肉是传统的膳食组成之一,对人类所需能量、蛋白质和一些重要微量营养素的摄入有非常大的贡献[1]。肉类是蛋白质的良好来源,其氨基酸组成比例合理,符合人类的营养需求,且其蛋白质消化率高,易被人体所吸收[2]。全球的肉类产量逐年递增,根据粮农组织统计数据库(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAOSTAT)统计,2010~2017年,世界的猪肉产量从109.0百万t增加到119.9百万t,牛肉产量从63.1百万t增加到66.3百万t[3]。但面对巨大的人口增长压力,肉的产量大约还需要增加50%~73%,才能满足2050年全球约90亿人口的消费需求[4]。
大量的肉类生产也带来许多不可忽视的问题,因为它将导致畜牧业的急速扩张,进而对环境保护以及资源利用(土地、水等)带来不好的影响。以20%的转换效率计算,400万m2的土地所种植的饲料作物最多能支持2 900万t肉蛋白的产出,然而若生产供人类直接食用的2 900万t植物蛋白,只需要使用25万m2的土地种植大豆[5]。同时由于饲料的低转换率,大量的肉类生产所带动的畜牧业的发展还会导致大量的水资源消耗,PIMENTEL[6]指出,生产1 kg动物蛋白需要的淡水大约是平均生产1 kg谷物蛋白的100倍。
面对这些挑战,仿制肉可以有效地解决传统肉类产业存在的一些问题。不同于传统肉类的生产方式,仿制肉并不来自于活体动物的切割,它主要包括2种:素食肉和体外培养肉。素食肉的研究比较深入,并且也已经有产品面世。Beyond Meat公司以豌豆蛋白和甜菜制成了一款素肉汉堡产品[7]。而体外培养肉还没有商业化,只是在一些实验室中得到开发,荷兰马斯特里赫特大学的MARK POST教授带领团队生产出了世界上第一例由体外培养肉制作的汉堡,这些肉最初来源于牛肌肉细胞中提取的干细胞,但是制作这种汉堡的成本非常高[8]。目前,国内对仿制肉的研究还不够全面,缺乏对仿制肉比较系统的总结。文章主要对2种仿制肉的生产技术、影响因素、存在的问题以及发展方向进行综述,以期为仿制肉的研究提供一定的参考。
仿制肉是指能从功能上取代天然肉的产品,能满足人体的营养需求,同时在产品特性和感官属性方面与天然肉相似[9]。目前仿制肉主要包括2种:素食肉和体外培养肉。素食肉本质上为组织化蛋白,是指植物蛋白质在挤压过程中的热能、机械能、压力的作用下发生分子的变化,蛋白质的球状分子沿着挤出的方向重新排列,最终形成层状或纤维状的、质地均匀的、类似于肉结构的产品[10-11]。素食肉有许多优点,例如其原料植物蛋白营养均衡,不含有胆固醇且饱和脂肪含量较低,对健康有益。此外素食肉易于被具有特殊宗教信仰的人接受[12]。
体外培养肉又称为离体肉,是指在实验室内控制培养条件和培养基成分,通过培养细胞或组织来生产想要的肌肉,并通过后续加工使其具有食用肉的形态[13]。体外培养肉有许多优点,例如体外培养肉的生产可控,能避免动物疾病给经济带来的损失或对人体的危害[14]。同时还能通过调整所培养细胞的组成(例如脂肪细胞的比例)来完善产品的营养构成[15]。相比于天然肉,体外培养肉所需的生产时间更短,投入的劳力和能量更少,在技术成熟的情况下,能满足地球人口大量增长的需要。另外,体外培养肉不涉及动物的大量宰杀,不会给动物带来痛苦,满足动物福利的要求,同时能缓解动物大量养殖所带来的资源利用压力与环境压力。
2.1.1 素食肉的传统生产方法
素食肉的生产方法分为传统法和现代法,传统方法主要有如下几种:冻结法、纺丝粘结法、水蒸气膨化法。然而传统方法存在较多的问题,例如冻结法和纺丝粘结法的缺点是工艺较复杂、生产的成本高、需要冷链保存产品、工业化程度较低;水蒸气膨化法的缺点是它对原料豆粕的完整性要求较高,且生产的产品多为薄片状,不具有长纤维的结构,没有肉的质地和口感,已经不符合当下的发展趋势[16]。
2.1.2 素食肉的现代生产方法
挤压法是素食肉生产的现代方法,即指蛋白质在挤压膨化机中经过高温高压、剪切力、水的复合作用,使其由原来的天然球状结构定向排列重组为纤维状结构[16]。挤压法操作简便,生产能力较大,产品质地均匀,且基本上不会产生废料,适于工业化、连续化生产[17]。由各种植物原料所生产的纯组织化蛋白的特点如表1[18-20]所示。
挤压法可分为高水分挤压法和中低水分挤压法,高水分挤压法是在低水分挤压法的基础上,伴随双螺杆挤压机的出现发展起来的。它们的主要差异如下:(1)高水分挤压法的物料含水量为40%~80%,中低水分挤压法的物料含水量为10%~30%[10]。(2)高水分挤压法使用的是带有长冷却模头的双螺杆挤压机,有利于蛋白质在相对较低的温度下形成纤维结构,还能够保留活性营养物质;而中低水分挤压法大多使用的是单螺杆挤压机,模具较短,温度较高,对营养物质的损耗较大,在其提供的高剪切力下,螺杆和机筒之间会产生较大的磨损[21]。(3)高水分挤压法生产的产品组织化程度比较高,具有类似于鸡肉纤维状的质地,可以不经过复水直接食用,一般直接用于生产肉的模拟品;而中低水分挤压法生产的产品为海绵多孔状,食用前需要经过复水处理,一般用作肉制品的添加物。高水分挤压法生产的产品性能较优,是未来的发展方向,目前只有国外少数几家公司生产出了上市产品,例如美国的Beyond Meat公司。我国对中低水分挤压法的研究较成熟,但对于高水分挤压法尚且处于实验室的理论研究阶段[21]。
表1 不同种类的纯组织化蛋白的优缺点
Table 1 Advantages and disadvantages of differentkinds of purely textured protein
组织化蛋白种类优点缺点纯小麦组织化蛋白白色、气味好成型性差、表面粗糙、肉感较差纯大豆组织化蛋白深黄色、硬度和咀嚼感好豆腥味较重,有苦涩味,有致敏和使用转基因大豆的可能纯花生组织化蛋白灰白色、气味与滋味较好咀嚼感差、肉感较嫩纯豌豆组织化蛋白浅黄色、肉感较强,致敏性较低成型性较差,有夹生现象
2.1.3 素食肉生产效果的影响因素
挤压过程的工艺参数对产品的质量有非常重要的影响。挤压的工艺参数包括筒体温度(主要指蒸煮区的温度)、加水量、喂料速度、螺杆转速,这些参数相互作用,共同影响着物料粒径、产品的黏度与硬度、蛋白质交联反应与构象改变、产品纤维结构的形成等[18]。表2显示了在具体的应用中,几种工艺参数对组织化蛋白产品特性的影响。
表2 几种挤压的工艺参数对组织化蛋白的影响
Table 2 Effect of several extrusion parameters on the textured protein
体系种类工艺参数对组织化蛋白的影响文献花生蛋白蒸煮区温度100~120℃,花生蛋白变性,没有明显的纤维状结构;140~150℃,花生蛋白变得致密化,并有明显的纤维状结构,其弹性逐渐增加;温度高于150℃,硬度和弹性下降,出现褐变与蛋白质分子链降解[22]豌豆蛋白物料含水量含水量30%~60%,硬度、咀嚼性随含水量增加而减少,弹性增加。产品组织化程度、持水力先增大后减小,组织化度在50%~60%的含水量达到最大,含水量大于50%,样品外观多孔且粗糙。含水量为50%,产品质量较佳[23]大豆蛋白喂料速度喂料速度于10~50 g/min,亮度值L*随喂料速度的增加而增加,咀嚼度、黏着性随之增加而减少[24]小麦面筋和大豆蛋白螺杆转速和蒸煮区温度当处于较低转速,蒸煮区的温度和组织化指数不显著相关,当处于较高转速,组织化指数随蒸煮区温度的增加而增加;在恒定温度下,随螺杆转速的增加,组织化指数先增加后降低[25]
2.2.1 基于支架的细胞培养法
基于支架的细胞培养法是指从动物的胚胎中分离出胚胎成肌细胞或者是从动物肌肉中分离出骨骼肌卫星细胞,使其在一个充满营养介质以及丰富生长因子的反应器中增殖并连接到支架上(例如胶原蛋白球或胶原蛋白网状结构)。在外界环境条件的作用下,这些细胞融合形成肌管。肌管在分化介质的作用下,进一步分化形成肌纤维,当肌纤维达到一定的数量之后,将其从支架上取下、切碎,制成预期的肉制品,这些产品一般是又软又稠的无骨碎肉,而不像牛排那样具有严密结构[26]。
生产体外培养肉的初始细胞主要包括肌卫星细胞、胚胎干细胞、多能诱导干细胞。此外,将成肌细胞与成纤维细胞或脂肪细胞一起培养,能使产品更像天然肉质[15, 27]。肌卫星细胞是位于肌细胞基底膜下的单核细胞,相当于出生后肌肉中的胚胎成肌细胞,具有肌源性潜能。目前已经成功从牛、鱼、猪、火鸡、羔羊的肌肉中分离出了肌卫星细胞[15]。胚胎干细胞是一类从早期胚胎或原始性腺分离出来的细胞,具有自我更新的特性,能在体外无限增殖,且具有多向分化的特点,在诱导下几乎能分化成任何需要的细胞类型[28]。ZHENG等[29]将来自于人胚胎干细胞的肌源性前体细胞移植到注射了心脏毒素的小鼠右后肢肌肉中,肌源性前体细胞可以有效地融入,并产生肌卫星细胞、肌管及肌纤维。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem,iPS)是一种具有多潜能性的、形态和生长特性都与胚胎干细胞相似的、由分化的细胞经诱导而形成的干细胞,最初由日本科学家TAKAHASHI和YAMANAKA[30]发现并命名。EZASHI等[31]研究发现将4个来自人类基因的因子hOCT4、hSOX2、hKLF4、hc-MYC移入到猪胎儿成纤维细胞中,可以将其成功诱导为多能干细胞。MIZUNO等[32]成功将小鼠的多能诱导干细胞在体外的培养系统中使其分化为骨骼肌干细胞。
2.2.2 组织培养法
另一种生产体外培养肉的方法是在培养基中培养来自动物的肌肉组织,这种方法可以制造出高度结构化的肉类。组织培养技术的好处是取自动物机体的肌肉组织提供了与机体内情况非常相似的条件,且最后培养的外植体包含了各种类型的细胞,接近天然肉类的细胞组成比例[13]。BENJAMINSON等[33]将来自金鱼的肌肉组织切片、切碎、离心,分别培养在含胎牛血清、鱼粉提取物、菌菇提取物的几种不同的培养基中,培养7 d后的结果显示,培养形成的外植体在含胎牛血清的培养基中的表面积平均增加了13.8%,而在含鱼粉提取物的培养基中的表面积平均增加了7.6%,在含菌菇提取物培养基中的表面积平均增加了13.1%,培养得到的产品看起来与新鲜鱼片相似。然而由于缺乏血液循环,外植体不能大幅增长,而且当细胞长时间离开营养物质超过0.5 mm时就会坏死。目前,一种将人工毛细血管用于组织工程的设计方案正被研究人员考虑。
2.2.3 体外培养肉生产效果的影响因素
体外培养肉生产效果的主要影响因素包括:培养基类型、培养所使用的支架以及培养过程中的生化调节、电刺激和机械刺激。用于培养骨骼肌细胞的传统培养基为含动物血清的培养基,然而动物血清培养基的价格较昂贵,存在致病微生物感染的可能,同时涉及到伦理问题(例如胎牛血清的来源),目前无血清的培养基正受到关注,并已经将这种无血清的培养基用于火鸡、羊、猪肌卫星细胞的体外培养[34]。Ultroser G是一种胎牛血清的血清替代品,含有真核细胞生长所需的生长因子、结合蛋白、黏附因子、维生素、激素和矿物质,哺乳动物骨骼肌细胞在含有Ultroser G的培养基中生长较好,能形成更长的肌管,然而Ultroser G存在成本较高的缺点[34]。由于细胞的生长具有锚定依赖性,因此需使用支架作为细胞依附、增殖、分化的基质[35]。支架的材料包括可食用的天然聚合物例如胶原蛋白、纤维素、海藻酸盐或壳聚糖,这些聚合物具有安全性并且可以增强肉的质感[34]。而对于不可食用的材料,使用的关键在于如何将培养物从支架上移除,常用的方法是机械法和酶法,然而这2种方法容易损伤培养物。SILVA等[36]提出一种由异丙基丙酰胺制成的热响应涂层,这种涂层在降低温度时会由疏水状态变为亲水状态,可用于细胞薄片和细胞外基质的回收分离,同时不损伤细胞的黏附能力,这为培养物薄片叠加形成三维结构提供了可能。
创造类似于体内环境的生化调节、电刺激、机械刺激对于体外培养肉的形成至关重要。生化调节主要通过一些生长因子起作用,例如IGF-1(胰岛素样生长因子1)、FGFs(成纤维细胞生长因子)等[27],电刺激主要是通过模拟神经活动来促进细胞的成熟,机械刺激通过模拟发育过程中骨骼的伸长发挥作用。VANDENBURGH等[37]发现使涂有胶原蛋白的硅橡胶基质以0.35 mm/h的速度朝一个方向缓慢连续地拉伸3 d,会刺激附着在上面细胞的增殖,最终形成的肌管长度是没有拉伸处理所培养肌管的2~4倍。
素食肉的生产目前还存在一些问题,例如由于不同厂家的设备存在差异性,对于工艺参数需要进行配套变化,才能保证产品的一致性,存在工艺机理的研究和设备的研发脱节的现象,另外对于挤压后的工艺例如包装技术、杀菌技术、贮藏环境的研究尚且缺乏[38]。同时,目前缺少针对高水分挤压技术所生产的组织化蛋白的评价标准,不同的研究者采用的评价方法不同,缺乏统一性,制约了高水分挤压组织化蛋白的大规模工业化生产[39]。
针对以上问题,素食肉应朝如下方向发展:(1)集中研究高水分挤压技术,使其早日从实验室理论研究阶段转向工业生产阶段,与国际发展接轨。同时应更多地研究大豆蛋白以外的原料,如豌豆蛋白、亚麻蛋白、藻类蛋白等,并对一些新型的植物蛋白原料进行开发。(2)将高水分挤压技术与其他技术结合,例如超临界二氧化碳对营养成分有保护作用,将高水分挤压技术与其结合能有效防止原料中营养成分的损失,同时还可以将高水分挤压与3D打印技术相结合,生产出与天然肉质地更相似的产品[21]。(3)对挤压后的杀菌技术、包装技术、贮藏条件进行研究,形成一条完整的产业链。(4)建立统一的高水分挤压组织化蛋白评价标准,以保证产品的一致性,促进产品的工业大规模生产。
目前体外培养肉仍处于初级阶段,其发展远没有素食肉成熟。概括来说,体外培养肉还存在如下一些问题。首先,由于体外培养肉尚处于实验室的研究阶段,还未达到预期的理想状态,其生产成本较高昂。同时细胞培养法主要生产的是一些用于制作肉糜的小薄片,但不能生产高度结构化的牛排。要培养大块的肌肉,氧气、营养物质的运输以及废物的排出需要得到保障,虽然内置血管的想法已经被提出,但还没有得以实现,同时适于大规模生产的生物反应器也还没得到设计和建造[15]。另一个突出的问题是体外培养肉的感官特性还不能完全模仿天然肉,而且由于体外培养肉的生产方式与传统方式不同,会给消费者带来不自然的感觉,导致消费者对体外培养肉的接受度不高[8]。
针对以上问题,外培养肉应向如下方向发展:(1)应进一步完善技术以降低体外培养肉的生产成本,减少生产时间。设计并建造大型的生物反应器,以提高生产效率。同时应大力着手于带有内置血管的肌肉组织的设计与建造,使大量营养物质能够运输到组织的内部并实现废物的排放[40]。(2)不断完善培养基的成分,寻求更高效、安全、成本更低的植物源培养基[41]。(3)将体外培养肉的生产技术与其他技术相结合,例如器官打印技术、生物光子学等,以生产具有复杂特定结构的产品[26]。(4)加大对体外培养肉的宣传力度,消除消费者的误解与偏见,增加消费者的接受度。同时应针对这种新产品建立合适的标准和监管体系,增加产品的安全性和可控性。
仿制肉能解决目前肉类生产方式所存在的一些问题,具有环保性,能缓解土地资源和水资源使用压力,同时具有不受动物疾病影响、满足动物福利要求等优点。然而仿制肉的生产技术特别是体外培养肉的生产技术还不是十分成熟完善,这就导致了所生产的产品与天然肉类还存在一些差距,生产的成本也没有得到很好的控制,生产过程中还存在着一些技术难题需要解决。对于素食肉来说,今后应将研究的重点从中低水分挤压法转移至高水分挤压法,以生产组织化程度更高的纤维状蛋白质,模拟天然肉类的质地。对于体外培养肉,应进一步降低生产的成本,致力于含内置血管肌肉的研究以及大型生物反应器的设计与建造,以满足具有复杂结构大块肌肉的大量生产。
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