酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD),是全球慢性肝病的主要原因,包括从肝脏脂肪变性到酒精性肝炎、纤维化、肝硬化和肝细胞癌发展的一系列肝损伤疾病[1]。随着经济水平的提高和社交活动的增多,全世界范围内尤其发展中国家的人均酒精消耗量逐年上升,国内外酒精性肝病患者也日益增多。而在我国,酒精性肝病已经上升成为仅次于乙型病毒性肝炎的导致肝硬化的第二大病因[2]。因此,探讨酒精性肝病的发病机制及防治措施具有十分重要的意义。酒精性肝损伤的发病机制十分复杂,主要是乙醇及其衍生物乙醛等在代谢过程中直接或间接导致的氧化应激、肠源性内毒素、炎性介质和炎症反应等多种因素相互作用的结果[3-6]。其中,肠道屏障功能受损引起的肠源性内毒素血症及内毒素激活枯否细胞(kupffer cells)在ALD的发生和发展中起着重要的作用[7-8]。
益生菌已被证实具有调节生理活性、维持肠道微生态平衡、降低胆固醇水平、提高抗氧化能力、改善机体免疫功能等多种功能,目前已被广泛应用于发酵乳制品、乳饮料、果汁、婴儿食品以及药品等领域,并得到广大消费者及医疗工作者的认可[9]。已有临床研究表明,酒精性肝损伤患者通过服用益生菌,肠道微生态恢复平衡,肝脏功能得到明显改善[10]。目前虽然已经有许多学者关注到益生菌对慢性酒精性肝损伤的作用,包括Lactobacillus rhamnosus R0011[11]、Lactobacillus plantarum LC27[12]、Bifidobacterium longum LC67[12]、 Lactobacillus rhamnosus CCFM1107[13]、Bifidobacterium animalis subsp. lactis KV9[14]等,但仍主要集中在利用鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)对其机制进行研究,对其他菌株的筛选及方法研究较少。
乳酸菌具有提高免疫力、降低胆固醇、抗氧化、调节肠道菌群等功能[15]。某些乳酸菌可通过减轻氧化应激、调节肠道菌群、改善肠道通透性等方面缓解酒精引起的肝功能损伤[16]。乳杆菌属是目前发酵行业应用较多的一类乳酸菌,包括鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌等近10个种。有研究显示,虽然都属于乳杆菌属,但不同种甚至同一种的乳杆菌其功能也不尽相同[17-18]。本研究选取几株不同种类的乳杆菌,通过小鼠试验研究比较不同乳杆菌对慢性酒精性肝损伤的缓解作用,并探讨其缓解慢性酒精性肝损伤的机制,为相关产品的开发提供依据。其中,植物乳杆菌LP45已被证实具有降低胆固醇、提高免疫力、抑制胃肠道致病菌、调节肠道菌群等功能[19-22]。此外,鼠李糖乳杆菌L519分离自云南传统发酵乳制品,瑞士乳杆菌L551(Lactobacillus helveticus 551,L551)分离自西藏那曲传统奶制品,以及副干酪乳杆菌L577(Lactobacillus paracasei 577,L577),均为具有较好体外性能的潜力菌株。
1.1.1 实验菌株
鼠李糖乳杆菌L519、植物乳杆菌LP45、瑞士乳杆菌L551、副干酪乳杆菌L577,河北一然生物技术有限公司;鼠李糖乳杆菌LGG,美国菌种保藏中心。
1.1.2 实验动物
SPF级C57BL/6小鼠80只,雄性,8周龄,体重18~20 g,上海斯莱克实验动物有限公司。
1.1.3 试剂
蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、无水乙酸钠、NaCl、多聚甲醛、无水乙醇等,国药集团化学试剂有限公司;脱脂乳粉,市售,上海恒天然商贸有限公司;Lieber DeCarli液体饲料,南通特洛菲饲料科技有限公司;葵花牌护肝片,黑龙江葵花药业股份有限公司;丙二醛、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶的测定试剂盒,南京建成生物工程研究所;小鼠内毒素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介1β的ELISA试剂盒,南京森贝伽生物科技有限公司。
SW-CJ-1FD超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;日本TOMY SX-700全自动高压灭菌锅,上海鼎谦生物科技有限公司;PB3002-N电子天平和EL204分析电子天平,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;DGG-9123A电热恒温鼓风干燥箱,上海森信实验仪器有限公司;GRP-9080恒温恒湿培养箱,上海森信实验仪器有限公司;DK-8D电热恒温水槽,上海森信实验仪器有限公司;SCIENTZ-48高通量组织研磨器,宁波新芝生物科技股份有限公司;5424R小型台式高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;UV-2450紫外可见分光光度计,日本岛津制造所;MB100-2A微孔板恒温振荡器,杭州奥盛仪器有限公司;MULTISCAN GO全波长自动酶标仪,美国Thermo fisher公司。
1.3.1 菌株培养及处理
将冻存的4株乳杆菌复苏、活化2代后,接入MRS液体培养基中,37℃培养18 h,在4℃下6 000 r/min离心10 min,弃去上清,所得菌体用灭菌的生理盐水洗涤并离心3次后,以质量分数为12%的脱脂乳作为保护剂,冻干浓缩成菌粉。灌胃小鼠前,用质量分数为0.9%的生理盐水重悬,调整菌液浓度为1.0×109CFU/mL,在37 ℃水浴中复苏30 min后使用。
1.3.2 动物模型的建立
SPF级健康C57BL/6雄性小鼠80只,8周龄,适应性喂养一周后,随机分成8组,每组10只。采用含35%热量酒精(alcohol-fed,AF)或等热量麦芽糊精(pair-fed,PF)的Lieber DeCarli液体饲料饲喂,连续喂养8周[23]。第1组:空白对照组(PF);第2组:酒精模型组(AF);第3组:阳性药物对照组(AF+药);第4组:LGG阳性对照组(AF+LGG);第5组:鼠李糖乳杆菌L519干预组(AF+L519);第6组:植物乳杆菌LP45干预组(AF+LP45);第7组:瑞士乳杆菌L551(AF+L551);第8组:副干酪乳杆菌L577干预组(AF+L577)。第1组,摄食量与第2组等量喂养(以等热量麦芽糊精代替酒精)。第3、4、5、6、7、8组,最后2周添加护肝片溶液或菌悬液。所有样品按照10 mg/kg体重进行灌胃[16]。每天测定小鼠的食物摄入量,每周测定小鼠体重1次。小鼠喂养8周后,禁食12 h,麻醉后摘眼球取血,辅以颈椎脱臼法处死,收集血液和组织样本。
1.3.3 分析方法
1.3.3.1 肝组织病理学观察
取小鼠肝脏左叶同一位置的组织,用质量分数为10%的多聚甲醛溶液固定后,经过石蜡包埋、切片、苏木精和伊红染料染色后,在切片扫描仪下扫片观察。
1.3.3.2 相关生化指标测定
小鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶的活性,均利用全自动血清生化分析仪进行测定。肝匀浆中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和丙二醛的测定,均按照相应试剂盒具体操作说明进行。
1.3.3.3 血清内毒素含量测定
血清中内毒素的含量测定采用酶联免疫分析法,按照ELISA试剂盒说明书进行操作。
1.3.3.4 肝脏炎症因子表达测定
肝脏中炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6的表达水平均采用ELISA试剂盒检测。
1.3.3.5 肠道紧密连接蛋白mRNA表达水平测定
采用Trizol法提取肠道组织中总RNA,然后利用反转录试剂盒进行RNA逆转录,最后对肠道中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表达水平进行实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)分析。
1.3.3.6 统计学分析
所有实验数据均以平均值±均值标准误差(mean±SEM)表示。两组数据间的统计分析采用独立样本T检验,多组数据间的统计分析采用One-Way Aonva单因素方差分析。当P<0.05时,视为组间具有显著差异。
长期大量饮酒导致的慢性酒精性肝损伤,初期通常表现为酒精性脂肪肝。如图1所示,慢性酒精暴露对小鼠肝脏造成了严重的病理损伤。对照组肝细胞结构较完整,有明显的界线且胞浆均匀,有轻微脂肪空洞,无炎性浸润;而造模组脂肪变性明显,有大片的脂肪空洞,肝细胞肿胀变形,有网状结构,出现炎性细胞浸润;乳杆菌干预则有效地缓解了这些病理损伤,表现为脂肪泡减少,炎症细胞浸润减轻。其中,鼠李糖乳杆菌L519、植物乳杆菌LP45和瑞士乳杆菌L551效果较为显著,肝细胞恢复正常,而副干酪乳杆菌L577效果较差,肝细胞仍肿胀变形,存在脂肪空泡。
a-PF组:b-AF组;c-AF+药组;d-AF+LGG组;e-AF+L519组;f-AF+LP45组;g-AF+L551组;h-AF+L577组
图1 乳杆菌对慢性酒精暴露小鼠肝脏组织病理损伤的影响
Fig.1 Effects of Lactobacillus treatment on pathological injury
of liver tissue in mice exposed to chronic alcohol(H&E,×200)
谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)主要存在于肝细胞胞浆内,当肝脏受到损伤时,细胞胞浆内的转氨酶进入血液,导致血液中ALT和AST的含量升高[24]。对小鼠血清中ALT和AST的活性进行分析,结果如图2所示,慢性酒精暴露导致小鼠血清中ALT和AST活性显著升高,且AST的含量大幅上升,明显高于ALT,而乳杆菌干预后可以有效恢复ALT、AST的活性。其中,植物乳杆菌LP45和瑞士乳杆菌L551效果最为显著,表明植物乳杆菌LP45和瑞士乳杆菌L551能够有效抑制慢性酒精肝损伤小鼠血清转氨酶的升高。
a-小鼠血清中ALT变化;b-小鼠血清中AST变化
图2 乳杆菌对慢性酒精暴露小鼠血清中ALT和AST
变化的影响
Fig.2 Effects of Lactobacillus treatment on serum ALT and AST
levels in mice exposed to chronic alcohol
注:# P<0.05表示与PF组比较,具有显著差异;*P<0.05表示与
AF组比较,具有显著差异。
自由基及其诱导的脂质过氧化是造成肝脏组织损伤的重要原因之一。正常情况下,细胞内存在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、过氧化氢酶、和VE等抗氧化剂,可以有效清除自由基,维持体内的抗氧化防御系统平衡[25]。但大量饮酒会破坏这种平衡,诱发氧化应激,导致脂质过氧化,抗氧化物质SOD、GSH等大量消耗,脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)增高,从而导致肝脏发生病变,各种生化指标出现异常[26-27]。对小鼠肝脏中氧化指标进行分析,结果如图3所示,慢性酒精处理后,与对照组相比,酒精模型组小鼠肝脏中MDA浓度明显升高,而GSH含量和SOD活性显著降低。相对于模型组,乳杆菌干预可以有效地降低MDA浓度,并恢复了GSH含量和SOD活性。其中,植物乳杆菌LP45表现最为突出。表明植物乳杆菌LP45能够有效抑制慢性酒精引起的氧化损伤。
a-小鼠肝脏中MDA变化;b-小鼠肝脏中GSH变化;c-小鼠肝脏中SOD变化
图3 乳杆菌对慢性酒精暴露小鼠肝脏中MDA、GSH、SOD变化的影响
Fig.3 Effects of Lactobacillus treatment on liver MDA, SOD and GSH levels in mice exposed to chronic alcohol
内毒素是来自肠道革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)成分,具有十分广泛的生物活性,过量时能够引起严重的炎症反应[28]。研究表明,酒精导致肠道屏障受损,大量肠源性LPS进入肝脏与kupffer细胞结合,引发一系列炎症反应,从而导致肝脏损伤[29]。对小鼠血清中LPS含量进行分析,由图4可知,慢性酒精处理后,酒精模型组小鼠血清中LPS含量明显升高,而乳杆菌摄入后显著降低了LPS含量。同时,本研究使用的Lieber-DeCarli标准型酒精液体模型饲料是一种高脂肪的酒精液体饲料,其中,脂肪热量高达35%[30]。对照液体饲料和酒精液体饲料等热量喂养,因此,长期喂养后对照组可能出现轻微的非酒精性脂肪肝,导致血清中LPS水平略高于正常水平,而乳杆菌摄入后显著降低了LPS水平,甚至恢复略低于对照组的正常水平。表明所选乳杆菌均能够有效抑制慢性酒精引起的血清中LPS含量的升高。
图4 乳杆菌对慢性酒精暴露小鼠血清中LPS变化的影响
Fig.4 Effects of Lactobacillus treatment on serum LPS levels in mice exposed to chronic alcohol
促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)是诱导酒精性肝损伤的关键因素之一,参与肝脏炎症反应、脂肪变性和细胞凋亡过程[31]。对小鼠肝脏中炎症因子含量进行分析,由图5可知,慢性酒精处理后,小鼠肝脏中TNF-α、IL-6、IL-1β含量明显增加,而乳杆菌处理后大大降低了TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。同时,本研究使用的Lieber-DeCarli标准型酒精液体模型饲料,对照组可能出现轻微的非酒精性脂肪肝,对照组可能出现轻微的非酒精性脂肪肝,导致组织中IL-1β和IL-6水平略高于正常水平,而乳杆菌摄入后显著降低了IL-1β和IL-6水平,甚至恢复略低于对照组的正常水平。其中,鼠李糖乳杆菌L519效果最为显著。表明鼠李糖乳杆菌L519能够显著抑制慢性酒精引起的肝脏中炎症因子含量的升高。
紧密连接(tight junction,TJ)是肠黏膜上皮细胞间最重要的连接方式,对维持黏膜上皮细胞极性及调节肠屏障的通透性发挥着重要作用,用以维持机体内环境的稳定[32]。其中,外周蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)、密封蛋白1(claudin-1)、闭合蛋白(occludin)是构成紧密连接的重要成分[33]。对ZO-1、claudin-1、occludin的mRNA表达情况进行分析,由图6可知,慢性酒精处理后,小鼠肠道中ZO-1、claudin-1、occludin的mRNA表达水平明显降低,而乳杆菌处理后得到恢复。其中,鼠李糖乳杆菌L519和植、物乳杆菌LP45效果最为显著。表明鼠李糖乳杆菌L519和植物乳杆菌LP45能够有效改善慢性酒精引起的肠道紧密连接蛋白表达水平的降低。
a-小鼠肝脏中TNF-α变化;b-小鼠肝脏中IL-1β变化;c-小鼠肝脏中IL-6活性变化
图5 乳杆菌对慢性酒精暴露小鼠肝脏中TNF-α, IL-1β, IL-6变化的影响
Fig.5 Effects of Lactobacillus treatment on liver TNF-α, IL-1β, IL-6 levels in mice exposed to chronic alcohol
a-小鼠肠道中ZO-1变化;b-小鼠肠道中claudin-1变化;c-小鼠肠道中Occludin变化
图6 乳杆菌对慢性酒精暴露小鼠肠道紧密连接蛋白表达水平的影响
Fig.6 Effects of Lactobacillus treatment on intestinal tight junction protein expression levels in mice exposed to chronic alcohol
长期大量饮酒会引起酒精性肝损伤,包括从酒精性脂肪肝到酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌发展的一系列肝损伤疾病[1]。先前的大量研究已表明,氧化应激在酒精性肝损伤的发病过程中发挥着极为重要的作用[25,34]。近来研究也表明,肠道屏障功能受损引起的肠源性内毒素血症是导致酒精性肝损伤的关键因素之一[7]。临床研究发现,酒精性肝损伤患者血浆中的内毒素水平显著高于正常人[8],酒精、内毒素和肝损伤之间的关系日趋明显。同时,大量研究表明,酒精会导致肠道屏障功能受损,肠道对内毒素的通透性增加[35],导致内毒素从肠道转移到肝脏,从而激活kupffer细胞,引发一系列导致炎症反应和肝损伤的事件[36]。本研究结果同样显示,慢性酒精暴露引起小鼠肝脏中形成大量的脂肪积累,肝脏氧化损伤增加,肠道通透性显著增加,血液中内毒素含量显著上升,肝脏炎症水平增加。
益生菌具有抗氧化、提高免疫力、调节肠道菌群平衡、改善肠道屏障功能等功能。研究表明,益生菌可以通过调节肠道菌群平衡,刺激肠道生长和黏膜免疫活性,增强肠黏膜上皮细胞间的紧密连接[37],改善肠道屏障功能[38],从而减轻肠源性内毒素血症,缓解酒精性肝损伤。同时,已有研究表明鼠李糖乳杆菌LGG处理能够显著抑制广谱产生内毒素的革兰氏阴性菌的生长,从而降低酒精引起的内毒素增加[39],抑制肝脏炎症反应[40-41]。
本研究结果表明,所选乳杆菌均能够一定程度地改善慢性酒精引起的小鼠肝损伤。其中,植物乳杆菌LP45能够有效抑制慢性酒精引起的氧化损伤以及肝脏炎症反应,并有效改善肠道紧密连接,这可能与其已被证实的降低胆固醇、提高免疫力、抑制胃肠道致病菌、调节肠道菌群等功能有关[19-22]。同样,鼠李糖乳杆菌L519也能够显著抑制慢性酒精引起的肝脏炎症反应,并有效改善肠道紧密连接。同时,本研究结果也进一步验证,所选乳杆菌尤其鼠李糖乳杆菌L519和植物乳杆菌LP45,能够通过改善肠道紧密连接蛋白表达的降低,修复肠上皮屏障功能受损,同时降低酒精引起的内毒素增加,进而阻止肠道内毒素泄漏,减轻肠源性内毒素血症,缓解小鼠肝脏氧化损伤以及炎症反应,从而改善酒精性肝损伤。
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