脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又被称为呕吐霉素、呕吐毒素，是单端孢霉烯族化合物的一类[1]。DON具有强烈的细胞毒性与致畸性，研究表明DON与神经障碍和免疫抑制等各种并发症有关[2-3]，严重情况下可导致死亡。DON主要由禾谷镰刀菌产生[4]，广泛出现于玉米、小麦、大麦等谷物及其产品中，可增加作物结痂的发生率，降低作物的产量和品质。据调查，在各种常见饲料原料中玉米受DON污染最为严重，检出率达97.9%，超标率达47.7%[5]。玉米是酒精发酵工业的主要原料，目前中国已成为第三大酒精生产国，年产酒精超过900万t[6-7]。玉米发酵制取乙醇过程中留下的副产物被称为“湿态玉米酒精糟(wet distillers grains with solubles broths,WDGS)”烘干后为“干态玉米酒精糟(dar disstillers grains with solubles broths,DDGS)”[8]。DDGS融合了玉米和酵母的营养成分和活性因子，可直接作为动物蛋白质饲料并且具有高蛋白，高营养等优势[9]。
DON具有热稳定性[10]，经历糖化和发酵后仍存留在玉米酒精糟中，严重影响后期副产物DDGS的品质。这种被DON污染过的DDGS营养价值及口感都大大降低，并且进入食物链中将严重危害人和动物的健康，造成巨大的经济损失，因此有必要开发一种具有成本效益的DON去除方法。前人曾采用过多种方法对DON进行降解，包括：物理方法，如紫外线照射、微波处理；添加化学强氧化剂，如臭氧[11]和二氧化氯[12]等。但是这些方法都具有不同程度的局限，例如去除效果不稳定，造成营养价值和适口性的降低。其中，最大的问题是这些技术难以与酒精发酵过程结合，不适合在酒精发酵工业中应用。
电化学氧化(electrochmical oxidation，EO)是一种新兴的处理技术，具有诸多的优点，例如反应条件温和、反应装置简单、不易产生二次污染。因此，它被称为环境友好型技术，已被广泛用于降解污水中难降解的污染物，如有残留有机氯农药[13]、残留杀虫剂[14]。但是目前利用电化学氧化技术来处理谷物中的霉菌毒素的研究还未见报道。本文采用电化学氧化法探究了电压、时间、电解质浓度3个因素对DON标品和WDGS中DON降解率的影响，确定了最优降解条件，并对处理前后WDGS中总蛋白和脂质含量进行了测定。该研究为利用电化学氧化技术去除发酵工业中难降解毒素提供了新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
WDGS，四川省资中县银山鸿展工业有限公司，常温密封保存; DON标品，新加坡 Pribolab，CAS: 51481-10-8；钛网(Ti mesh)电极，购自市场。其他试剂均购自成都蜀都有限公司。本实验中除甲醇，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
1.2 实验装置
实验装置采用“H”型电解室，将阳极室和阴极室用质子交换膜隔开进行实验。阴极和阳极电极材料均为钛网，电极面积为23.5 cm，电极间距5 cm，各室容积15 cm3(处理玉米发酵糟液所用电解室容积为100 cm3)，磁力搅拌器以1 000 r/min进行搅拌，确保样品完全混合。电位输出由CHI760E电化学工作站(上海辰华)控制。
1.3 电化学处理DON标品
电压强度及处理时间对DON降解率的影响：采用恒压模式控制以0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 V处理用电解质溶液稀释的5 μg/mL DON溶液，电解液为 0.2 mol/L NaCl溶液，处理时间为80 min。每10 min取200 μL样品检测DON含量并计算降解率。
电解质浓度对实验的影响：配置0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液作为电解质溶液，在1.2 V的恒定电压下处理60 min，每10 min取样检测DON浓度。
1.4 电化学处理WDGS
电压强度对DON降解率的影响:分别采用0.8、1.0、1.2 V处理80 mL WDGS，每10 min取10 mL样品烘干，检测DON含量，计算降解率。
NaCl对DON降解率的影响：在1.3实验的基础上，选用0.2 mol/L NaCl为实验电解质浓度，比较了添加NaCl及不添加NaCl对WDGS中DON降解率的影响。
DDGS理化性质变化：把WDGS分为添加NaCl及不添加NaCl两组，分别用1.2 V恒电压处理60 min并烘干，以未经处理的DDGS作为对照。评估了不同处理后的DDGS粗蛋白、脂质变化。粗蛋白提取采用碱提法：V(样品)∶V(提取液)(0.1 mol/L NaOH)=1∶5，50 ℃萃取2 h，以1 000 r/min搅拌，保证样品完全混合。8 000 r/min离心5 min，上清为粗蛋白提取物。采用考马斯亮蓝G-250法测定粗蛋白含量，并进行SDS-PAGE实验，采用索氏提取法测定脂质含量。
1.5 DON检测
将1 mg DON标品溶于1 mL甲醇(LC级)，配置1 g/L储备液，4℃避光保存。建立DON标准曲线，将DON标准储备液用超纯水稀释为0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/mL的系列标准工作溶液，通过HPLC检测。建立的标准曲线方程为y=0.018 8x-0.005 3(R2=0.999 9)，线性关系良好。
DDGS中DON提取参照国标GB/T(23503—2009)[15]及WANG等[11]的方法，将5 g样品放入50 mL烧瓶中，加入25 mL乙腈水(体积比84∶16)。40 ℃下超声振荡提取30 min，然后将提取物以8 000 r/min离心10 min，收集上清液。并使用固相萃取净化柱净化(Oasis HLB)，收集洗脱液在45℃和氮气下干燥。最后，将干燥的残余物用1 mL甲醇(LC级)再溶解，并通过0.22 μm有机过滤器过滤，使用HPLC进行检测。
HPLC条件：采用Waters C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：V(乙腈)∶V(水)=10∶90；柱温：30 ℃；UV检测波长：218 nm；流速：1.0 mL/min；检测体积：20 μL。
1.6 统计学分析
每组处理平行实验3次，独立重复的数据进行合并后计算用标准差。使用SPSS软件通过方差分析(ANOVA) 和Duncan检验(P<0.05) 分析所有数据。
2 结果与分析
2.1 不同电压及处理时间对DON降解率的影响
如图1所示，不同电压下DON降解率有较大差异，经80 min处理后0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 V电压对应的降解率分别为23.73%、57.02%、66.9%、79.15%、100%，当电压达到1.4 V，处理30 min后降解率即可达到100%。由于水的电解电位为1.23 V[16]，当外加电压高于1.23 V时，此时发生的不仅仅是电极的析氯反应，还伴随着强烈的水电解反应，大量的气泡从电极表面产生，更多电能用于析氧副反应[17]。这意味着更多不必要的电力消耗，且反应过程难以控制。1.2 V电压处理60 min可达到76.4%的降解率，LI等[15]用臭氧处理90 min后第降解率为53.48%。说明相比传统的氧化方法，电化学方法能够更快速高效的降解DON，具有更广阔的应用前景。
将1.2 V反应条件下各时间点的浓度与初始浓度之比进行对数转换后，拟合ln(C/C0)-t曲线，如图2所示，在0～60 min，表现出较好的线性关系，R2=0.96。说明该电化学反应在60 min符合一级动力学反应。这为将来进一步探究该电化学反应条件机理及优化实验方案提供了思路。由图2可知，在不同的电压条件下，DON降解率在前30 min内增加迅速，在30～60 min内增速变缓，60 min后降解率无明显变化。因此我们选择1.2 V，60 min作为后续实验条件。
图1 DON降解率
Fig.1 Degradation rate of DON
注：初始DON质量浓度5 μg/mL，电解质0.2 mol/L NaCl。图2同。
图2 ln(C/C0)在室温下随时间的变化
Fig.2 Variation of ln(C/C0) with the time at room temperature
2.2 NaCl浓度对DON降解的影响
不同NaCl浓度(在0～0.5 mol/L)在1.2 V条件下处理60 min后的DON降解率如图3所示。在0.2 mol/L NaCl电解液中，降解率为79.22%，当NaCl浓度达到0.3 mol/L时，DON的降解率降低至69.18%。之后，NaCl浓度增加但DON降解率变化无显著性差异。在电化学氧化过程中，溶液中活性氯物质的浓度是一个重要参数[18]。当电解液中的NaCl浓度较低时，随着NaCl含量的增加，电极的氯析出速率相应增加，电解液中的氯活性物质浓度也增加，因此降解效果显著增加。然而，当NaCl增加到一定浓度时，电解产生的大量氯气无法完全溶解在水中形成氯活性物质，一部分氯气溢出并随之有更多的氯气扩散[19]，因此溶液中氯活性物质的浓度反而降低，导致降解速率降低。综上，我们将0.2 mol/L的NaCl溶液作为实验电解质浓度进行后续实验。
图3 电解质NaCl浓度对DON降解的影响
Fig.3 Effect of NaCl concentration in electrolyte on
DON degradation
注：不同字母(a～d)的均值经Duncan检验后的差异性具有
统计学意义(P<0.05)。下同。
2.3 钛网电极重复性实验
在使用电化学氧化技术处理DON时，电极重复使用能力与DON的降解效果和设备成本息息相关。如图4所示为3次连续实验钛网电极对DON的降解率。第1次使用之后，不对电极进行任何处理即开始下一次实验，第2次实验中DON的降解效率出现了明显的下降，仅为48.96%。第2次实验之后，用甲醇对电极表面进行冲洗后再进行第3次实验，DON降解效率又回升至75.02%，与第1次电解实验的降解率无显著性差异，说明经简单处理后钛网即可具备良好的重复使用性。
图4 循环次数对DON降解的影响
Fig.4 Effect of recycling times on degradation of DON.
2.4 电压强度及NaCl对WDGS中DON降解率的影响
图5-A为添加0.2 mol/L NaCl时不同电压对WDGS中DON的影响。与处理标准品溶液过程类似，WDGS中DON的降解率也随着电压强度的升高而升高。0.8、1.0、1.2 V下对DON的降解率分别为26.25%、40.09%、51.72%。说明WDGS复杂的溶液环境可能对电化学氧化效果产生不利的影响，但仍然高于李晓等[20]用ClO2处理12 h后达到40.70%的降解率，并且大大降低了处理时间。同时也提醒了我们，WDGS复杂的溶液环境具有作为电解质的潜力，因此我们将1.2 V条件下的实验结果与不加NaCl 1.2 V处理的WDGS中DON降解率变化进行了对比。如图5-B所示，1.2 V处理60 min后DON去除率为43.28%，说明不添加额外的电解质依然具有良好的降解效果，这又进一步降低了处理成本。综上所述，虽然电化学氧化处理对WDGS中DON的降解率略低于处理标准品的降解率，但WDGS液态状态以及成分复杂的特殊特性，使得该方法仍然可以作为一种具有巨大潜力、低成本、易操作的去除WDGS中DON的可行方法。
A-不同电压下WDGS中DON的降解率;B-NaCl
对WDGS中DON降解率的影响
图5 电化学氧化处理WDGS
Fig.5 Electrochemical oxidation of WDGS
2.5 DDGS理化性质变化
由图6-A和表1可知，与未经处理的对照组相比电化学氧化处理后的DDGS中粗蛋白及脂质含量无显著性差异。图6-B为粗蛋白SDS-PAGE图，其中通道1为未经处理的DDGS的粗蛋白提取物，通道2、3分别为无NaCl和添加了0.2 mol/L NaCl的WDGS的1.2 V电解产物烘干后的粗蛋白提取物。如图7所示，3组蛋白质条带的数量一致，蛋白质条带的亮度无显著差异。说明电化学处理后的DDGS粗蛋白分子量及种类无明显变化。因此，施加电压和NaCl的添加对DDGS中营养质量含量无显著影响。
表1 电化学氧化处理后DDGS理化性质的改变
Table 1 Changes in the physicochemical properties
of EO-treated DDGS
处理 粗蛋白/%脂质/%对照13.73±0.51a8.98±0.76a电化学氧化(不添加NaCl)13.31±0.48a7.61±1.01a电化学氧化(0.2 mol/L NaCl)13.39±0.39a7.79±0.62a
注：数值表示为均值标准差(n = 3)，每列上标相同字母a表示无显著差异。
1-处理前；2-处理后(无NaCl)； 3-处理后(0.2mol/L NaCl)
A-不同处理后的粗蛋白及脂质变化;B-粗蛋白SDS-PAGE
图6 电化学氧化处理后DDGS理化性质的改变
Fig.6 Changes in the physicochemical properties of
EO-treated DDGS
3 结论
本文利用电化学氧化技术对DON标品及被DON污染的WDGS进行了处理，实验结果表明,该技术能够在短时间内有效降解DON标品及WDGS中的DON。处理时间、电压强度、电解质浓度都对DON降解率有一定程度的影响。此外，电解质的加入能够极大地提高DON降解率，处理DON标准品的最佳NaCl浓度为0.2 mol/L，再提高电解质浓度对实验结果无显著性影响。重复性实验结果表明，在电极表面可能存在某种吸附机制，吸附溶液中的物质从而影响电解效率，但这种影响可以很容易的通过甲醇冲洗去除。在处理WDGS过程中，由于其本身成分复杂的特点，使得WDGS本身可作为电解质，不需要再加入额外的电解质，大大降低了成本。电解处理后，DDGS的粗蛋白和脂质含量无明显变化。本研究为利用电化学氧化技术在乙醇发酵过程中去除DON提供了新思路，这可以作为在大规模生产中去除霉菌毒素的有效方法。
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