啤酒酿造过程中酵母胞内有机锌与风味代谢物质的相关性

酵母作为啤酒酿造的四大原料之一，其发酵过程可赋予啤酒独特的风味和口感，同时优良性能的酵母亦是保证啤酒质量稳定的重要前提[1-2]。锌作为啤酒酿造中的无机微量金属离子，对促进酵母细胞内生化反应的进行起着重要作用。研究发现，在酵母生长过程中，锌离子主要分为酵母总锌和酵母胞内有机锌[3-4]，其中酵母总锌指吸附于酵母细胞表面的无机锌离子，必须与有机配位体螯合后才能进一步为机体所吸收利用，而经与蛋白螯合后的有机锌由于更接近于机体内的作用形式被称为酵母胞内有机锌，其生物学价值和可用性也远远高于无机锌[5-6]。

啤酒酿造过程中，酵母胞内有机锌可有效地促进酵母菌体的生长繁殖、加速蛋白质和维生素的合成[7-9]。锌离子作为α-淀粉酶和磷酸酶的激活剂，可提高α-淀粉酶和磷酸酶的活性，进而提高淀粉的分解速度，缩短糖化时间；有机磷酸盐在磷酸酶的分解下产生磷酸，可进一步改善醪液的缓冲性，使各种酶系在适宜的pH范围内发挥作用[10-11]。同时锌离子作为啤酒中泡沫的促进剂，还能起到增强啤酒泡沫的强度，提高啤酒非生物稳定性的作用[12]。

啤酒风味物质是啤酒酿造过程中由于酵母代谢而产生的一系列挥发性和非挥发性物质的总称，构成了啤酒特有的香味和口感[13]。目前国内外学者关于酵母代数、批次、品种及接种量对酵母发酵过程中风味物质的影响已有较多的研究[14-18]，而锌离子作为促进挥发性酸、醛类以及双乙酰等物质产生的重要金属离子，其对风味代谢物质的影响还鲜有报道。本文从啤酒酵母菌株YJ02出发，探究不同传代次数和外源添加锌离子对酵母胞内有机锌的影响，并进一步对酵母菌株YJ02代谢过程中挥发性物质进行检测，以期阐明酵母胞内有机锌与风味代谢物质的相关性，为酵母发酵过程中风味物质的控制提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验菌种及材料

啤酒酵母菌株YJ02，保藏于北京燕京啤酒股份有限公司技术中心酵母菌种保藏室。

13 °P麦汁，北京燕京啤酒股份有限公司糖化车间生产；酵母泥，北京燕京啤酒股份有限公司酿造车间发酵罐种酵母泥。

1.2 试剂与仪器

ZnSO4、pH 6.5 10mmol/L EDTA溶液、葡萄糖、丙酮等,国药集团化学试剂有限公司。

NexlON电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)，Perkin-Elmer仪器有限公司；Alpha2-4真空冷冻干燥机，德国Martin Christ公司；7697A-7890B气相色谱仪，Agilent Technologies公司；MVS-1漩涡混合仪，北京金水德工贸有限公司；FE 28 pH计，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；JB-3A恒温定时搅拌器，上海雷磁创益仪器仪表有限公司；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 不同锌离子含量麦汁的制备

取糖化车间煮沸前麦汁(未添加ZnSO4)，加热煮沸1 h后加入20 g/L硅藻土(粗细比例为1∶1)进行过滤，并于115 ℃下灭菌20 min，待无菌麦汁冷却后进一步使用无菌滤纸过滤以去除麦汁中冷凝固物，并检测滤液中的锌离子含量。同时将处理后的麦汁分装至三角瓶中，按照不同梯度添加过滤除菌的ZnSO4溶液使麦汁中锌离子含量分别为0.2、0.4、0.6、1.4、3.4 mg/L。

取不同浓度梯度下500 mL麦汁进行三角瓶发酵，每天进行摇瓶称重追踪CO2失重量，当CO2失重量小于0.2 g时进行相关指标的检测。

1.3.3 相关指标测定

1.3.3.1 酵母活力

参考应用酵母活力值评价啤酒生产酵母的发酵性能[19]的方法在发酵结束后收集酵母泥进行检测。

1.3.3.2 酵母总锌

发酵结束后于4 ℃、4 000 r/min条件下离心10 min，重复3次后收集酵母泥，使用纯水和pH 6.5 10 mmol/L EDTA溶液各洗涤1次后，于8 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min，弃取上清液收集酵母细胞，120 ℃下烘干至恒重并使用ICP-MS进行检测。

1.3.3.3 酵母胞内有机锌

在发酵结束后收集酵母泥，分别使用纯水和pH 6.5 10 mmol/L EDTA溶液洗涤后于4 ℃、6 000 r/min条件下离心1 min，弃去上清液后于沉淀中加入氧化锆研磨珠和100 μL纯水进行旋涡振荡破碎；收集破碎酵母细胞提取液，并加入700 μL纯水混匀，4 ℃离心10 min后收集上清液，并重复以上步骤共计5次；合并离心后的上清液并添加等体积的丙酮(-20 ℃预冷)，混合均匀后于-20 ℃放置2 h，4 ℃离心10 min，弃去上清液得到酵母胞内蛋白沉淀；将酵母胞内蛋白沉淀通风干燥10 min后加入2 mL超纯水，真空冷冻干燥24 h以彻底去除水分和残留的丙酮，收集冻干后的酵母胞内蛋白(胞内有机锌以与蛋白螯合的形式存在)，消解后使用ICP-MS检测。其中酵母破碎率计算公式如下：

1.4 数据处理

用Excel 2019对数据进行处理和作图，用SAS V8对数据进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 研磨珠对酵母破碎率的影响

由于研磨珠的型号和材料对酵母破碎率有较大影响，本试验分别选用不锈钢和氧化锆2种材料的研磨珠，探究0.5和1.0 mm研磨珠对酵母菌株YJ02破碎率的影响，结果如表1所示。

由表1可知，对于不锈钢材料的不同型号的研磨珠，其破碎率分别为33.7%和33.3%，差别不大，而对于氧化锆研磨珠，0.5 mm研磨珠对酵母菌株YJ02破碎率明显高于1.0 mm研磨珠，也高于不锈钢研磨珠，因此综合比较后选用0.5 mm氧化锆研磨珠用于后续酵母菌株YJ02胞内有机锌的提取，研磨效果如图1-c所示。

2.2 胞内有机锌在传代过程中的变化

追踪酵母菌株YJ02不同代数下的酵母活力、酵母总锌和酵母胞内有机锌的变化情况，统计分析结果如图2所示。

对酵母菌株YJ02不同代数下的酵母活力、酵母总锌和酵母胞内有机锌的变化情况进行相关性分析，结果如表2所示。

对比同一发酵车间下不同酵母菌株YJ02代数的酵母活力、酵母总锌和胞内有机锌可以发现，随着酵母菌株YJ02传代次数的增加，酵母活力整体呈现先上升后下降的趋势，这是由于传代初期，酵母菌株YJ02在进入新的环境中存在一定适应阶段，故其整体活力增长速度较慢，随后由于麦汁为酵母菌株YJ02生长提供了充足的营养物质，促使酵母活力快速提高，随着传代次数的进一步增加，酵母菌株YJ02会逐渐衰老死亡，甚至出现自溶或者变异等现象，同时由于实际生产过程中，在传代后期会出现其他杂菌污染的情况，因此导致酵母菌株YJ02活力呈现逐渐下降的趋势，这也与董霞等[20]研究结果一致。结合图2和表2可以发现，酵母总锌的含量随传代次数的增加呈现逐渐上升的趋势，与传代次数有极显著的相关性(P<0.01)，而酵母胞内有机锌则在一定范围内波动，与酵母菌株YJ02传代次数无明显相关性，这说明在酵母菌株YJ02传代过程中酵母总锌含量是随着传代次数的增加而不断进行累积，但酵母菌株YJ02实际可利用的有机锌含量则是一定的，在传代后期并不会随着酵母活力和传代次数的变化而发生变化。

2.3 不同麦汁锌离子添加对酵母胞内有机锌的影响

对发酵过程中不同锌离子含量麦汁内CO2失重进行追踪，结果如图3所示。不同锌离子含量下发酵的CO2失重量高峰期及发酵结束时间相近，0.2 mg/L的锌离子含量下发酵高峰期失重量显著低于其他浓度，说明较高锌离子含量对酵母菌株YJ02发酵速率的影响不大，但过低的锌离子含量会导致高峰期CO2失重量降低。

于麦汁中添加不同浓度锌离子后对酵母活力、酵母总锌和酵母胞内有机锌含量的变化进行统计分析，结果如图4所示。

对不同锌离子含量麦汁发酵过程中酵母活力、酵母总锌和酵母胞内有机锌含量的变化进行相关性分析，结果如表3所示。

由图4可以发现，随着麦汁中锌离子浓度的增加，酵母活力呈现先上升后下降的趋势，这说明在麦汁中添加低浓度的锌离子可有效地促进酵母菌株YJ02生长繁殖，提高酵母活力，但麦汁中锌离子浓度过高时，亦会对酵母的生长产生毒害作用，从而降低酵母活力，这也与蒋虹等[21]研究结果一致。酵母总锌随着麦汁中锌离子浓度的增加逐渐上升，而酵母胞内有机锌则先上升后趋于平稳，说明随着外界锌离子的不断增加，酵母表面的无机锌不断富集；当锌离子添加量小于0.6 mg/L时，酵母菌株YJ02生长实际可利用的有机锌随着外界锌离子的增加而不断增长，当麦汁中锌离子添加量为0.6 mg/L时，酵母胞内有机锌含量达到最大值，此时酵母活力也最强，随后当麦汁中锌离子含量继续增加时，酵母胞内有机锌含量仍然维持在80～95 mg/kg蛋白之间，说明发酵过程中酵母菌株YJ02实际可利用的有机锌含量是有限的，并不会随着外界锌离子添加量的增加而不断发生变化。在实际生产过程中酵母胞内锌含量维持在60～95 mg/kg的水平对酵母菌株YJ02活力最有利，此时麦汁中的锌离子含量应保持在0.4～1.4 mg/L。

2.4 胞内有机锌与风味代谢物质相关性研究

发酵结束后对酵母胞内有机锌与酵母菌株YJ02代谢过程中相关风味指标进行相关性分析(n=15)，结果如表4所示。酵母胞内有机锌的含量与乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯及辛酸乙酯呈极显著正相关(P<0.01)，与乙酸乙酯呈显著正相关(P<0.05)，与甲醇、异丁醛呈极显著负相关(P<0.01)，与醇酯比呈显著负相关(P<0.05)，表明酵母胞内有机锌含量的增加可以有效的促进酯类的生成，同时一定程度降低醛类、醇类的生成，从而降低醇酯比，这也与宋丹等[22]研究结果一致。酵母胞内有机锌与二甲基硫呈极显著正相关(P<0.01)，可能是由于而麦汁中添加少量锌离子可有效的促进酵母菌株YJ02发酵，从而促进了二甲基硫的产生[23]。由表4可以发现,酵母活力、麦汁锌离子浓度以及酵母总锌与酵母胞内有机锌相关性较弱，这也表明发酵过程中酵母菌株YJ02对锌离子的利用不仅受到锌离子添加量的影响，可能还受到其他因素的综合影响。

3 结论

研究结果显示，随着酵母菌株YJ02传代次数和发酵液外源锌离子含量的增加，酵母胞内有机锌均呈现先上升后趋于平稳的趋势，同时酵母胞内有机锌与大部分脂类代谢产物呈现显著正相关，与醛类、醇类呈现显著负相关。结果表明酵母利用有机锌的能力是有限的，外加锌离子含量保持在0.4～1.4 mg/L范围内时对酵母菌株YJ02生长最有利，且酵母胞内有机锌可以有效地促进酯类物质的合成，并在一定程度降低醛类和醇类物质的生成，可为后续酵母发酵过程中风味物质的研究与控制提供新的参考。

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