.5%。相似的,PENG等[13]研究表明酸水解法有助于黑豆的总酚提取。
结合酚的酸水解法提取导致DPPH自由基清除能力、铁离子抗氧化能力分别提高1.16、4.37 mg TE/g DW,这是由于紫甘薯结合酚具有抗氧化性[5]。
表8 紫甘薯游离酚、总酚提取量及其抗氧化性测定结果
Table 8 Determination of free phenolic amount, totalphenolic amount and its antioxidant activity of purplesweet potatoes
指标提取量/(mg GAE·g-1 DW)DPPH值/(mg TE·g-1 DW)FRAP值/(mg TE·g-1 DW)游离酚7.62±0.243.97±0.108.82±0.40总酚10.40±0.155.13±0.2113.19±0.33
注:游离酚提取后,再应用酸水解法进行结合酚提取以得到总酚。表9同。
水果是多酚的主要来源,尤其是浆果类水果(如葡萄、草莓等)的多酚含量更是丰富[22]。为探究酸水解法工艺是否也适用于其他富含多酚的水果,测定酸水解法工艺应用前后多酚提取量及抗氧化性差异,如表9,酸水解法应用后,苹果与草莓多酚提取量升高均小于6%,2种方法所测抗氧化性增加均小于0.15 mg TE/g DW;红葡萄与橙子多酚提取量升高均大于29%,2种抗氧化性增加均大于0.85 mg TE/g DW。上述分析表明,酸水解法结合酚提取工艺在红葡萄与橙子的多酚提取中有一定应用潜力。
表9 水果的游离酚量、总酚量及其抗氧化性测定结果
Table 9 Determination of free phenolic amount, totalphenolic amount and its antioxidant activity of fruits
样品提取量/DPPH值/FRAP值/(mg GAE·g-1 DW)(mg TE·g-1 DW)(mg TE·g-1 DW)苹果游离酚3.79±0.152.77±0.067.12±0.07总酚3.99±0.122.91±0.117.23±0.15草莓游离酚2.13±0.132.18±0.0512.87±0.12总酚2.25±0.272.27±0.1712.91±0.13红葡萄游离酚5.40±0.166.02±0.127.04±0.19总酚7.01±0.317.61±0.158.83±0.27橙子游离酚1.68±0.242.21±0.328.71±0.16总酚2.42±0.133.20±0.239.57±0.33
由表10可知,pH为1.0、3.0的样品经4 h加热后颜色、最大吸收波长均未发生改变,吸光值变化不显著,这表明结合酚在pH为1.0、3.0条件下较稳定。pH为5.0、7.0的样品经加热后最大吸收波长未发生变化,但颜色变浅、吸光度下降显著(P<0.05),这表明pH为5.0、7.0条件下的结合酚较不稳定[14]。出现表中结果的原因可能是紫甘薯多酚物质中绿原酸、花色苷、槲皮素等物质的结构受pH影响而发生改变[23-25],进而对稳定性产生影响。
表10 65 ℃下结合酚在不同pH条件的颜色、最大吸收波长及吸光值
Table 10 Color, maximum absorption wavelengthand absorbance of bound phenolic compounds indifferent pH conditions at 65 ℃
时间/h指标pH1.03.05.07.0颜色深红深红红紫紫0λmax521530540565A0.884a0.772a0.410c0.402c颜色深红深红红紫浅紫2 λmax521530540565A0.884a0.770a0.371b0.161b颜色深红深红浅红紫浅紫4λmax521530540565A0.883a0.769a0.298a0.150a
注:同列数据后不同字母代表差异显著(P<0.05)。
由图4可知,在pH 3.0时加热5 h,结合酚样品在35、55 ℃的多酚保留率在90%以上,随时间变化不显著(P>0.05),结合酚样品能够保持较高稳定性。经75、95 ℃加热处理的多酚保留率随时间延长不断降低,但95 ℃热处理1 h后多酚保留率也在60%以上,这表明结合酚的热稳定性较好[2]。上述现象的原因可能是结合酚在不同温度处理下会得到不同的产物,高温时可能发生降解,生成无色的原儿茶酸、对羟基苯甲酸及间苯三酚甲醛等[26]。
图4 pH 3.0下不同温度对结合酚的多酚保留率影响
Fig.4 Effect of different temperatures on polyphenol retention rate of bound phenolic compounds at pH 3.0
正交试验中酸水解法的结合酚提取量普遍高于纤维素酶水解法。选择酸水解法进行响应面优化,得到最佳参数:水解时间28.15 h、水解温度60.5 ℃、液料比32∶1。实际结合酚提取量(2.784±0.013) mg GAE/g DW,与预测值差1.6%,模型可较好预测。
酸水解法工艺的加用使多酚提取量在单纯的游离酚提取基础上提升36.5%,DPPH自由基清除能力与铁离子抗氧化能力也分别增加1.16、4.37 mg TE/g DW。此外,酸水解法工艺在水果多酚提取中也具有一定的应用潜力。紫甘薯结合酚于65 ℃加热4 h,pH较低时(1.0、3.0)稳定,pH较高时(5.0、7.0)则不稳定;结合酚在pH 3.0加热5 h,多酚保存率在温度较低时(35、55 ℃)保持在90%以上,结合酚有较高稳定性,而温度较高时(75、95 ℃)多酚保留率随时间延长不断降低,结合酚稳定性降低。本研究可以为紫甘薯高附加值的精深加工提供一定理论依据。
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