柑橘是世界第一大宗水果，其种类包括宽皮柑橘、橙类、柚类、柠檬和金柑等[1]。宽皮柑橘(Citrus reticulate)属芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus.L)植物，是一类果皮宽松、容易剥皮的柑橘品种群。宽皮柑橘在2018/19年度全球产量预计达3 140万t，中国为2 200万t，占全球宽皮柑橘产量的70%以上[2]。我国宽皮柑橘资源丰富，品种多样化，主栽品种为温州蜜柑、南丰蜜桔和椪柑，其产量分别占我国柑橘总产量(2017年)的23.4%、6.0%、10.3%[3]。
中国虽然是宽皮柑橘第一生产大国，但加工转化率不足5%，且主要的加工形式依然是传统的橘瓣罐头加工，宽皮橘汁产品在国内市场鲜有销售。本研究以温州蜜柑、南丰蜜桔和椪柑为研究对象，考察其品质特性(包括糖酸含量、光学特性、活性成分及风味物质)，为宽皮柑橘制汁提供理论参考，以期提高我国宽皮柑橘利用率及缓解鲜果滞销。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
三种柑橘原料(温州蜜柑、南丰蜜桔和椪柑)均在成熟期采摘，分别采于湖北宜昌、江西南丰及浙江衢州。利用锥式压榨机制汁，榨汁后经80目无菌纱布过滤，存于-80℃超低温冰箱备用。
葡萄糖、果糖、蔗糖(均为色谱纯)，购于阿拉丁试剂(上海)有限公司；福林酚试剂，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；2,6-二氯靛酚、丙酮、石油醚、二氯甲烷、抗坏血酸、没食子酸，购于成都市科龙华工试剂厂；乙腈、甲醇(均为色谱纯)，购于赛卡姆(北京)科技仪器有限公司。
1.2 仪器与设备
榨汁机，美国Brown公司；实验室pH计，梅特勒-托利多(上海)有限公司；紫外分光光度计(TU-1901)，北京普析通用仪器有限责任公司；高效液相色谱(Ulimate 3000)；美国Thermo Fisher公司；色差仪(Color i5)，瑞士Gretag Macbech公司；阿贝折射仪，上海精密科学仪器有限公司；7890A/5975C气相色谱-单四极杆质谱仪(配DB-5MS石英毛细管柱),美国Agilent公司；Combi PAL气相色谱多功能自动进样器,瑞士CTC公司。
1.3 试验方法
1.3.1 pH值测定
使用梅特勒-托利多FE20 型实验室pH计直接进行测定。
1.3.2 可溶性固形物测定
依照GB/T 8210—2011《柑橘鲜果检验方法》中阿贝尔折射仪测定法进行测定。
1.3.3 可滴定酸测定
依照GB/T 8210—2011《柑橘鲜果检验方法》中酚酞指示剂法进行测定。
1.3.4 可溶性糖测定
采用高效液相色谱法，检测器为示差折光检测器(refractive index detector，RID)。液相色谱条件：色谱柱：Hypersil APS-2氨基色谱柱(250×4.6 mm，5μm);流动相：80%乙腈；流速：2 mL/min；柱温：40℃；进液量：10 μL。
准确称取250 mg果糖、葡萄糖和蔗糖标准品，用超纯水定容至10 mL体积，制备为25.0 g/L的标准母液。然后将标准溶液稀释至15.0、10.0、5.0、2.5、2.0、1.0和0.5 g/L。以果糖、葡萄糖、蔗糖质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制了标准曲线。果糖、葡萄糖和蔗糖的标准曲线分别为y=0.013x-0.005、y=0.011 8x+0.031 6和y=0.012 7x-0.007 1。
1.3.5 色值测定
使用Color i5色差仪测定样品的L*、a*和b*值，其中L*为样品的亮度，a*为红绿值，b*为黄蓝值。
1.3.6 抗坏血酸测定
依照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸》中2,6-二氯靛酚滴定法测定。
1.3.7 总酚测定
参照Folin-Ciocalteu法[4]测定。
1.3.8 总类胡萝卜素测定
参照迟淼[5]的石油醚-丙酮萃取法测定。
1.3.9 柠檬苦素测定
参照李一兵等[6]的方法并加以修改。样品处理：取20 mL果汁，加入20 mL二氯甲烷后，涡旋振荡30 min，连续浸提3次，浸提液经旋转蒸发仪30℃蒸干，然后用85%乙腈定容至2 mL，经0.22 μm有机滤膜过滤后进行HPLC分析。
HPLC测定条件：A相：乙腈，B相：纯水；流速1 mL/min;柱温30 ℃；进样量20 μL；检测波长210 nm。
1.3.10 酚酸组分测定
参照MATTILA等[7]的方法并加以修改。取10 mL果汁加入5 mL浓度为16 mol/L的NaOH溶液水解1 h，水解结束后，用8 mol/L的HCl调pH至1～2，然后加10 mL乙酸乙酯与乙醚(体积比1∶1)萃取3次，合并萃取液，40 ℃旋转蒸发仪蒸干，再用2 mL 80%甲醇定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，上机备用。
HPLC条件:色谱柱：Venusil MP C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)A相：纯甲醇，B相：0.5%乙酸，流速1 mL/min，进样量20 μL。
1.3.11 类黄酮组分测定
参照AGCAM[8]的方法并加以修改。10 mL果汁加入10 mL乙酸乙酯涡旋振荡20 min，4 000 r/min离心15 min，取有机相至新离心管中，水相再用10 mL乙酸乙酯萃取2次，合并3次萃取液，40 ℃旋转蒸发仪蒸干，用2 mL60%甲醇定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，上机备用。
HPLC条件:色谱柱：Thermo Fisher色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)、柱温30℃、A相：纯乙腈，B相：1%乙酸、流速1 mL/min，进样量20 μL。
1.3.12 香气成分测定
1.3.12.1 样品萃取条件
参照郑洁等[9]的方法，并加以修改。准确称取5.0 g果汁，置于20 mL螺口玻璃瓶中，加入1.0 g干燥后的NaCl，再加入2 μL环己酮作为内标物，用聚四氟乙烯隔热垫密封瓶盖旋紧备用，每个样品测定2次。顶空固相微萃取条件：40℃平衡20 min；顶空吸附30 min；解析5 min。
1.3.12.2 色谱和质谱条件
气相色谱条件:色谱柱为DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：35 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，再以5 ℃/min升至240 ℃，保持2 min；进样口温度250 ℃；不分流进样；载气为氦气(纯度大于99.999%)；载气流速1 mL/min。
质谱条件:电子电离(electron ionization，EI)源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度 230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z 35～400。
1.3.12.3 定性和半定量分析
利用图谱库(NIST 2008和Flavour 2.0)的检索结果，并以C5-C25正构烷烃的保留时间计算出化合物的相对保留指数，结合相关文献[10-11]定性确定相应的挥发性物质。定量方法采用内标法，内标物为环己酮。利用各成分峰面积与内标物峰面积对比进行半定量分析，含量单位为μg/g。
1.4 数据分析
采用SPSS Statistics 17.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，XLSTAT 2016软件进行主成分分析，Excel 2013用于绘制图表及数据整理。
2 结果与分析
2.1 三种宽皮柑橘糖酸成分比较
糖和酸是柑橘味感的主要成分，糖主要是葡萄糖、蔗糖和果糖，酸主要是指柠檬酸、苹果酸等。表1所示为3种宽皮柑橘糖酸成分比较，从表中可以看出，不同品种之间，其糖酸含量均存在极显著差异(P<0.01)。椪柑的可滴定酸含量最高，温州蜜柑次之，南丰蜜桔最低，其pH值正好相反。可溶性固形物主要是指食品中所有溶解于水的化合物的总称,包括糖、酸、维生素、矿物质等，其中糖含量大约占80%。3种宽皮柑橘中含量最高的可溶性糖均是蔗糖，且蔗糖含量是葡萄糖和果糖的2～4倍。南丰蜜桔的可溶性固形物、蔗糖含量均高于另外2种宽皮柑橘，温州蜜柑和椪柑的3种可溶性糖其含量相差不大，但可溶性固形物含量差异显著。
表1 三种宽皮柑橘糖酸成分比较
Table 1 Comparison of sugar and acid components
of three Mandarin(Citrus reticulata)
品种pH可滴定酸/可溶性固形物/果糖/葡萄糖/蔗糖/[g·(100mL)-1](Brix)[g·(100mL)-1][g·(100mL)-1][g·(100mL)-1]温州蜜柑3.41±0.01b0.76±0.01b13.13±0.06b2.93±0.02a2.92±0.02a5.63±0.18b南丰蜜桔4.14±0.01a0.43±0.01c13.53±0.06a1.88±0.01c2.14±0.02c8.20±0.03a椪柑3.21±0.01c0.82±0.03a12.46±0.06c2.61±0.06b2.56±0.08b5.69±0.17b显著性000000
注：同列肩标不同字母表示列组间有显著性差异(P<0.05)。下同。
2.2 三种宽皮柑橘光学特性比较
柑橘汁的色泽是影响消费者购买欲的重要因素之一，也是反映果汁新鲜度和卫生状况的重要指标。天然色素的种类和数量对柑橘汁的色泽起着决定性作用。由表2可知，温州蜜柑汁的亮度(L*)、红色色泽(a*)及黄色色泽(b*)均要显著高于其他两种宽皮柑橘汁，南丰蜜桔和椪柑的L*值相差不大，但南丰蜜桔的a*值低于椪柑，b*值要高于椪柑。
表2 三种宽皮柑橘光学特性比较
Table 2 Comparison of optical characteristics of three
Mandarin(Citrus reticulata)
品种L∗a∗b∗温州蜜柑43.88±0.03a12.95±0.03a28.01±0.10a南丰蜜桔41.34±0.16c6.89±0.01c25.92±0.03b椪柑41.60±0.07b8.55±0.04b22.39±0.05c显著性000
2.3 三种宽皮柑橘活性成分比较
柑橘水果具有丰富的营养价值，除含有基本的糖酸、矿物质外，还含有抗坏血酸、酚酸、黄酮、类胡萝卜素、柠檬苦素等多种活性成分。其中柠檬苦素和柚皮苷这2种苦味物质也是评价果汁加工适应性的重要指标[12]。
由表3可知，3种宽皮柑橘的4类活性成分含量之间存在极显著差异(P<0.01)。其中，南丰蜜桔的抗坏血酸和总类胡萝卜素含量均最高，椪柑的柠檬苦素含量最高，温州蜜柑的总酚含量最高。3种宽皮柑橘其抗坏血酸含量相差不大，但椪柑的柠檬苦素含量是南丰蜜桔的将近3倍，温州蜜柑的总酚含量是南丰蜜桔的2.5倍，南丰蜜桔的总类胡萝卜素含量是椪柑的1.8倍。
表3 三种宽皮柑橘活性成分比较
Table 3 Comparison of active ingredients of three
Mandarin(Citrus reticulata)
品种抗坏血酸/柠檬苦素/总酚/总类胡萝卜素/[mg·(100mL)-1][mg·(100mL)-1][mg·(100mL)-1][mg·(100mL)-1]温州蜜柑26.82±1.57a0.23±0.03b43.78±0.42a1.20±0.01b南丰蜜桔27.45±0.01a0.20±0.01b17.73±0.55c1.87±0.01a椪柑21.17±0.04b0.59±0.07a22.92±0.98b1.02±0.02c显著性0000
表4所示为测定7种主要酚酸组分的含量，阿魏酸是含量最高的酚酸组分，咖啡酸、芥子酸、没食子酸、对香豆酸次之，原儿茶酸和对羟基苯甲酸含量最低，与张元梅[13]的研究结果基本一致。其中，3种宽皮柑橘的对羟基苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸差异极显著(P<0.01)，没食子酸含量差异显著(P<0.05)，原儿茶酸和芥子酸含量差异不显著(P>0.05)。温州蜜柑的没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸含量均高于其他2种宽皮柑橘，椪柑的咖啡酸含量最高，将近南丰蜜桔含量的6倍，南丰蜜桔各酚酸组分含量除了原儿茶酸和阿魏酸，均低于温州蜜柑和椪柑。
表4 三种宽皮柑橘酚酸组分比较
Table 4 Comparison of phenolic acids of three Mandarin(Citrus reticulata)
品种没食子酸/原儿茶酸/对羟基苯甲酸/咖啡酸/对香豆酸/阿魏酸/芥子酸/(mg·L-1)(mg·L-1)(mg·L-1)(mg·L-1)(mg·L-1)(mg·L-1)(mg·L-1)温州蜜柑1.82±0.01a0.19±0.01a0.91±0.11a2.91±0.01b3.38±0.04a63.34±0.68a2.98±0.47a南丰蜜桔1.42±0.01b0.14±0.04a0.16±0.01c1.07±0.01c0.91±0.01c30.79±0.14b1.96±0.02b椪柑1.53±0.15b0.12±0.01a0.39±0.01b5.81±0.01a2.14±0.05b28.66±0.43c2.16±0.01ab显著性0.0380.1410.0030000.063
表5所示为测定5种主要类黄酮组分的含量，橙皮苷是含量最高的类黄酮组分，芸香柚皮苷次之，含量最低的是柚皮苷和新橙皮苷，与赵梓燕[14]的研究结果基本一致。其中3种宽皮柑橘的芸香柚皮苷和新橙皮苷含量之间差异极显著(P<0.01)，柚皮苷、橙皮苷和川皮陈素含量之间差异显著(P<0.05)。除了川皮陈素，其他4种类黄酮组分在温州蜜柑中含量均为最高，川皮陈素在椪柑中含量最高，南丰蜜桔的芸香柚皮苷、橙皮苷和川皮陈素含量均低于温州蜜柑和椪柑，并且含量差别极大。
表5 三种宽皮柑橘类黄酮比较
Table 5 Comparison of flavonoids of three
Mandarin(Citrus reticulata)
品种芸香柚皮苷/柚皮苷/橙皮苷/新橙皮苷/川皮陈素/(mg·L-1)(mg·L-1)(mg·L-1)(mg·L-1)(mg·L-1)温州蜜柑8.95±1.81a0.81±0.07a16.12±0.75a1.26±0.01a2.09±0.44b南丰蜜桔4.15±0.21b0.55±0.08b7.69±0.32b0.52±0.01b1.02±0.17b椪柑8.20±0.84a0.49±0.02b14.39±1.82a0.41±0.01c3.37±0.43a显著性00.0320.0100.018
2.4 三种宽皮柑橘香气物质比较
香气是衡量果实品质好坏的重要指标，新鲜柑橘的挥发性香气物质种类繁多，不同物质混合在一起，相互作用影响，共同赋予柑橘果汁清新、独特、舒适的气味[15]。利用GC-MS在3种宽皮柑橘中共检测到49种香气物质，其中在温州蜜柑、南丰蜜桔和椪柑中分别检测到27、30和28种(表6)，3种宽皮柑橘中共测得香气物质总含量分别为441.61、281.37和673.74 μg/g。椪柑的香气物质总含量最高，温州蜜柑次之，南丰蜜桔最低。在3种宽皮柑橘中所有香气物质中，烯烃类物质含量均为最高，其次为醇类和酯类物质。温州蜜柑的醛类和酯类物质含量均高于其他2种宽皮柑橘，南丰蜜桔的酮类和酚类物质含量要高于温州蜜柑和椪柑，而醇类和烯烃类在椪柑中的含量最高。
表6 三种宽皮柑橘香气物质含量比较
Table 6 Comparison of aroma substances in three
Mandarin(Citrus reticulata)
香气物质分类温州蜜柑/南丰蜜桔/椪柑/(μg·g-1)(μg·g-1)(μg·g-1)醇类18.4723.542.44醛类2.360.270.23酮类0.141.110.88酯类26.0425.0323.6烯烃392.97229.32604.17酚类0.891.861.77其他0.740.290.65总计441.61281.37673.74
含量高的香气物质其香气强度不一定高，如含量高的柠檬烯对整体香气贡献程度并不高，利用香气值(odor activity value，OAV)可以较准确的判定香气强度。OAV>1的香气物质称为特征香气物质，也叫做香气活性物质，OAV值越高，香气强度越大，对整体香气的贡献程度也就越大。查阅相关文献[15-18]得到香气物质的香气阈值，结合GC-MS的定量结果，计算所得OAV值。表7所示为3种宽皮柑橘中OAV>1的香气物质。由表7可以看出，3种宽皮柑橘中OAV>1的香气物质总共27种，醇类、醛类、酮类、酯类、萜烯类和酚类分别有8、3、3、1、10和2种，其中OAV值较高的香气物质有芳樟醇、β-紫罗兰酮、异松油烯和柠檬烯等。椪柑包含最多的特征香气物质，为21种，其次为温州蜜柑，包含19种，南丰蜜桔最少，为17种。
表7 三种宽皮柑橘中OAV>1的香气物质
Table 7 Aroma substances of OAV>1 in three
Mandarin(Citrus reticulata)
特征香气物质阈值/(μg·g-1)OAV温州蜜柑南丰蜜桔椪柑芳樟醇0.03234.9121.32616.33α-松油醇0.3311.6247.6217.83香茅醇0.0431.538.61113.73正辛醇0.115.15—20.492-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇0.17.62—1.74橙花醇0.35.31—2.76香叶醇0.01——16.6叶醇0.077.4——反式-2-己烯醛0.0293.61——癸醛0.035.649.087.68紫苏醛0.069.64——香芹酮0.250.570.921.38香叶基丙酮0.06—8.728.95β-紫罗兰酮0.001—35 723—3,7-二甲基-6-辛烯醇丁酸酯0.02——35.67α-蒎烯0.198.156.3620.37月桂烯0.6719.4910.8632.92柠檬烯1.2271.3157.25419.25γ-松油烯0.2615192.24238.1异松油烯0.0494.7250.59152.13巴伦西亚橘烯10.50.520.020.06β-石竹烯0.0619.3——水芹烯0.5—1.162.9别罗勒烯0.03——5.2对伞花烃0.01—366.96—2,5-二叔丁基酚0.51.781.822.27百里酚0.1—9.476.31
注：“-”表示无。
2.5 三种宽皮柑橘品质的主成分分析
本研究以宽皮柑橘样品及理化指标作为分析对象，采用主成分分析法对3种宽皮柑橘样品的11个重要理化指标进行分析。F1主成分的贡献率为63.61%，F2主成分的贡献率为36.38%，2个主成分的累计贡献率已经达到100%，表明F1、F2两个主成分解释了原品质特征变量100%的方差信息。主成分1主要携带的是pH、可溶性固形物、可滴定酸、可溶性糖、柠檬苦素、抗坏血酸、总类胡萝卜素的信息,主成分2主要携带的是总酚、L*、a*、b*的信息。
11个重要理化指标在2个主成分的载荷图见图1。可溶性糖、可溶性固形物、抗坏血酸和b*分布在第一象限，说明它们对主成分1和主成分2有较大影响。可滴定酸、总酚、分布在第二象限，说明它们与主成分2呈正相关。柠檬苦素位于第3象限，说明对主成分1和主成分2影响较小。pH和总类胡萝卜素位于第四象限，说明它们与主成分1相关性较大。主成分1和主成分2对三种宽皮柑橘区分明显，温州蜜柑与总酚、L*及a*相关性显著，南丰蜜桔与pH、总类胡萝卜素相关性显著，椪柑位于第三象限，与柠檬苦素有较大的相关性。
图1 主成分载荷图
Fig.1 Principal component load diagram
3 结论
3种宽皮柑橘的理化指标存在显著差异，温州蜜柑的总酚含量、L*值、a*值、b*值及5种酚酸组分(没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、芥子酸)和4种类黄酮组分(芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)均为最高，南丰蜜桔的pH、可溶性固形物、可溶性糖含量、抗坏血酸、总类胡萝卜素含量均为最高，但可滴定酸、柠檬苦素、总酚含量、L*值、a*值、6种酚酸组分、3种类黄酮组分及香气物质总含量最低，椪柑的可滴定酸、柠檬苦素、咖啡酸、川皮陈素含量计香气物质总含量均为最高，但可溶性固形物、抗坏血酸、总类胡萝卜素、b*显著低于其他2个品种。
南丰蜜桔特征表现为高糖低酸，椪柑则为高酸低糖，而温州蜜柑的色泽特征最好。温州蜜柑和南丰蜜桔的各活性成分含量均要高于椪柑，即包含更多的营养成分。椪柑的柠檬苦素含量显著高于其他2个品种，表现为苦味严重，而南丰蜜桔几乎不表现苦味特征。椪柑的风味品质最好，南丰蜜桔最差。3种宽皮柑橘的感官性状与李申[19]、李楠楠[20]和张震[21]的实验结果基本一致。主成分分析根据其特征表现可以将3个宽皮柑橘有效区分开来，并得出温州蜜柑更适合制汁。综上，本实验研究3种宽皮柑橘的品质特性，分析其制汁适应性，为宽皮柑橘制汁提供理论参考，对柑橘产业发展具有重要的现实意义，还可以有效缓解宽皮柑橘产量过多，市场供过于求的现状。
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