甲基咪唑类物质是焦糖色素生产中的副产物，焦糖色素作为重要的食品添加剂，广泛应用于食品加工生产中。国际技术焦糖色素协会(ITCA)根据生产过程中所采用的反应剂而把焦糖色素分为四大类，对应的生产工艺为普通法(Ⅰ类)、苛性硫酸盐法(Ⅱ类)、氨法(Ⅲ类)和亚硫酸铵法(Ⅳ类)[1]。其中，Ⅲ类和Ⅳ类焦糖色素在制作过程中会产生副产物4-甲基咪唑。国际癌症机构(IARC)将4-甲基咪唑列为2B类致癌物，即人类可能的致癌物[2]。相关研究表明，4-甲基咪唑具有类似吡啶、吡咯的毒性，抑制细胞色素P450同功酶，在人的肝脏中发生催化反应，同时产生许多低分子质量致癌物，能诱发动物惊厥还会导致甲状腺肿瘤[3-5]；有致癌和白血病的风险[6]。我国的食品安全国家标准中规定Ⅲ类和Ⅳ类焦糖色素中4-甲基咪唑的含量不得高于200 mg/kg，同时对不同食品中焦糖色的含量进行了限定[1,7]。2-甲基咪唑、N-甲基咪唑均为4-甲基咪唑的同分异构体，目前，国内外均未对这2种甲基咪唑类物质进行明确的限量规定。蚝油以牡蛎为原料，经煮熟熬制浓缩而成，其含有丰富的蛋白质，为餐饮中常用的鲜味调料。目前，对食品中甲基咪唑类物质的检测多见于酱油、醋、饮料等液体调料及食品中[8-10]，未有蚝油中相关检测方法的报道；关注物质以4-甲基咪唑[11-12]为主，2-甲基咪唑[13-15]也有涉及，未见对N-甲基咪唑的涉及。检测方法主要有紫外可见分光光度法[16-18]、液相色谱法[19-20]、液相色谱串联质谱法[21-23]、气相色谱法[24-25]、气相色谱串联质谱法[26-28]等。本文运用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法实现蚝油中N-甲基咪唑、2-甲基咪唑及4-甲基咪唑的同时检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
N-甲基咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑标准品，德国Dr. Ehrenstorfer Gmb H公司；N-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6、4-甲基咪唑-D6标准品，加拿大TRC公司；乙腈(色谱纯)、乙酸铵(色谱纯)，美国Thermo Fisher公司；甲醇(分析纯)、甲酸(分析纯)、正己烷(分析纯)、乙腈(分析纯)，国药化学试剂有限公司。
标准储备溶液：精确称取甲基咪唑类及其内标标准品各10 mg，分别置于10 mL棕色容量瓶中，乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的标准储备溶液，避光、-18 ℃保存。
混合标准储备液：分别量取100 μL N-甲基咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑标准储备液，置于同一10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容至10 mL，配制成浓度10 μg/mL的3种甲基咪唑混合标准储备液。
混合内标标准储备液：分别量取100 μL N-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6、4-甲基咪唑-D6标准储备液，置于同一10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容至10 mL，配制成浓度10 μg/mL的3种甲基咪唑混合内标标准储备液。
混合标准溶液系列：用90%乙腈水(体积分数)逐级稀释混合标准溶液，配制成外标浓度为5、10、20、50、100、200 ng/mL，内标浓度均为25 ng/mL的混合标准溶液系列。
1.2 仪器与设备
ACQUITY UPLC-Xevo TQD超高效液相色谱串联质谱仪，美国沃特世公司；MULTIFUGE X1R高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔公司；H·SWX-6008S电热恒温水温箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；GM200型刀式研磨仪，德国莱驰公司；T18 均质器，德国艾卡公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
称取2.0 g蚝油样品(精确到0.01 g)置于50 mL离心管中，加入50 μL浓度为1 μg/mL的3种甲基咪唑内标混合标准溶液，静置20 min后，加入20 mL水，涡旋1 min使其混合充分后，置于恒温水浴锅中，70℃下水浴加热10 min，静置室温后超声提取20 min，并以10 000 r/min， 4 ℃下离心10 min，取上清液于一新的离心管中。吸取10 mL上清液过MCX固相萃取柱(6 cc，150 mg)(先用5 mL甲醇活化，再用5 mL水淋洗平衡)，依次用5 mL的2%甲酸水溶液，5 mL乙腈淋洗，1.5 mL正己烷淋洗2次，再用8 mL 5%氨化甲醇溶液洗脱，收集全部洗脱液，45℃氮吹至近干，精密加入乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液(体积比9∶1)1 mL，涡旋30 s，过0.22 μm有机滤膜，滤液供液相色谱串联质谱仪测定。
1.3.2 液相色谱方法
色谱柱：Agilent Poroshell 120 Hilic(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)；柱温：35 ℃；样品室温度：10 ℃；进样量: 10 μL；流动相：乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液(体积比9∶1)；流速：0.4 mL/min；时间：5 min。
1.3.3 质谱方法
离子源：电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)；毛细管电压：3.2 kV；离子源温度：120 ℃；脱溶剂气温度：400 ℃；锥孔气流：氮气，流速50 L/h；脱溶剂气流：氮气，流速650 L/h；碰撞气：氩气。其他质谱条件参数见表1。
2 结果与分析
2.1 色谱柱的选择
表1 三种甲基咪唑类物质及内标物质多反应监测模式参数
Table 1 The MRM parameters of three methylimidazoles
and internal standards
化合物名称母离子(m/z)子离子(m/z)锥孔电压/V碰撞电压/VN-甲基咪唑83 56∗35154235152-甲基咪唑83563714 42∗37144-甲基咪唑83 56∗30144230154-甲基咪唑-D6886030152-甲基咪唑-D688444018N-甲基咪唑-D689453515
注：*为定量离子。
在流动相为5 mmol/L乙酸铵与乙腈混合液(体积比1∶9)，0.4 mL/min的流速下，比较了BEH HILIC、Poroshell 120 HILIC、Acclaim HILIC-10、Acclaim Mix-Mode HILIC-1四个型号色谱柱在分离3种甲基咪唑类化合物上的效果，结果如图1所示。Acclaim HILIC-10无法实现4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的基线分离；Acclaim Mix-Mode HILIC-1可实现3种物质的分离，但目标物保留时间较长且前端杂质峰明显；BEH HILIC可将3种化合物基本分开，但基线分离效果不好；Poroshell 120 HILIC可达到较好的分离度。综上，选择Poroshell 120 HILIC作为色谱柱进行条件的优化。
a-Poroshell 120 HILIC;b-BEH HILIC； c-Acclaim HILIC-10;
d-Acclaim Mix-Mode HILIC-1
图1 不同色谱柱对3种甲基咪唑类物质的分离效果
Fig.1 The separation results of three methylimidazoles
by different columns
2.2 前处理过程优化
2.2.1 提取试剂的选择
比较了乙腈、水、2%甲酸水的提取效果，图2为3种试剂提取甲基咪唑结果显示，3种试剂均可将3种甲基咪唑类物质提取出。但相较于2%甲酸水和水，乙腈对3种甲基咪唑类物质的提取效率偏低；2%甲酸水和水的提取效率相当，但以2%甲酸水为提取液时，净化过程中的过柱速度较慢。因此在试验中选择以水作为提取试剂。
图2 不同提取试剂下3种甲基咪唑类物质的提取效率
Fig.2 The extraction results of three methylimidazoles
by different extraction solutions
2.2.2 净化方式的选择
因甲基咪唑类化合物是强极性化合物，选择阳离子交换固相萃取柱对其进行分离。将加标浓度均为30 μg/kg的蚝油样品按上述过程提取，过MCX固相萃取柱，用2%甲酸淋洗后，分别以甲醇、乙腈、正己烷作为淋洗液对样品做进一步净化。如图3所示，甲醇作为淋洗液时，3种目标化合物的分析谱图与标准溶液存在较大差异，保留时间均有明显的偏移，且随着分析样品的增多，谱峰逐渐变宽，峰形变差，严重影响色谱柱的柱效。分析其原因，蚝油样品中含有的动物蛋白、油脂等成分，未能被甲醇去除。
a-经甲醇净化;b-标准溶液
图3 甲醇净化对3种甲基咪唑类物质的影响
Fig.3 The result of the three methylimidazoles purified
with methanol
乙腈和正己烷分别作为淋洗试剂，均可有效地改善谱峰偏移及变宽的问题。表2所示为分别使用乙腈、正己烷，及同时依次使用乙腈、正己烷作为淋洗试剂时，3种甲基咪唑类化合物的回收率情况。蚝油中含有较为丰富的蛋白质和动物油脂，净化时使用乙腈，可更好地除去附着在固相萃取柱中的蛋白质；进一步使用正己烷，可将其中的油脂类物质去除，实现较好的净化效果。实验数据表明，二者的使用不会对已富集在固相萃取柱填料中的甲基咪唑类物质产生影响。同时依次使用乙腈、正己烷作为淋洗试剂时，可使3种化合物回收率均在80%～120%，满足方法学要求。
表2 不同淋洗液下3种甲基咪唑类化合物的回收率 单位：%
Table 2 The recoverise of three methylimidazoles
by different cleaning solutions
淋洗液种类4-甲基咪唑2-甲基咪唑N-甲基咪唑乙腈86～11994～9988～128正己烷109～118100～106101～131乙腈-正己烷98～11291～9690～118
2.3 检出限、定量限与线性范围
分别配制质量浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的3种甲基咪唑类物质标准混合溶液，自动进样10 μL，进行UPLC-MS/MS分析。目标物以多反应监测模式下的峰面积为Y坐标，与其对应的标准混合溶液质量浓度为X坐标，作标准曲线。选取甲基咪唑本底含量相对较低的蚝油样品，方法检出限以加标样品检测色谱峰信噪比RSN≥3确定，方法定量限以加标样品检测色谱峰信噪比RSN≥10确定，因考虑到3种甲基咪唑类物质的响应不同，满足上述信噪比要求时的最低浓度有所差异，为兼顾3种物质同时便于实验操作，分别将检出限及定量限进行统一，具体结果详见表3。结果表明，3种甲基咪唑类物质在5.0～200.0 ng/mL的线性范围内线性关系良好，线性系数R2均大于0.996，能满足定量分析的要求。方法对于3种甲基咪唑类物质检出限为5 μg/kg，定量限均为10 μg/kg。
表3 三种甲基咪唑类物质线性范围、回归方程及线性
相关系数
Table 3 Linear ranges, linear equations and correlation
coefficients of the three methylimidazoles
目标化合物线性范围/(ng·mL-1)校正曲线R2检出限/(μg·kg-1)定量限/(μg·kg-1)N-甲基咪唑5～200Y= 2.369 9X+5.375 080.9965102-甲基咪唑5～200Y= 3.073 26X+3.235 040.9995104-甲基咪唑5～200Y=1.777 29X+2.609 50.999510
2.4 回收率及精密度
在蚝油样品中分别添加低、中、高(10、20、100 μg/kg)3个水平的混合标准溶液，每个加标水平重复6次，标准溶液工作曲线进行校正，内标法定量，得到方法的回收率及精密度如表4所示。结果表明，3种甲基咪唑类物质在3个加标水平下，回收率在82.9%～113.1%，6次重复测定的相对标准偏差均小于10%，满足方法学要求。
2.5 实际样品分析
用上述方法对北京市售16个蚝油样本进行了3种甲基咪唑类物质的测定，结果显示16个样品均检出4-甲基咪唑，检出值为40～410 μg/kg，6个样本检出2-甲基咪唑，检出值为11～26 μg/kg；7个样品检出N-甲基咪唑，检出值为10～36 μg/kg。且2-甲基咪唑或N-甲基咪唑有检出的样本，其4-甲基咪唑检出值偏高，均在100 μg/kg以上。16个蚝油样品标签均显示配料成分中含有焦糖色，我国现行标准规定，焦糖色中4-甲基咪唑含量不得超过200 mg/kg，而对蚝油中焦糖色(加氨生产)的使用量未有明确的限量要求。
表4 三种甲基咪唑类物质在不同加标水平下加标回收率及相对标准偏差(n=6)
Table 4 Recoveries and RSDs of the three methylimidazole at three levels
目标化合物10 μg/kg20 μg/kg100 μg/kg本底值/(μg·kg-1)回收率/%相对标准偏差/%本底值/(μg·kg-1)回收率/%相对标准偏差/%本底值/(μg·kg-1)回收率/%相对标准偏差/%N-甲基咪唑11.9111.36.411.9111.96.011.998.47.82-甲基咪唑6.2113.12.76.2111.33.26.2107.60.94-甲基咪唑87.698.58.887.682.97.887.6103.26.7
3 结论
本文建立了水提取，MCX固相萃取柱净化，超高效液相色谱串联质谱法同时测定蚝油中N-甲基咪唑、2-甲基咪唑及4-甲基咪唑的方法，3种物质的定量限均为10 μg/kg，该方法良好解决了蚝油的净化问题，建立了灵明度高、重现性好，准确度高的方法，已在实际监测中应用。
[1] GB 1886.64—2015,食品安全国家标准食品添加剂焦糖色[S].北京：中国标准出版社，2015.
[2] GROSSE Y,BAAN R,SECRETAN-LAUBY B,et al.Carcinogenicity of chemicals in industrial and consumer products,food contaminants and flavourings,and water chlorination by products[J].Lancet Oncol,2011,12:328-329.
[3] BAAN R, GROSSE Y, SECRETAN-LAUBY B,etal.Carcinogenicity of radiofrequency electromagnetic fields[J].Lancet Oncol,2011,12(7): 624-626.
[4] 孟颖.焦糖色素着色食品中甲基咪唑测定方法的研究及应用[D].太原:山西大学,2014.
[5] CHAN P,MAHLER J,TRAVLOS G,et al.Induction of Thyroid lesions in 14-week toxicity studies of 2 and 4-methylimidazole in fischer 344/N rats and B6C3F1 mice[J].Archives of Toxicology,2006,80(3):169-180.
[6] CHAN P C,HILLS G D,KISSLING G E,et al.Toxicity and carcinogenicity studies of 4-methylimidazole in F344/N rats and B6C3F1 mice[J]. Archives of Toxicology,2008,82 (1):45-53.
[7] GB 2760—2014 食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].北京，中国标准出版社，2014.
[8] 杨朦,韩倩,王雨萌,等.磁性分子印迹聚合物联合HPLC快速富集和检测酱油中4-甲基咪唑[J].甘肃科学学报,2019,31(2):40-45.
[9] 李建平,渠志华,王辰,等.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定啤酒中4-甲基咪唑的含量[J].中国食品卫生杂志,2016,28(5):610-613.
[10] FMNG T T, WU J H, LIANG X, et al. Isotope dilution determination for the trace level of 4(5)-methylimidazole in beverages using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with ESI-HPLC-MS/MS[J]. Food Chemistry, 2018, 245:687-691.
[11] 于淑娟,刘定波,徐献兵,等.离子色谱-质谱联用法测定4-甲基咪唑的含量[J].华南理工大学学报(自然科学版),2015,43(2):8-12.
[12] 吴翠华,郑学殷,李巧琪,等.QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱法测定酱油中的4-甲基咪唑[J].当代化工,2018,47(3):653-656.
[13] 庞美蓉,林钦,戴明,等.超高效液相色谱-串联质谱法同步检测食品中的2-甲基咪唑及4-甲基咪唑[J].分析测试学报,2016,35(8):943-948.
[14] 刘芸,丁涛,费晓庆,等.高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱检测酱油中的4-甲基咪唑与2-甲基咪唑[J].分析测试学报,2015,34(4):381-387.
[15] 陈小曼,陈漾,李攻科,等.表面增强拉曼光谱法测定饮料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑[J].分析化学,2016,44(5):816-821.
[16] 周菊峰,刘文奇,李河冰,等.分光光度法测定酱油中4-甲基咪唑[J].粮食科技与经济,2015,40(5):45-47.
[17] 黄志勤,屈海云.分光光度法测定焦糖色中4-甲基咪唑[J].中国调味品, 2005(6): 52-54.
[18] 陈岩,赵宇明. 紫外可见光谱法测定食醋中4-甲基咪唑含量[J]. 食品研究与开发, 2016, 37(24): 128-131.
[19] 荣维广,宋宁慧,阮华,等.固相萃取-高效液相色谱法测定焦糖色素中副产物2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-(1,2,3,4-四羟基丁基)咪唑[J].分析化学,2015,43(5):742-747.
[20] 王淼,陈海珍.高效液相色谱法测定焦糖中4-甲基咪唑的含量[J].中国处方药,2015,13(10):25-26.
[21] SCHLEE C, MARLOVA M, SCHRANK J,et al.Determination of 2-methylimidazole,4-methylimidazole and 2-acetyl-4-(1,2,3,4-tetrahydro -xybutyl)imidazole in caramel colours and cola using LC/MS/MS[J].Journal of Chromatography B,2013,927:223-226.
[22] 李锦清,綦艳,郦明浩,等.固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定酱油中4-甲基咪唑[J].中国调味品,2016,41(1):132-135；143.
[23] 王丽英,任贝贝,杨立新,等.同位素稀释超高效液相色谱-串联质谱法测定酱油、醋和饮料中的4-甲基咪唑[J].食品安全质量检测学报,2015,6(3):962-967.
[24] 赵文素.毛细管气相色谱法检测调味料中4-甲基咪唑[J].天津科技,2014,41(8):5-6；12.
[25] 彭向前,冯玮,石海英,等.气相色谱法同时检测焦糖色素中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑[J].中国调味品,2012,37(8):83-85.
[26] CUNHA C,SENRA L,FERNANDES J O,et al.Gas chromatography-mass spectrometry analysis of 4-methylimidazole in balsamic vinegars and processed sauces[J].Food Analytical Methods,2014,7 (7)：1 519-1 525.
[27] CHOI S J， JUNG M Y. Simple and fast sample preparation followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) for the analysis of 2- and 4-methylimidazole in cola and dark beer[J]. Journal of Food Science, 2017, 82(4):1 044-1 052.
[28] WIECZOREK M 
H H.Determination of 4-methylimidazole in ammonia caramel using gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS)[J]. Journal of Food Quality, 2018, 2018:1-5.