食用牛油是由优质的牛脂肪组织加工提炼而成的一类动物油脂，熔点较高，通常呈固态。牛油因富含维生素、矿物质、脂肪酸等营养物质及其独特风味，被广泛应用于食品工业中。在川渝地区，牛油火锅底料主要是由牛油、花椒、辣椒、香辛料等复合制成[1]，麻辣鲜香，独具地方特色。同时也因其独特醇香倍受人们的欢迎，而牛油作为一种香味来源在火锅中起着至关重要的作用。总而言之，油脂气味是一项重要的感官指标，也是形成油脂独特风味的重要因素之一。通过探究牛油油脂挥发性气味组成成分不仅可以了解油脂的具体风味来源，探究典型传统风味形成机制，而且还能通过油脂气味的细微变化获知其品质是否劣化，为油脂在研发、运输、储藏等各个环节的品质控制提供科学依据。

目前，国内外鲜有关于食用油脂理化性质及其挥发性风味物质的研究报道，尤其是食用牛油。李桂华等[2]利用气相色谱法(gas chromatography, GC)分析测定了河南和内蒙古自治区的牛油脂肪酸组成，结果显示牛油中饱和脂肪酸含量较高，主要包括豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸；I ROMERO等[3]分析了固相微萃取-气质联用技术(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, SPME-GC-MS)用于测定初榨橄榄油中挥发物实际浓度的精密度和准确度，表明该法在油类挥发物质分析研究中的可靠性。吕晓玲等[4]采用顶空固相微萃取-气质联用技术(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)研究加工各阶段牛油挥发性成分，检测出毛牛油、脱酸牛油、脱色牛油、精制牛油分别含有54、56、63、26种挥发性成分，包括烃、醇、醛、酮、酸、醚及少量杂环化合物。但至今未见针对不同香型牛油风味物质及形式机制的研究。本实验在探究不同香型牛油理化性质及脂肪酸含量之间是否呈现一定规律的基础上，采用HS-SPME-GC-MS对不同香型牛油的风味成分进行分析，并建立食用牛油的风味特征指纹图谱。同时，结合相对气味活度值(relative odor activity value, ROAV)法，对其关键风味物质进行分析评价，为进一步探究牛油风味形成机制提供理论基础。此外，以此研究为基础，若合理地选用关键香味物质不仅能强化牛油特征风味、减少风味损失，还可实现产品风味多样化[5]，为新型优质复合风味产品的开发及牛油的产业化发展提供指导方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3种不同香型牛油(无香、淡香、浓香)由四川省广汉市迈德乐食品有限公司提供；所有用于色谱的有机溶剂均为色谱纯；1,1,3,3-四乙氧基丙烷标准品购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

PEN3便携式电子鼻系统，德国Airsense公司；QP 2010 PLUS色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；SPME手动进样手柄，上海安谱实验科技股份有限公司；75 μm PDMS/CAR萃取纤维头，北京康林科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指标检测

酸价(acid value, AV)参考GB 5009.229—2016，过氧化值(peroxide value, PV)参考GB 5009.227—2016，丙二醛(malondialdehyde, MDA)参考GB 5009.181—2016和参考文献[6]测定。

1.3.2 GC-MS脂肪酸分析

样品前处理：按照GB 5009.168—2016进行脂肪酸的皂化和甲酯化处理，用以GC-MS成分分析。每个样品平行3次，测定结果取平均值。

色谱条件：DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度250 ℃[7]。程序升温：起始温度140 ℃，保持2 min； 20 ℃/min升温至200 ℃，保持5 min；1 ℃/min升温至220 ℃，保持10 min；5 ℃/min升温至240 ℃，保持5 min。载气He，流速1.13 mL/min，分流比80∶1。

质谱条件：离子源EI；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；接口温度280 ℃；质量扫描范围m/z：40～350。

数据处理：将样品质谱图数据与NIST 147质谱数据库进行检索对比，再结合MS图中的特征碎片离子即可对相应化合物定性[8]。采用峰面积归一化法进行定量分析，测得各组分的相对百分含量。

1.3.3 电子鼻检测

准确量取10 mL牛油样品置于30 mL螺旋塞样品瓶中，加盖密封， 50 ℃加热平衡15 min。电子鼻数据采集时间150 s，传感器清洗时间100 s，载气流速150 mL/min，延滞时间600 s，每组6个平行。

本实验所用电子鼻的10个传感器及其对应的灵敏物质见表1。

1.3.4 HS-SPME-GC-MS分析

准确称取6 mL油样置于20 mL顶空瓶中，用带有隔垫的瓶盖密封，置于集热式恒温加热磁力搅拌器，在60 ℃条件下搅拌平衡30 min。通过隔垫将已老化(温度250 ℃、时间15 min)好的75 μm PDMS/CAR固相微萃取头插入顶空瓶中距离液面1 cm处，吸附30 min，待GC-MS分析。

色谱条件：DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度250 ℃。程序升温：起始温度40 ℃，保持3 min； 4 ℃/min升温至180 ℃，保持2 min； 35 ℃/min升温至250 ℃，保持2 min。载气He，流速1.0 mL/min，不分流进样。

质谱条件：离子源EI；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；接口温度250 ℃；质量扫描范围m/z：33～550。

数据处理：结合计算机NIST 147质谱数据库进行检索对比定性，采用峰面积归一化法进行定量分析，测得挥发性物质各组分的相对百分含量。

1.3.5 牛油的关键风味物质分析

不同挥发性风味物质对总体风味的贡献程度不能仅由其浓度高低得出，还需考虑其感觉阈值。参照刘登勇等[9]提出的相对气味活度值(ROAV)法进行综合分析，定义ROAV≥1的组分为关键风味化合物，0.1≤ROAV<1的组分为重要风味化合物，对样品总体风味具有重要的修饰作用。各挥发性风味物质的ROAV值按照如下公式[10]进行计算：

ROAVA≈100××

式中：CA，各挥发性风味物质的相对含量，%；TA，各挥发性风味物质的感觉阈值，μg/kg；Cmax，对总体风味贡献最大的挥发性风味物质的相对含量，%；Tmax，对总体风味贡献最大的挥发性风味物质的感觉阈值，μg/kg。所有组分都满足0<ROAV≤100，ROAV值越大的挥发性风味物质对总体风味的贡献也越大。

2 结果与分析

2.1 三种香型牛油理化指标比较

3种香型牛油理化指标检测结果见表2。

过氧化值反映油脂和脂肪酸被氧化程度，可以作为油脂酸败的定性和定量检验参考依据[11]。由表2所示，3种香型牛油过氧化值较小，且无差异，表明3种香型牛油均具有较强的稳定性。油脂在一定条件下会分解产生游离脂肪酸，而酸价则反映了油脂中游离脂肪酸的含量，是油脂酸败的晚期指标。酸价越低，说明油脂精炼度越高、质量越优[12]。本实验结果显示浓香型牛油酸价最高，无香型牛油酸价最低。从该指标变化趋势可以看出，油脂精炼程度影响牛油脂肪酸组成，故推测游离脂肪酸含量与牛油风味的形成存在一定关系。由表2所示，3种香型牛油中丙二醛含量随香气浓度增加呈现递增趋势，与酸价变化相符。丙二醛是油脂酸败最终产物的代表之一。游离脂肪酸中不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid, UFA)的过氧化物经过降解也可生成丙二醛等物质，引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，最终对机体产生细胞毒性[13]，具有一定的食用安全性指导意义。因此，油脂的理化指标对牛油品质及风味比较分析具有一定的借鉴作用。本实验中分析的理化指标虽然从不同角度反映油脂的品质，但均受油脂中脂肪酸组成影响，与牛油风味香型变化呈现一定的相关性。因此，有必要对不同牛油的脂肪酸组成进行具体分析。

2.2 GS-MS脂肪酸分析

3种香型牛油经甲酯化处理后进行了GC-MS分析，得到总离子流图(total ion chromatogram, TIC)。无香型、淡香型及浓香型牛油分析结果如图1所示。从甲酯化产物中共鉴定出31种脂肪酸甲酯化组成成分，并将结果整理还原成脂肪酸组成，结果见表3。

由表3可以看出，不同香型牛油脂肪酸组成有所不同，其差异主要是因为各脂肪酸碳链长短和不饱和键数量不同[14]，部分脂肪酸甚至未检出。结果显示，3种香型(无香、淡香、浓香)牛油共有的脂肪酸共检测出12种，且共有脂肪酸总含量分别为77.59%、94.44%、89.75%，所占比例较大。其中，棕榈酸、9-(Z)-十八碳烯酸、硬脂酸和亚油酸是3种香型牛油最主要且共有的脂肪酸。在共有的脂肪酸中，9-(Z)-十八碳烯酸、肉豆蔻脑酸及油酸含量均随香气的增强而增加，表明这3种游离脂肪酸可能对牛油风味有较大贡献。有研究表明，游离脂肪酸一方面直接作为风味化合物，另一方面也作为风味前体物贡献油脂的特征风味[15]。值得注意的是，UFA是风味形成的重要前体物质[16]。本实验研究的3种牛油(无香、淡香、浓香)UFA总含量分别为30.16%、33.60%、41.95%，其中以9-(Z)-十八碳烯酸为代表。由此可推断，9-(Z)-十八碳烯酸的含量对牛油风味具有较大的影响。浓香型牛油独有的脂肪酸也大部分属于UFA，如甲基(9E)-十六碳-9-烯酸、花生四烯酸、5,8-十八碳二烯酸等。然而，UFA本身易发生氧化反应，产生醛、酮、酸等物质，导致牛油哈败变质，即人们所说的“哈喇味”[17]，降低产品风味品质。该结果揭示了牛油理化指标中酸价、丙二醛指标随牛油香型不同产生变化规律的原因所在，验证了牛油油脂中UFA组成及含量与牛油的品质及其特征风味的形成密切相关。

注：“-”表示未检出。

2.3 电子鼻测定结果分析

2.3.1 主成分分析

电子鼻分析通过模拟人类嗅觉系统实现对不同样品的整体香气特征进行区分[18]，其分析方法主要包括主成分分析(principle component analysis, PCA)和线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA)。PCA分析法将所提取的传感器多指标信息进行数据转换和降维，对降维后的特征向量进行线性分类得到二维散点图[19]，从而把复杂的多变量信息简单直观地表达出来。通过PCA，不同香型牛油样品在第一和第二主成分中的得分散点图如图2所示。图中主成分1(PC1)的方差贡献率为98.72%，主成分2(PC2)方差贡献率为0.85%，累积方差贡献率达99.57%。说明通过PCA分析可以将10个传感器作为变量的电子鼻图谱矩阵转换成以PC1和PC2作为变量的得分矩阵，并且保留了电子鼻的香气图谱里99.57%的信息[20]。但如图2所示，3种香型牛油具有相似的感应特征，彼此交叠，说明不同香型牛油之间的风味组成成分相近，利用电子鼻结合PCA分析所得数据间差异并不明显，因此，考虑进行LDA分析。

图2 三种风味牛油主成分分析图
Fig.2 PCA analysis of three types of butter with three
different flavors

2.3.2 LDA

LDA分析法是有监督模式的线性模式识别算法，能弥补PCA分析法的不足。相比之下，它能从所有数据中收集信息，进一步提高分类精度[21]。3种香型牛油样本的LDA如图3所示。图中LD1和LD2的贡献率分别52.02%、28.66%，两种主成分的总贡献率为80.68%。由图3所示，3种不同香型牛油的分析数据点分布于各自区域，各椭圆区域互不重叠，表明利用LDA能准确识别出不同香型牛油的特征气味，并对其进行良好区分。从椭圆区域之间的距离来看，浓香型牛油所在椭圆区域和淡香型牛油所在椭圆区域距离较远，但二者与无香型牛油所在椭圆区域距离相差不大，说明浓香型和淡香型牛油的挥发性风味物质差异较大，为探究具体差异还需做进一步定性定量分析。

图3 三种风味牛油线性判别分析图
Fig.3 LDA analysis of three types of butter with three
different flavors

2.4 不同香型牛油挥发性物质分析

运用HS-SPME-GC-MS并结合计算机质谱数据库检索，采用峰面积归一化法测得挥发物质各组分的相对百分含量。无香型、淡香型和浓香型牛油鉴定出的化合物占易挥发成分总量的比例分别为：93.55%、94.47%、89.04%(见图4)。由图4可以看出，不同香型牛油的挥发性物质中醛类化合物占比最多(70.14%，75.93%，79.6%)，其次是烃类化合物(6.48%，10.13%，1.42%)、其他类化合物(7.62%，6.72%，2.97%)和醇类化合物(5.22%，1.33%，2.11%)。此外，结果发现，随着牛油香气浓度的增强，3种牛油中醛类化合物的相对含量也随之增加，但是烃类化合物含量最高为淡香型牛油，由此可以初步推测：不同香型牛油中起决定性作用的挥发性化学成分可能是醛类化合物，淡香型牛油中可能存在重要的烃类风味化合物。

图4 三种香型牛油挥发性物质相对含量比较
Fig.4 Comparison of relative contents of volatile substances
in three types of butter with three different flavors

3种香型牛油经分析所得TIC图如图5所示，其化合物名称、相对含量(以相对峰面积%计)结果见表4。从牛油中共鉴定出62个挥发性化合物。牛油的挥发性风味物质主要包括烃类(19个)、醇类(10个)、醛类(10个)、酮类(8个)、酯类(8个)、其他化合物(7个)。

由表4可以看出，3种香型(无香、淡香、浓香)牛油挥发性风味物质组成差异较大，分别检出风味化合物34、27、23种。无香型牛油中主要的风味物质有右旋萜二烯、正戊醇、4-乙基环己醇、异戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、仲辛酮、己酸丁酯、2-正戊基呋喃、1,2,4,5-四甲苯和五甲基苯；淡香型牛油中主要的风味物质有右旋萜二烯、异戊醛、己醛、庚醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、辛醛、壬醛、2-正戊基呋喃、1,2,4,5-四甲苯和2-乙基对二甲苯；浓香型牛油中主要的风味物质有(-)-柠檬烯、环氧丙醇、戊醛、异戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和2-正戊基呋喃。除共有的6种风味化合物(异戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和2-正戊基呋喃)外，3种香型牛油均具有各自独有的风味物质，且共有的6种化合物中有5种均是醛类，进一步推测醛类化合物在牛油风味中起主要作用，但不同香型牛油中也存在其他风味物质贡献特殊风味。

续表4

注：“-”表示未检出；下划线标注的为3种香型牛油的共有风味化合物；NF表示未查阅到相应化合物的感觉阈值。

2.4.1 醛类化合物

醛类化合物是3种牛油样品(无香、淡香、浓香)最重要的挥发性风味物质，主要包括异戊醛(分别为13.61%、14.45%、12.58%)、己醛(分别为34.46%、37.43%、24.01%)、庚醛(分别为10.74%、12.67%、18.35%)、辛醛(分别为5.16%、5.23%、7.58%)、壬醛(分别为5.17%、4.05%、13.16%)。异戊醛稀释后有令人愉快的果香气味，己醛呈生的油脂和青草气及苹果香味，庚醛呈鱼腥气味，辛醛有类似蜂蜜的气息，壬醛呈玫瑰香、柑橘香，具有脂肪香气[26-27]。庚醛、辛醛和壬醛相对含量均随着牛油香气增强而增加，由此可以推测这3种醛类可能是导致3种牛油香气差异最主要的物质；而反式-2-戊烯醛和反式-2-己烯醛是无香型牛油独有的醛类特征风味物质；(E,E)-2,4-壬二烯醛和4-异丙基苯甲醛是淡香型牛油独有的醛类特征风味物质，其中(E,E)-2,4-壬二烯醛含量最高，呈甜香味或米饭香[28]，表明其可能对淡香型牛油风味有特殊贡献；戊醛是浓香型牛油独有的醛类特征风味物质且含量较高，它的阈值低且稀释后具有面包香或果香，可以推测戊醛在一定程度上强化了牛油香气。

2.4.2 烃、醇、酮、酯及其他化合物

从整体比例上看，其余化合物对牛油香气形成的贡献不如醛类化合物显著，但是对牛油整体风味也有其特殊的贡献。由表4可以看出，除醛类物质外，2-正戊基呋喃是不同香型牛油中仅存的共同风味化合物，并且3种香型牛油的烃类化合物种类最多。

各种烷烃(C5-C17)物质，因其香气阈值一般较高，香气较弱或无气味，对整体风味直接的贡献并不大。但风味研究中[29]认为它们是形成对肉的风味有贡献的杂环化合物的重要中间体，可以推测，该类物质对牛油产品肉香风味的形成具有不可忽视的基底作用。无香型和淡香型牛油中均含有右旋萜二烯(分别为2.92%、8.02%)，此类风味化合物具有似柠檬香、橙香[30]的清淡香气，表明烃类化合物中的右旋萜二烯可能对淡香型牛油的清淡香气做出了较大贡献。

大部分醇类化合物含有令人愉快的香气，其中不饱和醇类物质阈值较低，对风味贡献较大[31]，但本实验结果显示，检测出的大部分醇类化合物为饱和醇，且多数醇类化合物为无香型牛油所独有，淡香型和浓香型牛油的醇类化合物含量均较少，说明醇类化合物可能对牛油风味贡献较少。其中浓香型牛油独有的环氧丙醇虽含量较高，但其并不具有特殊香气。

多数酮类化合物具有特殊的清香气味，且香味优异持久，但其阈值较高，对气味的贡献相对较小。本实验中，淡香型牛油仅含1种酮类化合物且含量极低，无香型、浓香型牛油独有的酮类化合物种类较多，因此酮类化合物可能是淡香型牛油与其余两者产生差异的主要原因。

酯类化合物多有特殊气味且具有调味作用，它为食品提供水果清香、花香和蜂蜜的味道[32]。如表4所示，仅浓香型牛油有较多酯类物质，丙氨酸乙酯仅存于淡香型和浓香型牛油(分别为0.14%、0.97%)，可推断酯类化合物对增加牛油香气可能具有重要的作用。

在其他化合物中，呋喃类化合物大都具有很强的肉香味以及极低的香气阈值，几乎存在于所有的食品香味中[33]。2-正戊基呋喃具有类火腿香味，在3种香型(无香、淡香、浓香)牛油中含量分别为1.43%、1.77%、2.66%，含量较高且呈递增的现象，因此2-正戊基呋喃是牛油风味中至关重要的一种风味物质。

2.5 牛油关键风味物质的确定

根据1.3.5提到的方法，计算3种香型牛油中各挥发性风味物质的ROAV值，以确定关键风味物质(ROAV≥1)和重要风味物质(0.1≤ROAV<1)，无香型、淡香型、浓香型牛油挥发性风味物质分析结果如表5、表6、表7所示。醛类风味物质对牛油的整体风味贡献最大，其余类别风味物质贡献相对较小。3种香型牛油共有的关键风味物质有：异戊醛、己醛、庚醛、辛醛和壬醛，其中异戊醛对三者的风味贡献最大，己醛、庚醛、辛醛和壬醛对三者的风味贡献较大，但对三者贡献程度略有不同，表明异戊醛、己醛、庚醛、辛醛和壬醛是形成牛油香气的主体风味物质，也是造成不同牛油香气差异的主要原因。(E,E)-2,4-壬二烯醛是淡香型牛油独有的醛类关键风味物质，戊醛是浓香型牛油独有的醛类重要风味物质。除醛类外，右旋萜二烯是无香型牛油的重要风味物质，也是淡香型牛油的关键风味物质。2-正戊基呋喃对3种香型牛油风味贡献均较小，但也起着重要的修饰作用，表明2-正戊基呋喃对牛油总体风味存在一定贡献。正戊醇、正己醇因为相对含量低且感觉阈值高，对牛油的风味贡献很小，庚醇是无香型牛油独有的醇类重要风味物质，但对牛油整体风味贡献不大，也验证了上文提出的推论：醇类化合物可能对牛油风味贡献较少。值得注意的是，(-)-柠檬烯具有柠檬香和柑橘香[34]，2-甲基萘具有强烈的刺激气味[35]，均为浓香型牛油独有的关键风味物质，而(-)-柠檬烯对浓香型牛油整体风味贡献最大，说明(-)-柠檬烯、2-甲基萘是浓香型牛油特征风味的重要来源，尤其是(-)-柠檬烯。

3 结论

本文围绕不同香型牛油的风味品质开展了一系列实验研究。从AV、PV、MDA和脂肪酸含量的分析发现，3种香型牛油PV值相同，AV、MDA值变化趋势与牛油风味香型变化存在一定关系。游离脂肪酸对AV、MDA值和牛油特征风味的形成有明确影响，其中9-(Z)-十八碳烯酸的含量可能对牛油风味具有较大的影响。电子鼻分析结果表明，LDA更能有效地区分不同香型的牛油风味，且浓香型和淡香型牛油之间风味物质差异较大。HS-SPME-GC-MS结合相对气味活度值(ROAV)法分析结果显示，3种香型牛油的挥发性风味成分有明显的不同且醛类物质贡献了大部分的香气成分，异戊醛、己醛、庚醛、辛醛和壬醛是造成不同牛油香气差异的主要原因，其中以异戊醛为代表。(E,E)-2,4-壬二烯醛对增强清淡香气有特殊贡献，戊醛在一定程度上增强了浓香型牛油香气。除醛类物质外，右旋萜二烯与淡香型牛油清淡香气相关，(-)-柠檬烯、2-甲基萘是浓香型牛油特征风味的重要来源，2-正戊基呋喃对牛油整体风味也具有一定贡献，酯类化合物对浓香型牛油风味可能有特殊贡献。通过本实验的研究，一方面可以准确获知牛油的风味来源，初步得出醛类化合物为关键牛油风味香气物质，进一步为研究牛油风味形成机制提供理论基础；另一方面有助于研究强化牛油特征风味的新型工艺，开发出风味更加丰富、品质更优的牛油系列产品。

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