酱香型白酒中活性成分的抗氧化活性

罗强,刘杰,刘志刚*

(深圳大学 医学部,广东 深圳,518000)

摘 要 为研究从酱香型白酒中分离出的活性成分(maotai-flavor liquor xtract, MLE)是否具有保护氧化损伤作用及其机制,该文采用萃取及冻干的方法获得MLE,通过HPLC-MS分析其组成,并用H2O2刺激HepG2细胞建立氧化损伤模型,检测MLE对氧化损伤模型中细胞增殖能力和细胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的影响以及对相关抗氧化酶及抗氧化基因的影响。结果表明:MLE处理细胞后,其ROS清除能力及增殖能力明显增强;H2O2刺激细胞会引起谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)的活性降低,同时导致还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)的降低,氧化型谷胱甘肽(Glutathiol, GST)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的增加,而MLE可以逆转这些过程,使损伤细胞内抗氧化基因NQO-1、PI3K的表达显著提高(P<0.05),可见MLE氧化保护功能与提高抗氧化酶的活性及细胞内相关抗氧化基因的表达有关。氧化损伤与多种疾病有关,而从酱香型白酒中分离出的活性成分为抗氧化提供了一种可能的方向。

关键词 酱香型白酒;MLE;HepG2细胞;抗氧化酶;抗氧化基因

活性氧(reactive oxygen species, ROS)主要包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧等[1-2]。据报道,ROS在参与细胞信号转导和维持稳态的生理过程中具有重要作用[3]。在正常生理条件下,ROS能被机体快速有效地清除;但在病理条件下,可能会出现ROS清除不及时的情况,这种情况会对细胞、机体造成氧化损伤[4-5]。而氧化损伤又与许多疾病如癌症、动脉粥样硬化、心血管疾病等相关[6-8]。核转录相关因子(nuclear related factor 2, Nrf2)是重要的转录因子,在氧化应激情况下与Kelch样ECH联合蛋白质1解离,进入胞质并启动Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因(如NQO1、HO-1)的表达,增加细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性[9]。PI3K是Nrf2的上游调节因子,抑制PI3K,会阻断Nrf2的核易位及诱导应激蛋白质表达,因此PI3K在维持细胞氧化还原状态方面也起到重要作用[10]

白酒是由高粱等谷物经蒸煮等多个过程制得。中医认为白酒可活血通脉、助药力、增进食欲、消除疲劳,而且还有健脾胃的功效[11]。虽有大量研究表明,酗酒会对机体造成损伤,但同时也有研究显示,适量饮用白酒对人体健康有一定益处[2, 12]。白酒成分复杂,与人体健康的关系尚不明确。据文献报道,白酒中含有多种抗氧化性物质,如有机酸、酚类、吡嗪类化合物、含硫及萜类化合物等[13-14],但由于乙醇及水的存在及分离困难等原因,人们对白酒相关生物活性物质研究较少。本实验通过萃取、冷冻干燥的方式获得酱香型白酒中的非乙醇物质(MLE),并对其进行了抗氧化活性研究,以期解释酱香型白酒中生物活性物质的抗氧化活性功能,从而为功能型白酒的调配奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝癌HepG2细胞,中国科学院上海细胞生物研究所;酱香型白酒,贵州茅台集团;胎牛血清-FBS,中国杭州四季青生物技术有限公司;活性氧检测试剂盒、细胞裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、Trizol、RT-PCR相关试剂,碧云天生物技术研究所;SOD、MDA、GSH-PX等相关测试盒,南京建成生物工程研究所;ExScript TM RT-PCT kit试剂盒, TaKaRa公司;其他试剂为分析纯或标准品,阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-IC型超净工作台、INCO2108型CO2培养箱,德国Thermo Fisher Scientific公司;TECAN infinite M200多功能酶标仪,德国TECAN公司;2K15型低温高速离心机、3-30K高速台式冷冻离心机,美国Sigma公司;Waters R2487高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC),美国Waters公司;液质联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC/MS),美国Agilent Technologies公司;Ultra-Turrax组织匀浆器,德国IKA公司;Epics Altra型流式细胞仪,美国Beckman公司;定量PCR仪,美国Bio-RAD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 MLE的分离及组成分析

250 mL分液漏斗中加入50 mL酱香型白酒、30 mL水和100 mL氯仿,振荡摇匀,静置,分离氯仿层,重复3次,合并氯仿层。用旋转蒸发仪(0 ℃)除去氯仿获得有机层化合物。真空冻干机冻干水层,获得水层化合物,合并氯仿层及水层化合物即为MLE,LC/MS检测结果显示MLE中不含氯仿中所含的杂质,将MLE在-20 ℃避光保存,HPLC-MS分析方法参考相关文献[13]进行。

1.3.2 细胞培养及实验分组

3×105 个/mL HepG2细胞接种于体积分数10% FBS、100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素的DMEM(高糖)培养基中(pH 7.2),37 ℃、体积分数5% CO2条件下孵育,培养液隔日更换。

实验分为正常对照组、H2O2模型损伤组、53°酱香型白酒组、V(乙醇)∶V(水)=53∶47、MLE组及MLE成分组。将处于对数生长期、状态良好的细胞接种于培养板中孵育24 h;待细胞生长稳定后,实验组加入100 μg/mL溶于PBS的53°酱香白酒、V(乙醇)∶V(水)=53∶47、MLE和MLE成分,正常对照组、H2O2模型损伤组加入等量的PBS缓冲液,孵育6 h;弃去培养液,H2O2模型损伤组及实验组加入含有100 μmol/L H2O2的PBS缓冲液,正常对照组加入等体积的PBS缓冲液,孵育4 h,CCK8(cell counting kit-8)检测细胞增殖能力[15]

将处于对数生长期、状态良好的细胞从105个/mL的浓度接种于96孔板上,共接种36个孔孵育24 h;待细胞生长稳定后,实验分组情况如下:①正常对照组;②H2O2模型损伤组;③53%vol酱香型白酒组;④53%乙醇组(体积分数);⑤MLE组;⑥MLE-10组。③、④、⑤、⑥组每孔分别加入100 μL溶于PBS的53°酱香型白酒、体积分数53%乙醇、MLE、MLE-10溶液,浓度均为0.248 mg/mL,①、②组每孔加入100 μL的PBS缓冲液;孵育6 h后,弃去培养液;②、③、④、⑤、⑥组加入100 μL浓度为100 μmol/L的H2O2溶液,①组加入等体积的PBS缓冲液;孵育4 h后每孔加入100 μL培养基和20 μL 5 g/L的MTT并温育4 h,去除培养液及cck-8,每孔加入200 μL PBS缓冲液,酶标仪测定570 nm吸光度。

1.3.3 检测MLE对细胞ROS、抗氧化酶的影响

实验分组同cck-8法检测细胞存活率,取对数生长期细胞,从104个/mL密度接种于96孔板培育24 h,加药物孵育6 h,弃上清液,加100 μmol/L H2O2孵育4 h,然后按试剂盒说明书检测ROS及GPx、SOD、MDA等的水平。

1.4 总RNA提取和cDNA的合成

总RNA提取和cDNA的合成分别应用Total RNA提取试剂盒和两步法cDNA合成试剂盒,依试剂盒说明书进行操作。根据GenBank中NQO1、HO-1、PI3K、Nrf2和β-actin mRNA序列,利用Premier 5.0 设计荧光定量PCR引物。

1.5 检测抗氧化酶基因的表达

实时荧光定量PCR采用SYBR Green I染料法,按照ExScript TM RT-PCR Kit试剂盒操作说明书在定量PCR仪进行。采用总反应体积10.0 μL体系:SYBR-Premix Ex TaqTM Ⅱ 5 μL,引物(10 μmol/L)2.0 μL,cDNA模版1.0 μL,双蒸水2.0 μL。PCR反应条件:95 ℃变性200 s,95 ℃反应25 s,65 ℃反应25 s,72 ℃反应20 s,72 ℃作用120 s,荧光检测72 ℃ 10 s,40个循环。表达水平用相对定量的方法,采用2-ΔΔCt进行计算[16]

1.6 数据处理

采用SPSS 18软件进行统计。阴性对照和阳性对照采用独立样本t检验,对MLE处理效应进行回归分析。P<0.05定为具有显著性差异,结果均以Mean±SEM表示。

2 结果与分析

2.1 MLE的分离提取及化合物分析

50 mL白酒经萃取、冷冻干燥,最终获得MLE 0.35 mg。经HPLC-MS分析,MLE多为多元醇、不饱和脂肪酸及其酯类化合物、吡嗪类化合物及含有苯环的芳香族化合物,选出其中含量较多的16种化合物(表1)及MLE进行体外抗氧化活性研究。

2.2 MLE对HepG2细胞增殖能力及ROS含量的影响

取0.10 mg/mL化合物(表1)预处理细胞6 h后,加入100 μmol/L H2O2培养4 h,CCK8检测细胞增殖能力。相比于正常对照组(细胞增殖能力设为100%),H2O2组细胞增殖能力显著下降(83.3%, P<0.05)。分析实验结果发现,部分化合物可显著抑制由H2O2诱导引起的细胞增殖能力减弱的现象(表1)。MLE-7、MLE-9、MLE-10及MLE-15与HepG2细胞共培养6 h后,细胞增殖能力分别比H2O2组高6.40%、8.80%、13.2%及10.9%。而细胞与MLE-2、MLE-3、MLE-8及MLE-14共培养后,细胞增殖能力与H2O2组相比分别降低了7.00%、10.7%、11.0%及10.6%。因此,选择MLE-10与MLE进行抗氧化活性研究。

表1 MLE中相关化合物浓度及对HepG2细胞增殖能力的影响
Table 1 Concentrations of compounds in the MLE and effects on proliferation of HepG2 cells

编号化合物含量/(μg·L-1)存活率/%MLE-1长叶烯9.9890.1±2.95MLE-2苯甲醛26.876.3±3.03MLE-3苯甲醇10.972.6±2.75MLE-4α-雪松醇16.884.1±3.80MLE-5β-榄香烯23.585.2±5.21MLE-6α-呋喃甲醇33.585.5±4.63MLE-7四甲基吡嗪25.689.7±2.35MLE-8苯乙酸乙酯33.272.3±4.45MLE-95-甲基-2-糠醛28.992.1±2.21MLE-102-乙酰基-5-甲基呋喃19.696.5±2.36MLE-113,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇26.884.6±6.62MLE-122,6-二甲基-2,6-辛二烯-8-醇21.383.9±4.92MLE-136,10-二甲基-5,9-十一烯-2-酮26.283.1±3.68MLE-14(S)-2-异亚丙基-5-甲基环己酮26.872.7±3.67MLE-155-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮11.894.2±3.67MLE-164-(2,6,6-三甲基-1-环己烯基)-3-丁烯-2-酮66.583.9±5.53MLE--89.7±6.31酱香型白酒--76.9±7.06乙醇(53%)--74.2±4.91H2O2--83.3±2.42

注:“-”表示编号代表的物质为混合物。

实验分为:①正常对照组;②H2O2模型损伤组;③53%vol酱香型白酒组;④V(乙醇)∶V(水)=53∶47;⑤MLE组;⑥MLE-10组。为便于比较,将正常对照组数值设为1,其他组为相对值。

图1-A结果显示,相比于正常组相比,经H2O2组细胞存活率降低14.4%(P<0.05)。与H2O2组相比,MLE、MLE-10处理后细胞存活率分别上升5.80%、10.6%。相比于正常组,白酒、乙醇组细胞存活率分别下降17.7%、21.7%,低于H2O2组。说明白酒和乙醇会降低细胞抗H2O2氧化损伤能力,使细胞存活率降低。

MLE对细胞内ROS的影响如图1-B所示,与正常组相比,H2O2刺激后,细胞内ROS升高338% (P<0.05)。而MLE、MLE-10处理后,与H2O2组比较,细胞内ROS分别下降24.7%、47.9% (P<0.05),细胞清除ROS能力显著增强。而白酒、乙醇组的ROS却高于H2O2组,推测是乙醇与H2O2协同降低了HepG2细胞清除ROS的能力。

A-细胞存活率;B-ROS
图1 MLE对HepG2细胞增殖及细胞内ROS含量的影响
Fig.1 Effects of MLE on proliferation and ROS level in HepG2 cells
注:与正常对照组比较,#表示差异显著(P<0.05),与H2O2模型损伤组比较,*表示差异显著(P<0.05)。

2.3 MLE对HepG2细胞相关抗氧化酶的影响

实验分为:①正常对照组;②H2O2模型损伤组;③53°酱香型白酒组;④V(乙醇)∶V(水)=53∶47;⑤MLE组;⑥MLE-10组。为便于比较,将正常对照组数值设为1,其他组为相对值。

由表2可知,H2O2刺激HepG2细胞后,GST、MDA的含量显著升高(P<0.05),GPx、SOD、CAT活性出现明显降低,且GSH含量也显著降低。经MLE、MLE-10处理后,GST、MDA的含量降低(P<0.05),GPx(P<0.05)、SOD、CAT活性明显增强。不同于MLE、MLE-10可增强HepG2抗氧化损伤的作用,酱香型白酒及同浓度乙醇组的GST、MDA的含量反而高于H2O2组,而GPx、SOD、CAT活性则低于H2O2组。推测可能是组分中乙醇对细胞具有一定的氧化损伤作用导致的。

2.4 MLE对HepG2细胞抗氧化基因表达的影响

实验分为:①正常对照组;②H2O2模型损伤组;③53°酱香型白酒组;④V(乙醇)∶V(水)=53∶47;⑤MLE组;⑥MLE-10组。为便于比较,将正常对照组数值设为1,其他组为相对值。

如图2所示,用H2O2刺激HepG2细胞后,与对照组相比,HO-1、NQO-1、Nrf2及PI3K基因表达显著降低(P<0.05)。MLE-10处理后,其表达明显提高(与H2O2模型损伤组比较,P<0.05)。实验结果说明,H2O2可导致HepG2细胞相关抗氧化基因的表达下降。而MLE、MLE-10可抑制H2O2所致的抗氧化基因表达下调,使之恢复,并接近正常水平。

表2 MLE对HepG2细胞内GPx、SOD、CAT、GSH、GST及MDA的影响
Table 2 Effects of MLE on GPx, SOD, CAT, GSH, GST and MDA in HepG2 cells

分组GPxSODCATGSHGSTMDA①1.00±0.111.00±0.091.00±0.051.00±0.071.00±0.071.00±0.04②0.54±0.04#0.61±0.07#0.38±0.03#0.41±0.05#2.65±0.28#4.75±0.51##③0.42±0.03#0.55±0.06#0.31±0.03#0.33±0.02#2.73±0.28#5.11±0.55##④0.23±0.01##0.37±0.04#0.19±0.01##0.20±0.02##3.13±0.35#6.25±0.56##⑤0.74±0.05∗0.71±0.040.55±0.060.59±0.07∗2.01±0.223.37±0.37∗⑥0.94±0.06∗0.89±0.06∗0.81±0.07∗0.79±0.06∗1.38±0.14∗2.16±0.02∗

注:与正常对照组对比,#表示差异显著(P<0.05),##表示差异极显著(P<0.01),与H2O2模型损伤组比,*表示差异显著(P<0.05)。

图2 MLE对H2O2处理HepG2细胞HO-1、NQO-1、Nrf2及PI3K基因表达的影响
Fig.2 Effects of MLE on HO-1, NQO-1, Nrf2 and PI3K gene expressions in HepG2 cells
注:与正常对照组对比,#表示差异显著(P<0.05),与H2O2模型损伤组比较,*表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

氧化应激是体内氧化和抗氧化水平失去平衡的结果,过量的活性氧会引起分子、细胞和机体的损伤[17]。大量研究表明,氧化应激是代谢综合征发生和发展及一些疾病发生的重要病因之一[18-19]。在肝炎、酒精肝等多种肝病中,氧化应激是它们共同的损伤机制[20]。H2O2可直接转变为·OH作用于肝细胞,引起细胞氧化损伤[21]。大量研究表明,酒精及其代谢产物会对机体造成一定的损伤,尤其是对消化系统。不同于伏特加等蒸馏酒,酱香型白酒是一种由谷物发酵(如高粱等)经蒸煮等多种过程而得的蒸馏酒,它在含有酒精的同时还含有大量生物活性物质。实验结果显示,酱香型白酒中含有多种酯类、不饱和烯醇及含有苯环的芳香族化合物。其中化合物MLE-10(2-乙酰基-5-甲基呋喃)能显著增强细胞抗H2O2造成的氧化损伤。进一步实验证明,MLE及MLE-10可提高细胞Nrf2及其上游调控因子PI3K及下游Ⅱ相酶基因NQO1和HO-1的表达,进而提高细胞内SOD、GPx等抗氧化酶活性,降低MDA产生,增强细胞清除自由基能力,进而发挥抗氧化作用[22]。但是,与相关研究结果类似,酒精组及白酒组细胞抗氧化能力降低、相关抗氧化酶活性低于H2O2组,说明乙醇降低了细胞的抗氧化损伤能力。

参考文献

[1] LEE K M, KANG H A, PARK M, et al. Interleukin-24 attenuates®b-glycerophosphate-induced calcification of vascular smooth muscle cells by inhibiting apoptosis, the expression of calcification and osteoblastic markers, and the Wnt/®b-catenin pathway[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2012, 428(1):50-55.

[2] GAO H, LI G, HUANG J, et al. Protective effects of Zhuyeqing liquor on the immune function of normal and immunosuppressed mice in vivo[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2013, 13(1):252.

[3] D′AUTRÉAUX B, TOLEDANO MB. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2007, 8(10):813-824.

[4] FANIDI A, HARRINGTON E A, EVAN G I. Cooperative interaction between c-myc and bcl-2 proto-oncogenes[J]. Nature, 1992, 359(6 395):554-556.

[5] COHLY H H P, TAYLOR A, ANGEL M F, et al. Effect of turmeric, turmerin and curcumin on H2O2-induced renal epithelial (LLC-PK1) cell injury[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1998, 24(1):49-54.

[6] KAWANISHI S, OHNISHI S, MA N, et al. Nitrative and oxidative DNA damage in infection-related carcinogenesis in relation to cancer stem cells[J]. Genes and Environment, 2016, 38(1):1-12.

[7] SHAH A, GRAY K, FIGG N, et al. 165 Human atherosclerosis is characterised by oxidative dna damage due to defective base excision repair[J]. Heart, 2017, 103(Suppl 5): A117-A118.

[8] CHEN S, WU P, ZHOU L, et al. Relationship between increase of serum homocysteine caused by smoking and oxidative damage in elderly patients with cardiovascular disease[J]. International Journal of Clinical & Experimental Medicine, 2015, 8(3):4 446-4 454.

[9] YELIGAR S M, MACHIDA K, KALRA V K. Ethanol-induced HO-1 and NQO1 are differentially regulated by HIF-1 and Nrf2 to attenuate inflammatory cytokine expression[J]. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(46):35 359-35 373.

[10] PAPAIAHGARI S, ZHANG Q, KLEEBERGER S R, et al. Hyperoxia stimulates an Nrf2-ARE transcriptional response via ROS-EGFR-PI3K-Akt/ERK MAP kinase signaling in pulmonary epithelial cells[J]. Antioxidants & Redox Signaling, 2006, 8(1-2):43-52.

[11] GAO H Y, HUANG J, WANG H Y, et al. Protective effect of Zhuyeqing liquor, a Chinese traditional health liquor, on acute alcohol-induced liver injury in mice[J]. Journal of Inflammation, 2013, 10(1):30.

[12] LIU Q, LAWRENCE A J, LIANG J H. Traditional Chinese medicine for treatment of alcoholism: from ancient to modern[J]. The American Journal of Chinese Medicine, 2011, 39(01):1-13.

[13] 孙其然, 沈敏,沈保华, 等. 气相色谱-质谱指纹图谱在鉴别贵州茅台酒中的应用[J]. 色谱, 2010, 28(9):833-839.

[14] XIAO H, WANG J, YAN W, et al. GLUT1 regulates cell glycolysis and proliferation in prostate cancer[J]. The Prostate, 2017,78(2):86-94.

[15] NIU Y, CHEN X, XIAO Z, et al. Characterization of aroma-active compounds in three Chinese Moutai liquors by gas chromatography-olfactometry, gas chromatography-mass spectrometry and sensory evaluation[J]. Natural Product Research, 2017, 31(8):938-944.

[16] DONG Y, DESNEUX N, LEI C, et al. Transcriptome characterization analysis of, Bactrocera minax, and new insights into its pupal diapause development with gene expression analysis[J]. International Journal of Biological Sciences, 2014, 10(9):1 051-1 063.

[17] NIKI E. Assessment of antioxidant capacity in vitro and in vivo[J]. Free Radical Biology & Medicine, 2010, 49(4):503-515.

[18] SCHILL G, SOSNOVSKY G, ZIEGLER H J. Insulin-leptin axis, cardiometabolic risk and oxidative stress in elderly with metabolic syndrome[J]. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 2018, 126(7):445-452.

[19] BOR J L, MAN Y C, HAN Y H, et al. Relationship of oxidative stress, inflammation, and the risk of metabolic syndrome in patients with oral cancer[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2018, 2018:1-7.

[20] CARMELA L, ALESSANDRO F. Oxidative stress in viral and alcoholic hepatitis[J]. Free Radic Biol Med, 2003, 34(1):1-10.

[21] DAN P, NITZAN D W, DAGAN A, et al. H2O2 renders cells accessible to lysis by exogenous phospholipase A2: a novel mechanism for cell damage in inflammatory processes[J]. Febs Letters, 1996, 383(1-2):75-78.

[22] YAO Y, WANG Y, ZHANG Y, et al. Klotho ameliorates oxidized low density lipoprotein (ox-LDL)-induced oxidative stress via regulating LOX-1 and PI3K/Akt/eNOS pathways[J]. Lipids in Health and Disease, 2017, 16(1):77-86.

Antioxidant activity of active components in Maotai-flavor liquor

LUO Qiang, LIU Jie, LIU Zhigang*

(Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518000, China)

ABSTRACT The purpose of this study was to determine whether the active ingredient isolated from the Maotai-flavor liquor (Maotai-flavor liquor, MLE) had protective oxidative damage and its mechanism. MLE was obtained by extraction and freeze-drying, and the composition was analyzed by HPLC-MS, while the oxidative damage model was established using the H2O2 stimulated HepG2 cell. Based on the model, the effects of MLE on cell growth rate, presence of reactive oxygen species (ROS) within the cell, antioxidant enzyme activity, and on antioxidant gene expression in HepG2 induced by H2O2 were analyzed. Treatment with H2O2 resulted in significant increase in ROS scavenging rate and cell growth rate, as well as decrease in glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity. It also caused decrease in glutathione (GSH), and increase in oxidized glutathione (GST) and malondialdehyde (MDA). Addition of MLE can not only reverse these processes, but also significantly increase (P<0.05) expression rate of antioxidant gene NQO-1 and antioxidant gene PI3K in the HepG2 cell. In summary, MLE′s antioxidant protection function was related to its ability of enhancing antioxidant enzyme activity and the expression of the antioxidant gene. Oxidative damage is associated with various diseases, and this active ingredient isolated from the Maotai-flavor liquor provides a possible solution for preventing these diseases.

Key words Maotai-flavor liquor; MLE; HepG2 cells; antioxidant enzyme; antioxidant gene

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.019989

第一作者:硕士研究生(刘志刚教授为通讯作者,E-mail:liuzhigangszu@163.com)。

基金项目:深圳市科技计划基础研究项目(JCYJ201604291 14659119)

收稿日期:2019-01-17,改回日期:2019-07-12