活性氧(reactive oxygen species, ROS)主要包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧等[1-2]。据报道,ROS在参与细胞信号转导和维持稳态的生理过程中具有重要作用[3]。在正常生理条件下,ROS能被机体快速有效地清除;但在病理条件下,可能会出现ROS清除不及时的情况,这种情况会对细胞、机体造成氧化损伤[4-5]。而氧化损伤又与许多疾病如癌症、动脉粥样硬化、心血管疾病等相关[6-8]。核转录相关因子(nuclear related factor 2, Nrf2)是重要的转录因子,在氧化应激情况下与Kelch样ECH联合蛋白质1解离,进入胞质并启动Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因(如NQO1、HO-1)的表达,增加细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性[9]。PI3K是Nrf2的上游调节因子,抑制PI3K,会阻断Nrf2的核易位及诱导应激蛋白质表达,因此PI3K在维持细胞氧化还原状态方面也起到重要作用[10]。
白酒是由高粱等谷物经蒸煮等多个过程制得。中医认为白酒可活血通脉、助药力、增进食欲、消除疲劳,而且还有健脾胃的功效[11]。虽有大量研究表明,酗酒会对机体造成损伤,但同时也有研究显示,适量饮用白酒对人体健康有一定益处[2, 12]。白酒成分复杂,与人体健康的关系尚不明确。据文献报道,白酒中含有多种抗氧化性物质,如有机酸、酚类、吡嗪类化合物、含硫及萜类化合物等[13-14],但由于乙醇及水的存在及分离困难等原因,人们对白酒相关生物活性物质研究较少。本实验通过萃取、冷冻干燥的方式获得酱香型白酒中的非乙醇物质(MLE),并对其进行了抗氧化活性研究,以期解释酱香型白酒中生物活性物质的抗氧化活性功能,从而为功能型白酒的调配奠定基础。
人肝癌HepG2细胞,中国科学院上海细胞生物研究所;酱香型白酒,贵州茅台集团;胎牛血清-FBS,中国杭州四季青生物技术有限公司;活性氧检测试剂盒、细胞裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、Trizol、RT-PCR相关试剂,碧云天生物技术研究所;SOD、MDA、GSH-PX等相关测试盒,南京建成生物工程研究所;ExScript TM RT-PCT kit试剂盒, TaKaRa公司;其他试剂为分析纯或标准品,阿拉丁试剂有限公司。
SW-CJ-IC型超净工作台、INCO2108型CO2培养箱,德国Thermo Fisher Scientific公司;TECAN infinite M200多功能酶标仪,德国TECAN公司;2K15型低温高速离心机、3-30K高速台式冷冻离心机,美国Sigma公司;Waters R2487高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC),美国Waters公司;液质联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC/MS),美国Agilent Technologies公司;Ultra-Turrax组织匀浆器,德国IKA公司;Epics Altra型流式细胞仪,美国Beckman公司;定量PCR仪,美国Bio-RAD公司。
1.3.1 MLE的分离及组成分析
250 mL分液漏斗中加入50 mL酱香型白酒、30 mL水和100 mL氯仿,振荡摇匀,静置,分离氯仿层,重复3次,合并氯仿层。用旋转蒸发仪(0 ℃)除去氯仿获得有机层化合物。真空冻干机冻干水层,获得水层化合物,合并氯仿层及水层化合物即为MLE,LC/MS检测结果显示MLE中不含氯仿中所含的杂质,将MLE在-20 ℃避光保存,HPLC-MS分析方法参考相关文献[13]进行。
1.3.2 细胞培养及实验分组
3×105 个/mL HepG2细胞接种于体积分数10% FBS、100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素的DMEM(高糖)培养基中(pH 7.2),37 ℃、体积分数5% CO2条件下孵育,培养液隔日更换。
实验分为正常对照组、H2O2模型损伤组、53°酱香型白酒组、V(乙醇)∶V(水)=53∶47、MLE组及MLE成分组。将处于对数生长期、状态良好的细胞接种于培养板中孵育24 h;待细胞生长稳定后,实验组加入100 μg/mL溶于PBS的53°酱香白酒、V(乙醇)∶V(水)=53∶47、MLE和MLE成分,正常对照组、H2O2模型损伤组加入等量的PBS缓冲液,孵育6 h;弃去培养液,H2O2模型损伤组及实验组加入含有100 μmol/L H2O2的PBS缓冲液,正常对照组加入等体积的PBS缓冲液,孵育4 h,CCK8(cell counting kit-8)检测细胞增殖能力[15]。
将处于对数生长期、状态良好的细胞从105个/mL的浓度接种于96孔板上,共接种36个孔孵育24 h;待细胞生长稳定后,实验分组情况如下:①正常对照组;②H2O2模型损伤组;③53%vol酱香型白酒组;④53%乙醇组(体积分数);⑤MLE组;⑥MLE-10组。③、④、⑤、⑥组每孔分别加入100 μL溶于PBS的53°酱香型白酒、体积分数53%乙醇、MLE、MLE-10溶液,浓度均为0.248 mg/mL,①、②组每孔加入100 μL的PBS缓冲液;孵育6 h后,弃去培养液;②、③、④、⑤、⑥组加入100 μL浓度为100 μmol/L的H2O2溶液,①组加入等体积的PBS缓冲液;孵育4 h后每孔加入100 μL培养基和20 μL 5 g/L的MTT并温育4 h,去除培养液及cck-8,每孔加入200 μL PBS缓冲液,酶标仪测定570 nm吸光度。
1.3.3 检测MLE对细胞ROS、抗氧化酶的影响
实验分组同cck-8法检测细胞存活率,取对数生长期细胞,从104个/mL密度接种于96孔板培育24 h,加药物孵育6 h,弃上清液,加100 μmol/L H2O2孵育4 h,然后按试剂盒说明书检测ROS及GPx、SOD、MDA等的水平。
总RNA提取和cDNA的合成分别应用Total RNA提取试剂盒和两步法cDNA合成试剂盒,依试剂盒说明书进行操作。根据GenBank中NQO1、HO-1、PI3K、Nrf2和β-actin mRNA序列,利用Premier 5.0 设计荧光定量PCR引物。
实时荧光定量PCR采用SYBR Green I染料法,按照ExScript TM RT-PCR Kit试剂盒操作说明书在定量PCR仪进行。采用总反应体积10.0 μL体系:SYBR-Premix Ex TaqTM Ⅱ 5 μL,引物(10 μmol/L)2.0 μL,cDNA模版1.0 μL,双蒸水2.0 μL。PCR反应条件:95 ℃变性200 s,95 ℃反应25 s,65 ℃反应25 s,72 ℃反应20 s,72 ℃作用120 s,荧光检测72 ℃ 10 s,40个循环。表达水平用相对定量的方法,采用2-ΔΔCt进行计算[16]。
采用SPSS 18软件进行统计。阴性对照和阳性对照采用独立样本t检验,对MLE处理效应进行回归分析。P<0.05定为具有显著性差异,结果均以Mean±SEM表示。
50 mL白酒经萃取、冷冻干燥,最终获得MLE 0.35 mg。经HPLC-MS分析,MLE多为多元醇、不饱和脂肪酸及其酯类化合物、吡嗪类化合物及含有苯环的芳香族化合物,选出其中含量较多的16种化合物(表1)及MLE进行体外抗氧化活性研究。
取0.10 mg/mL化合物(表1)预处理细胞6 h后,加入100 μmol/L H2O2培养4 h,CCK8检测细胞增殖能力。相比于正常对照组(细胞增殖能力设为100%),H2O2组细胞增殖能力显著下降(83.3%, P<0.05)。分析实验结果发现,部分化合物可显著抑制由H2O2诱导引起的细胞增殖能力减弱的现象(表1)。MLE-7、MLE-9、MLE-10及MLE-15与HepG2细胞共培养6 h后,细胞增殖能力分别比H2O2组高6.40%、8.80%、13.2%及10.9%。而细胞与MLE-2、MLE-3、MLE-8及MLE-14共培养后,细胞增殖能力与H2O2组相比分别降低了7.00%、10.7%、11.0%及10.6%。因此,选择MLE-10与MLE进行抗氧化活性研究。
表1 MLE中相关化合物浓度及对HepG2细胞增殖能力的影响
Table 1 Concentrations of compounds in the MLE and effects on proliferation of HepG2 cells
编号化合物含量/(μg·L-1)存活率/%MLE-1长叶烯9.9890.1±2.95MLE-2苯甲醛26.876.3±3.03MLE-3苯甲醇10.972.6±2.75MLE-4α-雪松醇16.884.1±3.80MLE-5β-榄香烯23.585.2±5.21MLE-6α-呋喃甲醇33.585.5±4.63MLE-7四甲基吡嗪25.689.7±2.35MLE-8苯乙酸乙酯33.272.3±4.45MLE-95-甲基-2-糠醛28.992.1±2.21MLE-102-乙酰基-5-甲基呋喃19.696.5±2.36MLE-113,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇26.884.6±6.62MLE-122,6-二甲基-2,6-辛二烯-8-醇21.383.9±4.92MLE-136,10-二甲基-5,9-十一烯-2-酮26.283.1±3.68MLE-14(S)-2-异亚丙基-5-甲基环己酮26.872.7±3.67MLE-155-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮11.894.2±3.67MLE-164-(2,6,6-三甲基-1-环己烯基)-3-丁烯-2-酮66.583.9±5.53MLE--89.7±6.31酱香型白酒--76.9±7.06乙醇(53%)--74.2±4.91H2O2--83.3±2.42
注:“-”表示编号代表的物质为混合物。
实验分为:①正常对照组;②H2O2模型损伤组;③53%vol酱香型白酒组;④V(乙醇)∶V(水)=53∶47;⑤MLE组;⑥MLE-10组。为便于比较,将正常对照组数值设为1,其他组为相对值。
图1-A结果显示,相比于正常组相比,经H2O2组细胞存活率降低14.4%(P<0.05)。与H2O2组相比,MLE、MLE-10处理后细胞存活率分别上升5.80%、10.6%。相比于正常组,白酒、乙醇组细胞存活率分别下降17.7%、21.7%,低于H2O2组。说明白酒和乙醇会降低细胞抗H2O2氧化损伤能力,使细胞存活率降低。
MLE对细胞内ROS的影响如图1-B所示,与正常组相比,H2O2刺激后,细胞内ROS升高338% (P<0.05)。而MLE、MLE-10处理后,与H2O2组比较,细胞内ROS分别下降24.7%、47.9% (P<0.05),细胞清除ROS能力显著增强。而白酒、乙醇组的ROS却高于H2O2组,推测是乙醇与H2O2协同降低了HepG2细胞清除ROS的能力。
A-细胞存活率;B-ROS
图1 MLE对HepG2细胞增殖及细胞内ROS含量的影响
Fig.1 Effects of MLE on proliferation and ROS level in HepG2 cells
注:与正常对照组比较,#表示差异显著(P<0.05),与H2O2模型损伤组比较,*表示差异显著(P<0.05)。
实验分为:①正常对照组;②H2O2模型损伤组;③53°酱香型白酒组;④V(乙醇)∶V(水)=53∶47;⑤MLE组;⑥MLE-10组。为便于比较,将正常对照组数值设为1,其他组为相对值。
由表2可知,H2O2刺激HepG2细胞后,GST、MDA的含量显著升高(P<0.05),GPx、SOD、CAT活性出现明显降低,且GSH含量也显著降低。经MLE、MLE-10处理后,GST、MDA的含量降低(P<0.05),GPx(P<0.05)、SOD、CAT活性明显增强。不同于MLE、MLE-10可增强HepG2抗氧化损伤的作用,酱香型白酒及同浓度乙醇组的GST、MDA的含量反而高于H2O2组,而GPx、SOD、CAT活性则低于H2O2组。推测可能是组分中乙醇对细胞具有一定的氧化损伤作用导致的。
实验分为:①正常对照组;②H2O2模型损伤组;③53°酱香型白酒组;④V(乙醇)∶V(水)=53∶47;⑤MLE组;⑥MLE-10组。为便于比较,将正常对照组数值设为1,其他组为相对值。
如图2所示,用H2O2刺激HepG2细胞后,与对照组相比,HO-1、NQO-1、Nrf2及PI3K基因表达显著降低(P<0.05)。MLE-10处理后,其表达明显提高(与H2O2模型损伤组比较,P<0.05)。实验结果说明,H2O2可导致HepG2细胞相关抗氧化基因的表达下降。而MLE、MLE-10可抑制H2O2所致的抗氧化基因表达下调,使之恢复,并接近正常水平。
表2 MLE对HepG2细胞内GPx、SOD、CAT、GSH、GST及MDA的影响
Table 2 Effects of MLE on GPx, SOD, CAT, GSH, GST and MDA in HepG2 cells
分组GPxSODCATGSHGSTMDA①1.00±0.111.00±0.091.00±0.051.00±0.071.00±0.071.00±0.04②0.54±0.04#0.61±0.07#0.38±0.03#0.41±0.05#2.65±0.28#4.75±0.51##③0.42±0.03#0.55±0.06#0.31±0.03#0.33±0.02#2.73±0.28#5.11±0.55##④0.23±0.01##0.37±0.04#0.19±0.01##0.20±0.02##3.13±0.35#6.25±0.56##⑤0.74±0.05∗0.71±0.040.55±0.060.59±0.07∗2.01±0.223.37±0.37∗⑥0.94±0.06∗0.89±0.06∗0.81±0.07∗0.79±0.06∗1.38±0.14∗2.16±0.02∗
注:与正常对照组对比,#表示差异显著(P<0.05),##表示差异极显著(P<0.01),与H2O2模型损伤组比,*表示差异显著(P<0.05)。
图2 MLE对H2O2处理HepG2细胞HO-1、NQO-1、Nrf2及PI3K基因表达的影响
Fig.2 Effects of MLE on HO-1, NQO-1, Nrf2 and PI3K gene expressions in HepG2 cells
注:与正常对照组对比,#表示差异显著(P<0.05),与H2O2模型损伤组比较,*表示差异显著(P<0.05)。
氧化应激是体内氧化和抗氧化水平失去平衡的结果,过量的活性氧会引起分子、细胞和机体的损伤[17]。大量研究表明,氧化应激是代谢综合征发生和发展及一些疾病发生的重要病因之一[18-19]。在肝炎、酒精肝等多种肝病中,氧化应激是它们共同的损伤机制[20]。H2O2可直接转变为·OH作用于肝细胞,引起细胞氧化损伤[21]。大量研究表明,酒精及其代谢产物会对机体造成一定的损伤,尤其是对消化系统。不同于伏特加等蒸馏酒,酱香型白酒是一种由谷物发酵(如高粱等)经蒸煮等多种过程而得的蒸馏酒,它在含有酒精的同时还含有大量生物活性物质。实验结果显示,酱香型白酒中含有多种酯类、不饱和烯醇及含有苯环的芳香族化合物。其中化合物MLE-10(2-乙酰基-5-甲基呋喃)能显著增强细胞抗H2O2造成的氧化损伤。进一步实验证明,MLE及MLE-10可提高细胞Nrf2及其上游调控因子PI3K及下游Ⅱ相酶基因NQO1和HO-1的表达,进而提高细胞内SOD、GPx等抗氧化酶活性,降低MDA产生,增强细胞清除自由基能力,进而发挥抗氧化作用[22]。但是,与相关研究结果类似,酒精组及白酒组细胞抗氧化能力降低、相关抗氧化酶活性低于H2O2组,说明乙醇降低了细胞的抗氧化损伤能力。
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