不同因素对牡蛎酶解液美拉德反应产物的影响

牡蛎作为世界第一大养殖贝类，其肉质鲜美，营养丰富，蛋白质含量高达50.6%(质量分数)，且必需氨基酸种类齐全[1]。近年来，随着天然调味料的发展，以牡蛎为原料，酶解制备天然海鲜调味料引起了研究者的广泛关注。刘海梅等[2]采用Protemax复合蛋白酶水解牡蛎肉，制备了具有强烈鲜美味的酶解液，其鲜味氨基酸含量达436.60 mg/100 mL。姚玉静等[3]选用胰蛋白酶和风味蛋白酶对牡蛎进行深度酶解，也得到了鲜味特征明显的酶解产物，其鲜味氨基酸含量为17.5%，甜味氨基酸含量为30.6%。虽然牡蛎酶解液鲜味显著且营养丰富，但是由于牡蛎本身的腥味，导致其酶解液带有一定的腥臭味，不仅影响了产品的风味，也制约了其在水产调味料中的使用。

美拉德反应(Maillard reaction)是食品体系中游离氨基酸、多肽或蛋白质的氨基与还原糖的羰基之间发生的一种复杂反应，它能赋予食品愉快的香味和诱人的色泽，同时减弱了食品中原有的腥味，目前已成为生产热反应型天然肉味香精香料的主要途径[4]。半胱氨酸(Cysteine，Cys)和硫胺素(Vitamin B1，VB1)作为重要的肉味前体化合物，可与还原糖发生美拉德反应，产生咸味、肉味和酱油样香气,使美拉德反应产物的风味加强[5-6]。探讨肉味前体化合物对牡蛎酶解液美拉德反应产物(Maillard reaction produncts，MRPs)风味的影响，对于改善水产品酶解液的腥味问题制备、肉香风味水产调味料具有重要意义。

本文以牡蛎酶解液为氨基来源，与葡萄糖发生美拉德反应，研究L-Cys质量分数、VB1质量分数、体系初始pH以及反应时间等4个因素对MRPs的影响，优化得到最佳的美拉德反应条件，为牡蛎热反应肉香风味调味料的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)，壳长 10～15 cm：市售；Protemax复合蛋白酶(酶活力 1.5 AU/g)、风味蛋白酶(酶活力500 LAPU/g)：诺维信忆诺联创生物科技(北京)有限公司；葡萄糖：上海市蓝季生物有限公司；L-半胱氨酸盐：南京奥多福尼生物科技有限公司；VB1：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ-2B型组织匀浆捣碎机，金坛市荣华仪器制造有限公司；T6型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 牡蛎酶解液的制备

将太平洋牡蛎外壳冲洗干净后，开壳，取出全部软组织，沥干后称重。取牡蛎肉按照料液比1∶5(质量比)加入蒸馏水，于高速组织捣碎机匀浆。pH 7.0下，添加Protemax复合蛋白酶(30 AU/kg)，于50 ℃下恒温酶解2 h，沸水浴灭酶15 min。冷却至室温后添加风味蛋白酶(10 000 LAPU/kg)，50 ℃下恒温酶解2 h，沸水浴灭酶15 min。酶解产物于5 000 r/min离心15 min，取上清液即为牡蛎酶解液。

1.3.2 MRPs褐变程度和反应中间产物的测定

参考文献方法[7-8]，用紫外可见分光光度计测定294 nm的吸光度值，作为中间产物生成量的指标，测定420 nm的吸光度值表示MRPs的褐变程度，作为晚期褐变聚合物形成的指标。

1.3.3 MRPs的感官评价

感官评定小组由10人(5男5女)组成，根据表1中的评分标准对MRPs进行综合评价，打分后取平均值。

1.3.4 L-Cys质量分数对MRPs的影响

于牡蛎酶解液中添加质量分数为8%的葡萄糖，并加入不同质量分数的L-Cys(0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%)，在pH 7.0下，于100 ℃热反应60 min，冷却，5 000 r/min离心15 min，取上清液测定A420、A294，评价其感官特性。

1.3.5 VB1质量分数对MRPs的影响

于牡蛎酶解液中添加质量分数为8 %的葡萄糖，并加入不同质量分数的VB1(0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%)，反应过程及测定分析指标同1.3.4。

1.3.6 体系初始pH对MRPs的影响

于牡蛎酶解液中添加质量分数为8 %的葡萄糖，0.25%的 L-Cys，0.25%的VB1，分别调节体系pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，反应过程及测定分析指标同1.3.4。

1.3.7 反应时间对MRPs的影响

于牡蛎酶解液中添加质量分数为8 %的葡萄糖，0.25%的L-Cys，0.25%的VB1，调节pH为7.0，在100 ℃下分别加热反应30、60、90、120和150 min，测定分析指标同1.3.4。

采用Excel软件对数据进行分析处理及图表制作。每组实验重复3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1L-Cys质量分数对MRPs的影响

半胱氨酸作为含硫氨基酸，对肉香味化合物的生成具有不可替代的重要作用，但是其在反应中生成的中间体对美拉德反应具有一定的减缓作用。由图1-A可知，随着L-Cys质量分数的增加，美拉德反应体系的褐变程度持续下降，说明L-Cys的添加在一定程度上抑制了MRPs的形成。HUANG等[9]研究发现，Cys对大豆肽-木糖美拉德反应体系颜色的形成也具有显著的抑制作用，与本文结果一致。L-Cys作为含巯基的α-氨基酸，比大部分氨基酸更易被氧化。随着美拉德反应进行，其氧化程度增加，进而影响了吡嗪、呋喃等美拉德反应的主要产物以及其他前体物质的产生[10]。在抑制颜色生成方面，其机理可能有两方面：一是由于Cys含有其独特的亲核基团—SH，可与α, β-不饱和羰基中间产物反应，捕获亲电子的化合物及中间产物，从而阻止褐色终产物的形成[11]；二是Cys通过阻碍加热过程中形成大量的自由基，进而抑制了MRPs的生成[12]。

中间产物生成量和感官评分随L-Cys质量分数增加均呈现先上升后下降的趋势(见图1-A和图1-B)，主要是由于随着质量分数增加，L-Cys在Strecker反应中产生的H2S、NH3和乙醛等活跃的反应中间物的量逐渐上升，进一步反应生成较多的肉香风味化合物[13]。但是，当质量分数高于0.25%时，L-Cys会因热分解产生过多的氨、硫化氢等含硫物质，导致不协调的硫臭味，破坏了肉味香气的形成。结合不同L-Cys质量分数下MRPs感官评分雷达图(图1-C)分析得出，L-Cys的最适质量分数为0.25%。

2.2 VB1对MRPs的影响

VB1是一种重要的肉味前体化合物，很多含硫的肉类风味化合物，如呋喃、呋喃硫醇、噻吩、噻唑等，都可以通过VB1的热降解产生，VB1的热降解也会产生H2S、NH3等美拉德反应的中间物质[14]。由图2-A和图2-B可知，当VB1用量在0%～0.50%时，随着VB1质量分数的增加，美拉德反应产物的感官品质明显提升，反应生成的中间产物量也明显增加，说明VB1质量分数适当时，对整个MRPs风味具有提升和协调作用。当用量在0.50%～1.00%时，感官评分随着VB1质量分数的增加反而降低，中间产物的含量也呈现下降趋势，一方面的原因可能是VB1的降解产物抑制了美拉德反应继续进行，另一方面可能是过量的VB1添加导致H2S、NH3等硫臭味物质产生，掩盖了原来的肉香味[15-16]。

由图2-A可知，当用量在0%～0.75%时美拉德反应体系的色泽随VB1质量分数的增加而减弱，说明VB1在一定浓度内有降低褐变程度的作用。VB1对色泽形成的抑制作用可能与含硫化合物如亚硫酸盐的抑制机制相似，即硫离子通过结合糖基胺的裂解产物从而阻断发色团的生成，抑制高级美拉德反应产物类黑精的形成[17]。当VB1用量在0.75%～1.00%时，褐变程度有所上升，这可能是由于VB1质量分数过大时受热发生降解，噻唑环中C-N及C-S键的断裂，形成了非常重要的硫基酮中间产物―羟甲基硫基酮，由此产生一系列呈色的含硫杂环化合物[18]。结合MRPs的感官评分雷达图(图2-C)分析得出，VB1的最适质量分数为0.50%。

2.3 体系初始pH对牡蛎酶解液美拉德反应效果的影响

体系初始pH对MRPs的影响如图3所示。在pH 4.0～9.0，褐变程度与中间产物的量逐渐增加，感官评分随pH上升呈先增加后降低的趋势(图3-A和图3-B)。由此可见，初始pH值太低或者太高都会影响牡蛎美拉德反应液的整体风味，其原因与不同pH下美拉德反应速率有关。在pH≤7.0时，美拉德反应程度较弱，在强酸性条件下氨基被质子化，阻止了葡基胺的形成，进而阻碍了美拉德反应的进程。当体系呈碱性时，美拉德反应速率提高，氨基氮将严重损失，因此褐变程度和中间产物的量迅速增加，但同时也导致反应液产生的风味变差[19]。另外，在有含硫化合物参与的美拉德反应体系中，偏酸时产生的H2S易逸出体系，偏碱时NH3则易逸出，而当反应体系缺少H2S和NH3时，都不能形成理想的肉香味[20]。结合感官评分(图3-C)分析，体系初始pH值在7.0时，MRPs形成良好的风味，此结果与袁林等[21]的研究结果趋势一致。

2.4 反应时间对MRPs的影响

随着反应时间的延长，反应液中的氨基酸与还原糖不断地发生反应，会形成大量的类黑精色素[22]。由图4可知，在0～120 min随着反应时间的延长，褐变程度、感官评分和中间产物生成量均增加，美拉德反应程度逐渐增大。当反应时间超过120 min后，褐变程度和中间产物生成量继续增加，但是感官评分开始下降，可能是由于过量产生的类黑精经过环化生成一系列吡啶、吡咯等含氮杂环化合物，产生的焦香味和杂气给MRPs带来不良风味[16]。综合感官评分雷达图(图4-C)分析得出，美拉德反应最适宜的时间为120 min。

2.5 美拉德反应条件的正交优化

依据单因素试验结果，设计正交试验L9(34)，优化美拉德反应条件。正交试验的因素水平设计如表2所示，试验结果如表3所示。

由表3可知，对A420而言，4个因素对MRPs影响的大小顺序为C>A>D>B，即体系初始pH>L-Cys质量分数>反应时间>VB1质量分数，由极差分析和各因素平均值可得优化后适宜的反应条件为L-Cys质量分数0.15%，VB1质量分数0.50%，pH 8.0，反应时间130 min；对A294而言，4个因素对MRPs影响的大小顺序为A>D>B>C，即L-Cys质量分数>反应时间>VB1质量分数>体系初始pH，由极差分析和各因素平均值可得优化后适宜的反应条件为L-Cys质量分数0.15%，VB1质量分数0.50%，pH 8.0，反应时间130 min；对感官评分而言，各因素对MRPs影响的大小顺序为A>B>C=D，即L-Cys质量分数>VB1质量分数>体系初始pH=反应时间，由极差分析和各因素平均值可得优化后适宜的反应条件为L-Cys质量分数0.15%，VB1质量分数0.75%，pH 8.0，反应时间为110或120 min。由极差分析可知，VB1质量分数在0.50%和0.75%时的色泽和风味差异不大，考虑到经济成本，选用0.50%的质量分数。综合以上分析，优化得到美拉德反应最佳工艺条件为L-cys质量分数0.15 %、VB1质量分数0.50 %、pH 8.0、反应时间130 min。

2.6 美拉德反应验证试验

在正交优化得出的最佳组合条件下进行美拉德反应，得到的MRPs的A420为0.672，A294为0.853，感官评分为4.67，无腥味且具有良好的肉香味。

3 结论

本文以牡蛎酶解液与葡萄糖建立美拉德反应体系，通过单因素试验比较了L-Cys质量分数、VB1质量分数、体系初始pH和反应时间对MRPs的影响，并利用正交试验L9(34)优化得到最佳的美拉德反应条件为L-Cys质量分数0.15%、VB1质量分数0.50%、体系初始pH为8.0、反应时间130 min。在此条件下，得到的美拉德反应液感官评分最高，无腥味，鲜味浓郁且具有良好的肉香味。本研究为水产品酶解液风味的改善提供了良好的思路，也为新型牡蛎调味品的研究及开发利用提供了参考。

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