改革开放40年来,我国人民生活质量有了显著改善。肉及其制品富含营养,在食品精细化程度不断加深和高收益的强烈诱惑下,食品违法行为也屡见不鲜[1-3]。目前在肉品质量监控方面,世界各国制定了一系列政策措施,国际社会对肉品掺假的关注也不断提高,2017年,在北京举办关于共同预防、控制以及治理食品掺假问题的“全球共识”研讨会;我国国务院在《2017年食品安全重点工作安排》中也强调要推动“掺假造假行为直接入刑”等工作。基于此,食品肉类工业迫切需要一种快速、便携、大众化和可以实现商业化的检测方法来完成自查和督查工作。
CAO等[4]使用酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)技术,联用 SYBR green I(SG)可以实现未加工肉品的掺假, 也可以区分经过如煮沸、微波、高压或油炸等深度加工肉品的种类;ALIA 等[5]对市场中的肉丸进行了研究,开发了基于纳米生物缀合物的杂交动力学技术,通过功能化的标记金纳米颗粒来检测特定序列和单核苷酸错配,以此来探索肉类来源,该方法具有较高的灵敏度。但是,在使用基于蛋白的方法来鉴别不同品系的肉品时,需要对靶蛋白的特异性和稳定性进行全面考量;另外,蛋白质容易变性。因此,对于肉品掺假的鉴定研究工作仍然侧重于基于核酸的分析方法[6-11]。
SOARES等[12]在家禽肉中混合已知量猪肉来构建二元混合肉制品,用 SYBR Green 为染料进行 RT-PCR 检测,通过分析熔解曲线,验证了该方法可应用于市场禽肉质量的检测分析工作中;REN[13]通过对液滴数字 PCR(droplet digital PCR, ddPCR)分析技术的探究,对羊肉中有鸡肉掺入的情况进行了定量检测;同时,该工作也确定了在掺假比例不同时,拷贝数与混合肉类质量比率关系的转换系数。虽然ddPCR技术是非常有应用价值的 DNA 定量检测技术,但是,由于整个检测过程处于微体系中,对液滴的操控水平要求极高,如何实现稳定、高效且低成本的检测,是第三代 PCR 技术从实验基础研究走向市场化亟待解决的问题。
HEBERT等[14]提出的DNA 条形码技术(DNA barcoding)[15-16],已在真菌、植物、鱼类和两栖类等多个类群的鉴别研究中得到应用。另一方面,随着近些年对电化学传感器研究力度的增强,DNA 传感器便于携带、可实现现场检测和灵敏度高等优点渐渐得到重视。例如,运用丝网印刷工艺,制成具有超小体积、质量几可忽略、方便现场操作等特点的丝网印刷电极(screen printed electrode, SPE),整个移动式检测分析过程通过电缆线连接电脑即可完成,如图1所示。该技术在 DNA-药物相互作用机制的研究和评估、临床诊断 DNA 碱基损伤、直接监测杂交过程或特异性 DNA 序列的无标记检测等[17]应用较多。
a-样品托架;b-一次性丝网印刷电极;c-便携式恒电位仪;d-传感检测软件
图1 便携式丝网印刷电极电化学传感系统
Fig.1 Portable SPE Electrochemical Sensor System
本课题将尝试探索构建基于动物线粒体 COI 基因片段的丝网印刷电化学生物传感器,如图2所示,该过程无需经过繁琐的 PCR 扩增过程,直接在电极工作界面通过寡核酸序列探针特异性捕获靶序列,对样品进行高特异性、高灵敏度和高适用性的分析测试,可实现原位检测、高灵敏性、易商品化地快速鉴别肉品掺假目的,并完成混合二元靶 DNA 模型的定性与定量的相关工作,为我国关于禽肉、畜肉标准条形码的确定和相关数据库的建立,提供一种新的研究手段,也为相关法令条款的制订与落实提供科学的数据支撑。
a-特异性探针的固定(蓝线);b-COI基因序列的杂交(绿线);c-双链DNA与亚甲基蓝结合(紫点);d-亚甲基蓝方波伏安法电流信号
图2 利用特异性探针检测生猪肉/牛肉混合二元物示意图
Fig.2 Illustration of the detection for pork/beef binary mixture with specific probe
分别配制 PBS 缓冲液(pH 7.4)、Tris-HCl 溶液(pH 8.0)和TE 缓冲液(pH 7.4)、 0.1 mol/L H2SO4溶液、1 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液、1 mmol/L ME 溶液、0.2% SDS 溶液、2.0×10-5 mol/L MB 溶液以及1.0×10-3 mol/L TCEP 溶液备用;按照合成说明,加入适量 TE 缓冲液配制成100 mmol/L DNA 合成液,4 ℃或-20 ℃冷冻保存。
牛(Bos Taurus)、羊(Ovis aries)、猪(Sus scrofa)、鸡(Gallus gallus)COI 基因序列信息来源于:BOLD(NCBI)、Public Data Portal(CBOL)和参考文献[18-19];特异性引物通过 Nucleotide BLAST 和Primer 3设计以及筛选;所用通用引物参见文献[20]。依次开展定性 PCR 扩增反应液配制、反应条件设定以及扩增产物的琼脂凝胶电泳实验。PCR 扩增实验中所用序列均由上海生工公司合成。
本实验采用的是探针自组装的操作方式。(1)在使用前用1.0×10-3 mol/L TCEP 溶液对DNA探针进行前处理,其中探针溶液和 TCEP 溶液的使用比率为1∶9(V/V),探针通过其5′端二硫键和丝网印刷电极的金表面进行功能化连接,室温孵育12 h;然后用0.2% SDS 溶液和 PBS 缓冲液(pH 7.4)反复冲洗后晾干丝网印刷电极;最后置于 ME 溶液(1mmol/L)中,避光处理1 h后用 PBS 缓冲液(pH 7.4)和超纯水清洗表面,备用;(2)探针序列与靶序列的特异性杂交:用 TE 缓冲液将目标序列溶液稀释,将处理好的电极浸入对应的目标 DNA 溶液(20 μL)中,用恒温水浴锅(45 ℃)孵育1 h,即可完成探针与目标序列的特异性杂交。反应结束后,用 PBS 缓冲液及超纯水反复冲洗电极表面,室温自然晾干,备用;(3)对传感器电流信号值的读取分析:将处理后的电极浸入在 MB 溶液(2.0×10-5 mol/L,50 μL)中置于混匀振荡器上20 min,帮助 MB 增加嵌入量;再将电极处于 PBS 缓冲液中,轻柔摇晃5 min后反复冲洗晾干。便携式电化学工作站安装好后,将电极转入至PBS缓冲液中,并在SWV模式下进行电化学检测。
由于禽肉和畜肉的条形码技术在国内还处于起步阶段,在肉品物种鉴定研究中,不同物种的“商标条形码基因”仍未统一确定。因此,需要根据常见食用性肉品的不同物种进行初步筛选和电泳确证,为后续特异性探针的设计提供参考。2004年成立的生命条形码联盟(the Consortium for the Barcode of Life, CBOL)是物种分类条形码的权威机构组织,通过其 Public Data Portal 基因库,检索鸡肉、羊肉、猪肉、牛肉等相关4个代表性物种的 DNA 条形码序列并进行引物设计,进行扩增以及扩增产物的凝胶电泳实验,通过凝胶成像仪对条带进行分析。
如图3所示,当使用 DL2000 DNA Marker 时,生鸡肉(条带1~3)、生羊肉(条带4)、生猪肉(条带5)、生牛肉(条带6)的线粒体 COI 基因经 PCR 扩增后的产物大小分别为150、210、200和230 bp,扩增结果与 Primer 3 系统预估产物长度(依次为:153,200,193,225 bp,)基本吻合且条带重现性好。通过参考田晨曦等[21]设计的通用引物,对4条靶序列进行定性 PCR 扩增实验和琼脂糖凝胶电泳。
M-DL2000 DNA Marker;1~3-鸡源性DNA扩增产物;4~6-分别为羊源性、猪源性和牛源性DNA扩增产物;7-空白对比
图3 鸡肉、羊肉、猪肉、牛肉COI基因经PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.3 PCR-amplificated mt COI gene amplicons were analyzed by agarose gel electrophoresis
如图4所示,当使用100 bp DNA Ladder(Dye Plus)时,生牛肉、生羊肉、生猪肉的 COI 基因经 PCR 扩增后的电泳条带清晰且可重复性高;鸡肉的扩增产物大小为920 bp,但电泳条带较模糊(如图4-d所示),说明该部分采用的通用引物对物种G. gallus的 COI 基因特异性结合较弱。结果说明,所选 COI 基因序列具有高度保守区,有明显物种代表性,基本符合 DNA 条形码技术对理想标准条形码的要求,可以作为后续实验设计的靶标序列。
a-牛基因扩增产物(890 bp); b-羊基因扩增产物(530 bp);c-猪基因扩增产物(600 bp);d-鸡基因扩增产物(920 bp)
图4 四种生肉COI基因的PCR扩增产物电泳结果
Fig.4 PCR-amplification of mitochondrial COI gene
本实验分别对4种生肉品(鸡肉、猪肉、牛肉和羊肉)的 COI 基因序列进行分析,分析浓度范围为1.0×10-13~1.0×10-5 mol/L的4种合成靶标序列在传感工作平台上的响应电信号变化,继而建立各自 DNA 浓度(log C)与电化学指示剂 MB 还原电流差异变化(ΔI)间关系的曲线(如图5所示)。
根据结果可以得知,在前期优化的电化学条件下,靶标序列浓度范围在10-13~10-5 mol/L时,与还原峰电流差异ΔI(nA)呈现良好的线性关系,其线性方程分别为:鸡肉的线性方程为ΔI=580.999 83+8 333.078 9 log C,线性相关系数为0.806 17;羊肉的线性方程为ΔI=203.125+6 658.12 log C,线性相关系数为0.786 77;猪肉的线性方程为ΔI=391.25+5 482 log C,线性相关系数为0.987 4;牛肉的线性方程为ΔI=720.625+10 521.45 log C,线性相关系数0.9613 6。
由于 COI 基因在线粒体基因组中,有时不会选用 AUG 或其中一种公认的翻译规则来替代起始密码子,而会经常使用未知方法来启动翻译,这种不寻常行为的频率以及潜在的分子机制尚不清楚[22],这给 COI 基因的研究工作增添了许多难度,对相关的检测结果也有较难预期的影响。从实验结果来看,猪肉和牛肉关系曲线的线性相关性较好。对无靶标序列修饰的电极进行10次平行 SWV 检测,得到ΔI均值与标准偏差,再分别依据上述猪肉和牛肉的线性方程斜率求得相应的浓度值,因此,计算得出生猪肉检测限为3.491×10-14 mol/L,生牛肉的检测限为5.048×10-14 mol/L。因此,构建的 COI-丝网印刷电极传感器,能够快速、简便完成检测工作,同时拥有较宽的检测范围,以及较低检测限,能够满足市场对食品质量掺假的便携、灵敏的检测要求。
图5 猪肉、羊肉、牛肉和鸡肉COI基因序列梯度浓度对数值与MB杂交前后还原电流差异变化关系曲线(n=3)
Fig.5 Relationship between logarithm of gradient concentration of raw meat and the difference of reduction current for MB hybridization (n=3)
为了进一步探究以牛源性修饰探针为生物识别元件与丝网印刷电极进行固定后构建的传感器的可行性,将从大型超市购买的生猪肉和生牛肉搅碎均质制成肉泥;再将肉泥制备成不同比例的混合肉样模型;提取混合样品 DNA,并进行纯度浓度检测,备用;用 TE 溶液统一配制成浓度为 10-5 mol/L 的靶标溶液,将探针与丝网印刷电极进行一系列组装和孵育,然后对生猪肉/牛肉混合二元物模型进行电化学传感检测分析。
如图6所示,不同质量的混合肉品提取的 DNA 与牛源性探针杂交后,通过电化学指示剂亚甲基蓝的嵌入,杂交信号可以成功转化为电流信号。取50 ng混合样品时,杂交特异性最强,随着混合生肉品的质量减少,亚甲基蓝的电流信号稳定性逐渐降低,图形开始出现波动,出现该种情况的原因可能是由于目标序列的浓度逐渐减少,在电极工作表面同探针进行特异性结合的 ssDNA 也随之减少,使得 MB 有效嵌入量减少,故最终电化学信号降低也较显著。
a-靶标DNA取自50 ng混合肉样; b-靶标DNA取自30 ng混合肉样; c-靶标DNA取自20 ng混合肉样
图6 生牛肉中分别掺入质量分数100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 3%, 1%和0.1%生猪肉时DNA检测的峰值电流与掺混比例的对应图
Fig.6 Peak current versus adulteration ratio of bovine DNA consisting 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 3%, 1% and 0.1% (w/w%) of porcine DNA, respectively
从图6可以得出,当混合生肉量为50 ng时,靶标 DNA 与探针特异性结合后,指示剂 MB 的电信号更加稳定;同时,虽然靶标 DNA 的浓度不同,但是从最终的电信号峰值来看,除掺混比例25%的数据普遍有点异常有待进一步探明原因外,方法对混合二元物的识别能力几乎不受掺假比例影响。
综上可知,利用牛源性物种 Bos gruuniens的 COI 基因设计的特异性探针,经过适当的修饰,构建COI-丝网印刷电极传感平台用于识别生猪肉/牛肉的混合二元物掺假是可行的,这为实际生猪肉/牛肉掺假或因非人为因素偶然携入的检测工作提供了新的研究思路。
聚合酶链式反应(traditional PCR)是现阶段应用最广泛的生物分子定性技术之一。在常见的食品掺假事件中,为了达到定量肉品掺假的鉴别要求,发展出了第二代 PCR 技术,其中实时 PCR 或荧光PCR技术(Real-time PCR, RT-PCR)是现在肉类掺假鉴别的主流技术,也是现阶段国内许多检测机构公认的定量检测手段。为了更好地体现本工作中首次构建的基于动物线粒体 COI 基因的电化学传感平台的检测优势,本文对该技术与实时PCR技术进行了小结和比较(如表1所示)。
表1 电化学传感技术与实时定量PCR检测技术比较
Table 1 Comparison of electrochemical sensing technology and RT-PCR detection technology
对比项本课题构建的电化学传感器实时PCR技术仪器成本40000元/套150000元/台耗材成本3200元/400次450元/100次配套设备占地少;自带处理软件;便携高通量;自带处理软件响应时间15min45min识别比例大于3%大于3%
通过2种检测方法的比较可知,实时 PCR 技术和电化学传感技术均可以完成对生猪肉/牛肉混合二元物的鉴定工作,前者现阶段运用成熟,但是后者在仪器成本、配套设施、响应时间等方面更具分析优势,也更加适合低比例掺假和现场快速检测要求,故在肉品真伪鉴别中具有较大的市场开发潜力。
为了快速便捷的实现肉品真伪鉴别,本文首次以动物线粒体COI基因为识别元件,以一次性丝网印刷生物传感器为器件,成功搭建鉴别猪肉和牛肉混合二元物的电化学传感检测平台,检测可免去复杂的分子扩增中间实验、成本更低、操作技术更加简便化,具有良好的鉴别灵敏度和商业应用前景,是目前主流的实时PCR技术的重要补充。本文所介绍的丝网印刷电极电化学传感技术也可为动物 COI 基因条形码相关研究提供新的思路和数据支持。
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