桑椹(Mori Fructus，MF)，别名桑葚，为桑科植物桑Morus alba L.的干燥成熟果穗[1]，在2002年被原卫生部列入《既是食品又是药品的物品名单》，在食品和医疗方面均使用广泛[2-13]。
色泽是药材固有的性状，对于评价药材质量具有重要价值。通常，中药材可以通过色泽的观察进行新货或陈货的判断，也就是说可以根据色泽判断出贮藏的年份，一般来说，随着贮藏时间的延长，药材色泽会出现加深的现象[14-16]，5-羟甲基糖醛(5-HMF)的含量也显著升高。5-HMF主要来源于焦糖化反应和Maillard反应。前者的反应需要在140～170℃的高温下发生，而后者的反应在常温下即可发生。中药材在贮藏环节，通常是不接触较高的温度的，因此其中5-HMF应该主要来源于Maillard反应。同时，在中药材较长时间的贮藏过程中，随着Maillard反应的持续发生，不断累积了5-HMF，因此导致中药材中5-HMF的含量随着贮藏时间的延长而逐渐升高。但是，桑椹在干燥后即呈现紫黑色的外观，人们很难通过色泽判断贮藏了多长时间，导致桑椹在药材市场中经常出现新货和陈货混杂的现象。而对于桑椹来说，传统观点认为新货的疗效较好，陈货的质量欠佳。目前，尚未见人们对桑椹新货与陈货之间进行过色泽、化学成分进行比较的文献报道。为此，参照山萸肉、五味子色泽与5-HMF具有显著相关性的文献报道，我们首次对桑椹进行了5-HMF含量的测定，并指出了贮藏年份与其中5-HMF含量的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑椹样品于2017年12月收集于药材市场、各地的药店，其中4号样品采收于北京西山，收集的样品封装在自封袋内，放置于温度为(16±0.5)℃，湿度为(40±5)%RH的恒温恒湿箱中，经某研究员鉴定为桑Morus alba L.的干燥成熟果穗，详见表1，于2018年3月取出，粉碎，粉末封装于自封袋，放置于常温条件的实验室中，于1个月内完成全部实验工作，未作特殊保存;5-HMF对照品(纯度≥99.09%)，美国Sigma-Aldrich公司；娃哈哈纯净水(电导率为2.22 μs/cm)，杭州娃哈哈集团有限公司；甲醇、乙腈(色谱纯)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.2 仪器与设备
Shimadzu LC-20AT型高效液相色谱仪，日本岛津公司，配有SIL-20A型自动进样器，DGU-20A5型自动脱气机，LC-20AT型泵，SPD-M20A型二极管阵列检测器，CTD-10ASvp柱温箱，LC-solution色谱工作站；NH310型三恩驰便携式色差仪，三恩驰科技有限公司；Ohaus CP224C型电子天平(精度0.1 mg),奥豪斯(上海)仪器有限公司；XS105 Dual Range型电子分析天平(精度0.01 mg)，Mettler Toledo仪器系统有限公司；KC-02高速粉碎机，北京开创同和科技发展有限公司；KQ-100E超声波清洗器(100 W，40 kHz)，昆山市超声仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 色泽观察
取各样品约50 g于高速粉碎机中，25 000 r/min粉碎约40 s，过四号筛，取适量样品粉末置于白纸上，在日光下观察色泽。
1.3.2 水分测定
取“1.3.1”项下粉末约2.0 g，精密称定，按2015版《中国药典》第四部通则0832项下第二法，即烘干法测定水分。
1.3.3 5-HMF含量测定
1.3.3.1 色谱条件
Dikma Diamonsil C18(2)色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(体积比5∶95)，流速1 mL/min，检测波长设置为284 nm，柱温30℃，进样10 μL。
1.3.3.2 对照品储备溶液的制备
精密称取5-HMF对照品19.85 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加适量体积分数为50%的甲醇使溶解，并逐渐加至刻度，制成质量浓度为0.397 mg/mL的对照品储备溶液。
1.3.3.3 供试品溶液的制备
取“1.3.1”项下粉末约1.0 g，精密称定后置于25 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称重后超声25 min(100 W，40 kHz)，取出放冷至室温，用50%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液即得。
1.3.3.4 方法学考察
参照文献[17]方法对所建立的方法进行了方法学考察，主要包括，线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验并测定了检测限和定量限。用50%甲醇稀释对照品储备溶液，稀释成浓度分别为0.116 6、0.291 4、1.457、1.985、2.914、3.97 μg/mL的系列对照品溶液，分别进样10 μL，按“1.3.3.1”项下的色谱条件测定5-HMF峰面积，得出线性方程。将浓度为3.97 μg/mL的5-HMF对照品溶液连续进样测定6次，每次均为10 μL，测定5-HMF的峰面积，计算RSD。将18号供试品溶液室温放置，在0、2、4、8、12、24 h分别进样测定5-HMF的峰面积，计算RSD。取6份18号样品粉末，制备供试品溶液后，进样测定，计算平均含量和RSD。取6份18号样品粉末，每份约0.5 g并精密称定，精密加入浓度为0.039 7 mg/mL的5-HMF对照品溶液1.0 mL，制备供试品溶液后，进样测定，计算平均加样回收率和RSD。将对照品储备溶液逐级稀释，分别进样测定，最终确定检测限(S/N=3)和定量限(S/N=10)。
1.3.3.5 样品含量测定
按“1.3.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.3.1”项下色谱条件测定，采用外标一点法计算干品中含量。
2 结果与分析
2.1 色泽和水分分析
色泽和水分测定结果见表1。
表1 桑椹样品信息、色泽、水分和5-HMF的含量
Table 1 Samples information, color, and water and
5-HMF contents of MF
编号来源产地贮藏年份/年色泽水分/%5-HMF含量/(μg·g-1)1大连药房未知1紫黑6.35-2安国药材市场山东1紫黑12.27-3北京同仁堂河北2紫黑12.621.193∗4北京西山北京1紫黑10.281.641∗5博古林中医馆山东3紫黑15.433.1806安国药材市场新疆3紫黑13.344.2767四川绵阳好医生鑫达药店未知未知紫黑14.435.4398安徽国盛大药房安徽3紫黑13.558.4819安国药材市场河北未知紫黑12.778.82810济南裕申堂山东3紫黑13.809.37611山东同心堂药店山东3紫黑13.1112.0212安国药材市场新疆3紫黑12.1913.3713南宁康全药业未知未知紫黑8.2313.5014安国药材市场新疆3紫黑13.2713.7215江苏春天药房未知3紫黑8.4214.3616北京永安堂大药房山西3紫黑14.2623.6417安国药材市场山东5紫黑11.0774.6018安国药材市场山东5紫黑13.9283.78
注：“-”表示低于检测限(2.914×10-4 μg);*表示低于定量限(9.925×10-4 μg)。
表1的结果显示，全部18个桑椹样品的色泽均较深，呈紫黑色，不同样品之间的色泽相似，很难通过人眼判断出样品之间的差异。由表1可知，各样品的水分含量变化较大，水分与色泽之间的相关性不明显。其中，1号样品的水分含量的质量分数为6.35%，为所有样品中最低；5号样品水分含量的质量分数为15.43%，为水分含量最高的样品，超过了《中国药典》中“水分不得过15%”的规定。各样品水分含量差异明显，可能原因:(1)干燥的方式和干燥后的水分含量有出入;(2)我们购置前该商品的贮藏环境中湿度的不同。
2.2 5-HMF含量分析
对照品与供试品的HPLC图见图1。由图1可知，供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的保留时间处显示色谱峰，且该色谱峰峰型独立，说明该色谱条件下能够有效检测出供试品中的5-HMF。
图1 对照品及桑椹供试品HPLC图
Fig.1 HPLC chromatograms of 5-HMF and MF
通过方法学考察，计算测定方法的线性方程为Y=8 234 771X-1 528(r2=0.999 2)，其中横坐标为进样量(g)，纵坐标为峰面积(mAU)，表明进样量在0.001 166～0.039 7 μg与峰面积呈良好的线性关系。精密度试验、稳定性试验的RSD分别为0.78%和0.82%。重复性试验结果显示，18号供试品溶液的5-HMF的平均含量为0.084 23 mg/g，RSD为1.85%。加样回收率试验结果见表2，由表可知，平均回收率为98.92%，RSD为0.74%。检测限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分别为2.914×10-4 μg和9.925×10-4 μg。以上结果均显示，所建立的用于测定5-HMF含量的方法准确可行。
表2 5-HMF的加样回收率试验结果
Table 2 Recovery results of 5-HMF in MF
称样量/g样品中含量/μg加入量/μg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.502 236.4139.7076.0199.750.500 636.2939.7075.4498.620.501 636.3739.7075.7999.2898.920.740.501 836.3839.7075.9099.550.500 336.2739.7075.1197.830.501 436.3539.7075.4598.49
各样品含量测定结果见表1。由表1可知，各样品中5-HMF的含量差异很大。在可以明确贮藏年份的样品中，1～4号样品为贮藏1年或2年的桑椹，含量低于检测限(2.914×10-4 μg)和定量限(9.925×10-4 μg)。贮藏了3年的样品，其中5-HMF的含量则相对较高，达到了3.180～23.64 μg/g。贮藏5年的2个样品，5-HMF高达74.60和83.78 μg/g。该结果说明，随着贮藏年份的延长，桑椹中5-HMF的含量变化为从无到有，从少到多，与贮藏年份具有显著的相关性。这种随着贮藏时间的延长，5-HMF含量逐渐升高的现象与龙眼肉[13]、牛膝[14]等药材一致。
5-HMF是葡萄糖、果糖等单糖发生Maillard反应生成的一种醛类小分子化合物[18]，对H2O2引起的人体肝细胞损伤具有保护作用(0.79 μmol/L)[19]，可抑制A375肿瘤细胞的增殖(4.8 mmol/L)[20]，但是高剂量的5-HMF(>75 mg/kg)对人眼部、上呼吸道、皮肤和黏膜具有刺激性[21]等毒性作用。目前关于5-HMF的药理活性存在争议，且5-HMF广泛存在于烘焙、加热的食品中，对于人体的副作用也存在争议[22]。2015版《中国药典》对甲硝唑、己酮可可碱等葡萄糖注射液中5-HMF的含量进行了不得高于葡萄糖标示量0.02%的规定。就桑椹来说，测定的最高含量为0.008%，低于0.02%。由于桑椹属于药食同源药材，摄入过多也许会对人体产生潜在的副作用，但是具体的摄入量还有待进一步研究。
Maillard反应在常温下即可发生，说明在桑椹的贮藏环节，发生了Maillard反应，生成了5-HMF，造成了随着贮藏年限的延长，桑椹中5-HMF含量显著的升高现象。该现象提示我们应该控制桑椹贮藏的年限，尽量采用新货而不使用陈货。陈货中较高的5-HMF含量可以作为新货与陈货的判别依据。
3 结论
牛膝、山萸肉等药材的色泽本身比较浅，随着贮藏年份的延长引起了色泽的加深，人眼可以观察到色泽的明显变化，贮藏年份与色泽、5-HMF含量之间均具有显著的相关性。而对于色泽本身就很深的桑椹来说，人眼未能观察到贮藏年份与色泽变化的相关性，但是通过测定5-HMF的含量可以说明其与贮藏年份具有显著的相关性，表明由于发生Maillard反应致使5-HMF含量的升高已不足以导致色泽的进一步加深了。这种首次发现，对于色泽很深的一类中药材具有示范性的研究价值。通过5-HMF含量的测定进而推测桑椹的贮藏年份，对于制定桑椹的质量标准、指导桑椹的贮藏具有重要的意义。
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