Nisin是由乳酸链球菌(Lactococcus lactic)发酵产生的一种耐热性强的天然生物活性抗菌肽，其可以提高食品的保藏性,能够抑制部分病原体的生长，有效地保留食品的营养价值及风味品质[1-3]。Nisin应用于乳制品及肉制品等食品保鲜的报道有很多，包括干酪保藏[2, 4]、冷却牛肉保鲜[5]、小黄鱼保鲜[6]、肉汤及香肠保鲜[7-8]。
传统酸肉是一种采用自然厌氧发酵而制成的一种乳酸发酵食品，发酵既是酸肉风味品质形成的工艺处理，又是酸肉保藏的方法。在发酵加工和保藏过程中，酸肉中蛋白质和脂肪会持续发生降解从而影响酸肉品质。目前有关传统酸肉制品的研究报道主要包括发酵工艺条件、营养变化、微生物群系、风味品质等[9-12]；本团队前期研究显示酸肉风味品质形成所需合适的发酵时间在20～40 d[13-14]。自然发酵酸肉因生产工艺、气候环境等条件的不同使得主要菌群系存在差异，从而使保质期不稳定、不可控。在自然发酵酸肉的保藏过程中，乳酸菌作为优势微生物类群，其次生代谢产物细菌素Nisin因能有效地抑制或杀死酸肉中有害的革兰氏阳性菌，同时能够随着酸肉进入消化道，易被蛋白水解酶降解成氨基酸而作为天然食品添加剂应用于酸肉保鲜上[15]。
作为一种地方性特色风味食品，自然发酵酸肉的生产受限于地域环境，对酸肉产品进行商品化保藏研究有利于拓宽猪肉的产业链，为酸肉的消费扩展提供支持。Nisin作为一种常用肉品保鲜剂应用于肉制品及保鲜中[4, 16]，本研究拟采用不同Nisin浓度处理酸肉产品后控模型真空包装，并研究其在常温保藏过程中营养卫生品质变化及感官品质特征，为酸肉产品的商业化提供支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
鲜猪肉、籼米、食盐，重庆北碚天生永辉超市。大米炒至微黄，粉碎过40目筛。
1.2 主要试剂
硫酸、硼酸、三氯乙酸、石油醚(沸程30～60 ℃)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、2-硫代巴比妥酸、CuSO4、亚甲基蓝、甲基红、溴甲酚绿、甲醇、K2SO4、MgO、无水乙醇、酚酞、邻苯二甲酸氢钾、异亮氨酸等均为分析纯；平板计数琼脂培养基(PCA)。
1.3 主要仪器与设备
722型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；UltraScan PRO色差仪，美国HunterLab公司；雷磁PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；DZ600-2S真空包装机，上海人民包装股份有限公司；XW-80A旋祸混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司等。
1.4 试验方法
1.4.1 酸肉制备
新鲜猪里脊肉和肥肉，洗净控水，切成约3 cm×5 cm×0.5 cm薄片，加入10%(质量分数)米粉和5%(质量分数)食盐，混匀装坛，水密封，(20±2) ℃发酵35 d，得酸肉成品。平均含水量43.76%。
1.4.2 试验设计
设计4个Nisin浓度，添加量分别为0、0.15、0.30和0.45 g/kg酸肉，分别定义为对照组(CG)、N1、N2和N3组，并进行真空包装(包装材料：PA/PE共挤膜；双层24丝)。(20±2)℃下贮藏，分析不同贮藏时段酸肉营养安全及感官品质变化。蛋白质采用瘦肉进行分析；其他各指标均采用肥瘦各半。
1.4.3 分析方法
蛋白质含量：参照《GB 5009.5—2016》凯氏定氮法；
脂肪含量：参照《GB 5009.6—2016》索氏抽提法；
挥发性盐基氮：参照《GB 5009.228—2016》半微量定氮；
游离脂肪酸：参照《SN/T 0801.19—1999》和阮长青等[17-18]方法。
非蛋白氮测定：参照张平等[19]方法。称取绞碎酸肉样品10 g于锥形瓶内，加入90 mL蒸馏水，室温振摇30 min，过滤，取25 mL滤液，加入25 mL 100 g/L三氯乙酸溶液混匀，再次过滤后取10 mL滤液消化。凯氏定氮法测定非蛋白氮含量。
硫代巴比妥酸测定：参照黄卉等[20]方法。准确称取绞碎肉样10 g，加入50 mL 75 g/L(含l g/L EDTA)的TCA溶液，振摇30 min，双层滤纸过滤2次；取5 mL滤液于具塞试管中，加入0.02 mo1/L的硫代巴比妥酸溶液5 mL，加塞，混匀，沸水浴 40 min；取出冷至室温，5 000 r/min离心10 min，取上清液，加入5 mL三氯甲烷摇匀，静置分层，取上清液分别在532 nm和600 nm波长处测吸光度，TBA值按公式(1)计算：
(1)
式中：TBA值,与TBA反应的物质的量，以每100 g样中丙二醛毫克数表示(mg/100 g)；m,样品质量，g；A532和A600,分别为上清液在波长532 nm和600 nm处的吸光度；72.06，丙二醛摩尔质量，g/mol；155，摩尔吸光系数。
菌落总数：参照GB4789.2—2016，采用PCA培养基倾注法计数。无菌条件下取25 g样品，加入225 mL灭菌生理盐水，均质器拍打1～2 min制成100 g/L样品匀液。随后用微量移液器吸取样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管或换用1支无菌移液器吸头反复吹打使其混合均匀，制成1 000 g/m的样品匀液。另取1 mL无菌移液器吸头，按照上述操作，做成10倍递增稀释液。然后选择2～3个适宜稀释度的稀释液，按菌落总数法进行培养计数，结果以CFU/g表示。
色泽：将酸肉表面黏附的米粉擦净，色差仪在使用前用白板校准，分别记录L*、a*和b*值，作为所测样品亮度值、红度值和黄度值，每个样品取不同肉块重复测定5次，取平均值。总色差ΔE如公式(2)计算[21]：
ΔE=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2
(2)
式中，ΔL=L*- L0，Δa=a*-a0，Δb=b*-b0，L*、a*、b*,不同贮藏阶段酸肉的亮度值、红度值和黄度值，L0、a0、b0,贮藏0 d酸肉的亮度值、红度值和黄度值。
1.4.4 感官评价
采用模糊数学综合评判法[22]，将各组酸肉蒸熟，挑选10人进行品评(男女各5人)，以外观、色泽、气味、滋味为评定指标，评价标准与指标见表1。
(1)确定因素集U以U=(u1，u2，…，ui，…，um)表示，其中U为因素集，ui为第i个因素。确定发酵酸肉4项指标组成的因素集，即U={外观u1，色泽u2，气味u3，滋味u4}，采用强制决定法[23]，确定发酵酸肉各感官指标权重为A=(0.20，0.20，0.30，0.30)。
(2)确定评语集V表示为V=(v1，v2，…，vi，…，vm)(2<m<8，m为整数)，其中V为评语集，vi为第i级评语。经评定小组讨论确立发酵酸肉评语集为V=(优级v1，良好v2，一般v3，较差v4)。
从U到V的一个模糊映射R，设U上模糊集为A=(a1，a2，a3，a4)，表示外观、色泽、气味和滋味的加权数，则B=A×R，式中，B表示综合评定结果，A表示加权数集，R表示评价矩阵见式(3)。
(3)建立模糊矩阵：
(3)
按酸肉质量级别给优级、良好、一般、较差，并依次赋予分值90、80、70、50。然后，综合评价结果集合中的各个元素分别乘以相应分值，并进行加和计算，最终得到不同贮藏阶段酸肉感官评价总得分，当总得分小于70分时，其所对应的酸肉不能食用。
表1 感官评价标准表
Table 1 Standard of sensory evaluation for sour pork
指标优级良好一般较差外观外观完好,无胀袋和发黏外观尚好,无胀袋和发黏外观尚好,略微胀袋发黏现象外观不可接受,有明显胀袋发黏现象色泽瘦肉呈红色,组织纹理紧致分明;肥肉呈粉白色;米粉呈白色有光泽瘦肉呈暗红,组织纹理紧致分明;肥肉呈粉白色;米粉呈白色,湿润有光泽瘦肉呈暗粉红,组织纹理略疏软;肥肉微见粉色;米粉微黄;光泽一般瘦肉微发白,组织发糜松散;肥肉发白;米粉变黄;无光泽气味浓郁发酵肉香,无其他异味发酵肉香,无其他异味发酵肉香,略有异味有酸败味,异味明显滋味酸度适宜,咸甜鲜适口,口感浓郁酸度适宜,口感较浓郁略酸,咸甜鲜适中,口感一般过酸,有哈喇味,口感不适
1.5 数据分析
结果以平均值±标准差表示，n=3；采用OriginPor 9.0画图及拟合方程分析，IBM SPSS Statistics 19.0数据分析。
2 结果与分析
2.1 蛋白质及降解产物在酸肉贮藏中的变化
2.1.1 蛋白质在酸肉贮藏中的变化
由表2可以看出，随贮藏时间延长，蛋白质含量逐渐下降(P>0.05)，至80 d时，CG组和N1、N2、N3组分别为贮藏0 d时的84.32%、84.32%、87.07%和87.11%，说明在贮藏过程中蛋白质发生降解，随Nisin添加量增加，蛋白质保留量增加，中、高剂量组高于低剂量组和对照组，但各处理间无显著差异(P>0.05)。
表2 添加Nisin对酸肉(瘦)贮藏中蛋白质含量变化的影响 单位：(g/100g湿基)
Table 2 The effects of Nisin addition on protein content in sour pork (lean)
时间/dCGN1N2N3023.27±0.25a22.71±0.35b22.42±0.18b22.11±0.08c1021.75±0.19c21.80±0.19bc22.16±0.14a21.66±0.15c2021.25±0.13b21.30±0.27ab21.46±0.38ab21.54±0.06a3021.04±0.12b21.07±0.19ab21.25±0.04a21.21±0.23a4520.44±0.32ab20.82±0.29a20.67±0.17a20.37±0.14b6019.90±0.41ab19.65±0.03b20.13±0.10a19.54±0.32b8019.62±0.17a19.15±0.21b19.52±0.23a19.26±0.51ab
注：同行不同小写字母表示不同处理组的指标均值差异显著(P<0. 05)。下同。
2.1.2 非蛋白氮和TVB-N在酸肉常温贮藏中的变化
非蛋白氮是表征蛋白质降解的重要指标，也是肉制品风味的重要前体物质[24]。由图1可知，NPN含量在贮藏前期缓慢升高，后升势变陡，至80 d时，CG组和N1、N2、N3组NPN含量分别为贮藏0 d时的1.49、1.45、1.48和1.36倍。添加Nisin处理各组NPN均低于对照组，高剂量组优于中低剂量组，贮藏45 d后，添加Nisin处理各组NPN显著低于对照(P<0.05)，随贮藏时间延长，添加Nisin高剂量组显著低于中低剂量组。表明添加Nisin有助于延长酸肉常温贮藏时间和延长保质期。
图1 添加Nisin对酸肉贮藏中非蛋白氮含量的影响
Fig.1 Effect of Nisin on the content of non-protein nitrogen in sour pork storage
进一步分析了蛋白质降解产物TVB-N含量变化(图2)，TVB-N含量随酸肉贮藏时间延长逐渐增加，至80 d时，CG和N1、N2、N3组TVB-N含量分别为贮藏0 d时的3.37、2.88、2.98和3.06倍，Nisin各组TVB-N含量显著低于CG(P<0.05)，但添加Nisin处理各组差异不大。与GB鲜(冻)畜禽产品中TVB-N限量标准(≤15 mg/100 g)相比，CG和N1、N2、N3组TVB-N含量分别在贮藏20、20、30和30 d时超标；与腌猪肉SB/T 10294—2012一级品标准限值(≤20 mg/100 g)相比，CG及Nisin处理各组分别在贮藏至20 d和45 d时超标；与二级品标准限值(≤45 mg/100 g)相比，所有处理组在贮藏至80 d时均未超标。表明添加Nisin可延缓酸肉常温贮藏过程中蛋白质的腐败变质，延长贮藏时间；以腌猪肉SB/T 10294—2012一级品标准限值看，CG组贮藏时间不宜超过30 d，Nisin各组贮藏时间不宜超过45 d。
图2 添加Nisin对酸肉贮藏中TVB-N含量的影响
Fig.2 Effect of Nisin on TVB-N content in sour pork storage
2.2 脂肪及降解产物在酸肉贮藏中的变化
2.2.1 游离脂肪酸在酸肉贮藏中的变化
由表3可知，脂肪含量随酸肉贮藏时间延长而缓慢下降，至80 d时，CG和N1、N2、N3组分别为贮藏0 d时的95.18%、95.71%、95.50%和95.97%；CG和Nisin各处理组之间无显著差异(P>0.05)，添加Nisin对酸肉常温贮藏过程中脂肪的降解影响较小。
表3 添加Nisin处理酸肉在贮藏过程中脂肪含量的变化 单位：g/100 g湿基
Table 3 Effects of Nisin treatment on fat content of sour pork during storage
时间/dCGN1N2N3030.91±0.19b32.20±0.25a32.46±0.27a32.50±0.86a1030.62±0.37b32.08±0.18a32.17±0.52a32.27±0.62a2030.26±0.14c31.78±0.20b31.89±0.78ab32.12±0.13a3030.00±0.59c31.48±0.20b31.64±0.34ab31.90±0.53a4530.06±0.20b31.40±0.19a31.45±0.24a31.66±0.26a6029.84±0.42b31.12±0.19a31.17±0.41a31.38±0.33a8029.42±0.38b30.82±0.55a31.00±0.50a31.19±0.35a
2.2.2 游离脂肪酸和TBA在酸肉贮藏中的变化
由图3可知，酸肉游离脂肪酸含量随贮藏时间延长逐渐升高，至80 d时，CG和N1、N2、N3组含量分别为0 d时的1.50、1.38、1.41和1.40倍；贮藏45 d后，添加Nisin各组游离脂肪酸总量显著低于CG组(P<0.05)，但Nisin各剂量组间差异不大。脂肪降解产生的低分子脂肪酸可继续产生酸肉风味[25]，特别是不稳定的亚油酸，其降解可产生醛类等挥发性风味物质，如2，4-癸二烯醛，它有强烈的鸡香和鸡油香味[26]，可形成发酵酸肉特征风味。但脂肪持续分解可引发酸价和过氧化值增加从而导致肉的酸败并出现哈喇味[27]。
图3 添加Nisin处理酸肉贮藏中游离脂肪酸含量变化
Fig.3 Effects of Nisin on the changes of free fatty acid content in sour pork storage
为此，分析了TBA在酸肉贮藏中的变化(图4)，TBA随贮藏时间延长而增加，至80 d时，CG和N1、N2、N3组TBA含量分别为贮藏0 d时的2.72、2.27、2.37和2.26倍，Nisin各剂量组TBA增速均低于CG(P<0.05)，但Nisin各剂量组差异不大。TBA的增加表明脂肪不断被氧化以及与蛋白质发生交互作用等，从而影响了酸肉感官品质[28]。SØRENSEN等[29]报道肉发出腐臭异味的TBA阈值为5 mg MDA/kg，通过拟合方程分析得CG组贮藏时间不宜超过26 d，Nisin添加中、低、高剂量组分别不宜超过30、37和42 d。
图4 添加Nisin处理酸肉贮藏中TBA含量变化
Fig.4 Effects of Nisin treatment on TBA content in sour pork storage
2.3 菌落总数在酸肉贮藏中的变化
如图5所示，酸肉菌落总数随贮藏时间延长逐渐增加，添加Nisin各组菌落总数均显著低于CG；贮藏60 d后，随Nisin剂量增加抑制效果更显著(P<0.05)。按微生物规范国际委员会(ICMSF)[30]规定的要求菌落总数可接受最高范围7.0 lg CFU/g，CG组贮藏时间不宜超过45 d，Nisin各剂量组均未超出限值，实验中观察到CG组在贮藏60 d后出现胀袋现象，这可能是随着贮藏时间的延长，酸肉pH值逐渐下降，使得微生物菌群系发生改变，产气细菌成为优势菌种从而出现膨胀现象。表明添加Nisin可有效抑制微生物的生长繁殖，Nisin浓度越高效果越好。
图5 添加Nisin处理酸肉贮藏中菌落总数的变化
Fig.5 Effects of Nisin treatment on the total number of colonies in sour pork storage
2.4 酸肉贮藏中总色差(ΔE)的变化
酸肉中瘦、肥肉的ΔE变化结果见图6和图7。随贮藏时间延长，肥肉ΔE略有增加，瘦肉ΔE迅速升高；贮藏至80 d时，肥肉CG和N1、N2、N3组ΔE为0 d时的1.63、1.76、1.57和0.61倍，瘦肉CG和N1、N2、N3组ΔE为0 d时的3.12、2.74、2.46和4.44倍；表明相比瘦肉，肥肉的ΔE变化程度小，这可能是脂肪氧化降解程度不如蛋白质高的缘故，添加Nisin中剂量组ΔE变化较小。这与肉类加工贮藏中颜色变化主要与肌红蛋白的降解和脂质氧化相关[31]。
ΔE反应了酸肉贮藏过程变色程度[32-34]。观察肥肉各组样品ΔE均属感觉有差异范围(ΔE 1.5～3.0)或较显著差异范围(ΔE 3.0～6.0)[21]；瘦肉CG组、N1和N3组分别在贮藏45、60和60 d后ΔE属于很明显差异范围(ΔE 6.0～12.0)，瘦肉N2组在45 d后ΔE属较显著差异。综合ΔE结果分析，Nisin添加量0.30 g/kg为宜。高剂量Nisin添加引发瘦肉ΔE增加和肥肉ΔE降低的原因有待进一步探讨。
图6 添加Nisin处理酸肉(瘦)贮藏中ΔE的变化
Fig.6 Effects of adding Nisin treatment on the ΔE of sour pork (lean) during storage
图7 添加Nisin处理酸肉(肥)贮藏中ΔE的变化
Fig.7 Effects of adding Nisin treatment on the ΔE of sour pork (fat) during storage
2.5 不同贮藏时段酸肉感官品质评价
采用模糊数学感官评价的实验结果见图8，酸肉感官评分随贮藏时间延长而逐渐下降。CG、N1和N2组在贮藏30 d内感官评分均高于80分，N3组贮藏45 d时评分高于80分，均属于良好；继续贮藏，感官评分持续下降，至80 d时不能接受，这可能与酸肉中微生物群系发生变化，微生物数量上升，酸肉中蛋白质和脂肪被持续分解发生腐败变质等有关。根据感官评价CG、N1、N2和N3组贮藏时间分别不长于30、30、30和45 d。CG组感官评分低于添加Nisin各组，表明添加Nisin处理有助于延长酸肉常温贮藏时间，高剂量组有助于延长酸肉保藏时间。
图8 不同贮藏时间酸肉的感官评定雷达图
Fig.8 Sensoryevaluation radar chart of sour pork at different storage time
3 结论
酸肉添加Nisin处理后采用真空包装并在常温下进行贮藏，对酸肉贮藏中营养卫生及感官品质进行评价分析，显示酸肉主要营养素蛋白质和脂肪在整个贮藏时段有所下降，但其含量变化在营养学上影响较小。
添加Nisin有助于减缓蛋白质和脂肪降解。随Nisin添加剂量增加，NPN和TVB-N在贮藏中增长减缓；与腌猪肉SB/T 10294—2012一级品标准限值(≤20 mg/100 g)相比，CG组贮藏时间不宜超过20 d，Nisin处理各组可贮藏至45 d；与二级品标准限值(≤45 mg/100 g)相比，所有处理组TVB-N在贮藏至80 d时均未超标；添加Nisin各组游离脂肪酸和TBA均低于CG组，但Nisin各剂量组差异不大，与SØRENSEN G等[28]报道的肉发出腐臭异味的TBA阈值(5 mg MDA/kg)相比，CG组贮藏时间不宜超过26 d，Nisin添加中、低、高剂量组分别不宜超过30、37和42 d。
添加Nisin可有效抑制微生物的生长繁殖。与微生物规范国际委员会规定的菌落总数可接受最高范围相比，CG组贮藏时间不宜超过45 d，Nisin各剂量组在贮藏期间均未超出限值。
肥肉ΔE在贮藏中的变化比瘦肉变化程度小，这可能与脂肪和蛋白质降解及产生的色变不同有关，包括肌红蛋白的降解和脂质氧化，脂质氧化产生自由基可引起肌红蛋白氧化使肉色呈褐红或变得苍白。Nisin高剂量组肥肉色变程度较小，中低剂量组瘦肉色变较小。感官评价显示CG和N1、N2、N3组贮藏时间分别不宜超过30、30、30和45 d。
综合酸肉常温贮藏中蛋白质和脂肪降解产物、菌落总数及感官评价，酸肉采用真空包装常温贮藏时间不宜超过20 d；添加Nisin有助于延长酸肉常温保藏时间，中低剂量组贮藏时间不宜超过30 d，高剂量组不宜超过45 d。
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