葡萄糖酸-δ-内酯(gluconic acid zlactone，GDL)豆腐是以GDL为促凝剂制作的豆腐，由于其中含有大量水分和蛋白质，极易腐败变质。将其冷冻制成冻豆腐后，复水后却没有传统豆腐的细腻感，并有海绵体形成，影响了口感[1]。且冻豆腐经常需要在冷链内储藏或运输。将豆腐制备成冷冻干燥豆腐后，不仅可满足其运输上的需求，还可以降低储存难度。

近年来，由于超声处理可对大豆蛋白改性并且无外源性化学物质生成，对环境不造成污染而引起人们的广泛关注。HU等[2]研究发现，高场强超声处理可提高β-伴大豆球蛋白的表面疏水性、溶解性，乳化活性及乳化稳定性。O’SULLIVAN等[3]研究发现，与未经超声处理的乳液相比，经超声处理得到的大豆蛋白乳液的粒径更小。HU等[4]研究发现，高场强超声波可以降低大豆分离蛋白溶液的粒径，提高葡萄糖酸内酯诱导大豆分离蛋白凝胶的凝胶性。LIN等[5]采用超声波处理豆浆替代传统工艺中的煮浆和冷却过程，结果发现超声波处理可提高GDL豆腐的硬度。ZHANG等[6]研究发现，高场强超声可增强分子间ε-(γ-谷酰基) 赖氨酸异肽键、二硫键和疏水相互作用，从而使谷氨酰胺转移酶大豆蛋白冷凝胶的微观结构均匀、致密，并提高其凝胶强度、硬度和持水性。齐宝坤等[7]研究发现，适宜的超声处理可降低豆乳体系的粒径，提高豆腐的持水性，改善冷冻干燥豆腐的微观结构并提高其复水性。HARNKARNSUJARIT等[8]采用液氮处理制备出了具有较好微观结构及复水效果的冷冻干燥豆腐。

低场核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)是一种无损、非侵入性测量高含水量样品水分分布状态及移动性的工具[9]。LF-NMR在肉类及植物中的运用较多，但近年来已有研究者将其运用于豆腐水分分布的分析中，如LI等[10-11]利用LF-NMR分别研究了凝固剂种类对豆腐水分分布影响以及高压均质处理对南北豆腐水分分布的影响。朱巧梅等[12]研究了新型油包水盐卤凝固剂对大豆蛋白凝胶中水分变化的影响。LI等[13]采用LF-NMR研究了冷冻时间对豆腐水分分布的影响。但超声制浆工艺对鲜豆腐以及复水冷冻干燥豆腐的水分分布鲜有人进行研究。

鉴于此，本文通过对豆浆进行超声处理(0、100、200、300、400，500 W，10 min)并制备成GDL填充豆腐，联合短时液氮处理和真空冷冻干燥技术制备冷冻干燥豆腐，利用LF-NMR及扫描电子显微镜研究超声制浆工艺对复水冷冻干燥豆腐水分分布及微观结构的影响，以期为将超声制浆工艺运用于冷冻干燥豆腐生产中提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆(蛋白质含量42.8%，脂肪含量18.2%)，购自，当地超市；消泡剂，郑州大志食品有限公司；葡萄糖酸-δ-内酯，江西新黄海医药食品化工有限公司；液氮，购自当地液氮公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ-2型组织捣碎匀浆机江，苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；JY92-IIN超声波细胞粉碎机，宁波新艺超声设备有限公司；DK-S12数显恒温水浴锅，上海三发科学仪器有限公司；FD-5型真空冷冻干燥机，北京博医康技术公司；SU8020冷场扫描电子显微镜，日本日立公司；Mq-20低场核磁共振分析仪，德国布鲁克公司。

1.3 方法

1.3.1 超声处理豆浆

将新鲜大豆清洗干净，以1∶5(g∶mL)的比例浸泡于蒸馏水中15 h，将浸泡好的大豆以1∶5(g∶mL)的豆水比磨浆，用棉布过滤2次后加入0.1 g/L的消泡剂消除泡沫。由于豆浆的煮浆时间为10 min，因此本试验以不同超声功率对豆浆进行10 min超声处理。分别取适量的豆浆于超声波细胞破碎仪中，液面浸没变幅杆3 cm，分别在超声功率0、100、200、300、400，500 W条件下超声10 min，工作时间和间歇时间均为4 s，以冰水浴控制超声温度为(20±2)℃。

1.3.2 冷冻干燥豆腐的制作工艺

HARNKARNSUJARIT等[8]的方法制备冷冻干燥豆腐，略作修改。

将处理后的豆浆煮沸10 min，冷却至80℃时加入3.0 g/L的GDL，充分混匀后置于80℃恒温水浴锅中保温30 min得到豆腐花，随后压制成GDL豆腐(压力为0.01 kg/cm2)。将GDL豆腐切成10 mm×10 mm×9 mm的豆腐块，置于-196 ℃液氮中保存15 min后转移至-40 ℃冰箱冷冻24 h制成冷冻豆腐。随后利用真空冷冻干燥机处理得到冷冻干燥豆腐。

1.3.3 冷冻干燥豆腐复水处理

复水处理参考HARNKARNSUJARIT等[8]的方法。将冷冻干燥豆腐置于25 ℃蒸馏水中浸泡100 min后取出，用滤纸擦干表面水渍用于后续实验。

1.3.4 析水率的测定

豆腐持水性的测定参考AND等[14]和HARNKARNSUJARIT等[8]方法。取质量约3 g刚制备好的鲜豆腐或复水豆腐样品于离心管中，在3 000 r/min的条件下离心30 min，离心结束后吸干其表面水分后，按公式(1)计算样品的析水率：

析水率/%×100

(1)

式中：m1，离心前样品的质量，g；m2，离心后样品的质量，g。

1.3.5 低场核磁共振

根据LI等[10]的方法利用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列测定鲜豆腐及复水豆腐的横向弛豫时间(T2)。将约3 g样品放入核磁管中，随后放入分析仪中检测。CPMG序列采用的参数：质子共振频率为22.6 MHz，回波个数C0=3 000，重复扫描次数NS=16，半回波时间TE=0.15 ms。利用CONTIN软件调用CPMG序列反演，记录每个峰时间常数T2i(峰顶时间)及其所占面积分数M2i用于后续分析。

1.3.6 扫描电镜的测定

将复水冷冻干燥豆腐(下文简称复水豆腐)及鲜豆腐采用2.5%(体积分数)的戊二醛进行固定，固定时间为24 h。随后经乙醇梯度洗脱、叔丁醇置换，冷冻干燥处理后，采用离子溅射方法镀金，镀金的条件为15 kV，15 mA，1.5 min。然后将样品置于扫描电子显微镜(10 kV，100 Pa)下观察其显微结构，鲜豆腐图像10 000倍放大，复水豆腐图像1 000倍放大。

1.4 数据分析

所有数据均重复实验3次，结果表示为±s。数据统计分析采用SPSS 20软件对数据进行方差分析(analysisof variance，ANOVA)，P<0.05为差异显著。绘图采用Origin 2018软件。

2 结果与分析

2.1 超声制浆工艺对鲜豆腐及复水豆腐持水性的影响

凝胶的析水率可反映其持水性的强弱，析水率越低，则凝胶的持水性越强。由图1可知，当超声功率为0～300 W时，2种豆腐的析水率随超声功率的增强而逐渐降低，这可能是由于适宜的超声处理可提高豆浆体系内蛋白的溶解性，降低蛋白和脂肪等物质的粒度，使其形成更加均一的空间结构，而这种空间结构可能会有益于凝胶对水分子的绑定[15]。前期实验结果[7]表明，豆浆的平均粒径随超声功率的增强而呈先降低后增大的趋势，当超声功率为300 W时，豆浆的平均粒径最小。WU等[16]研究发现提高蛋白质的溶解性、降低其平均粒径可增强凝胶的持水性。KAO等[17]研究发现，较小的孔隙可以更牢固地保留水分子。当超声功率大于300 W时，2种豆腐的析水率逐渐增大，这可能是由于过高的超声功率致使豆浆体系内部分蛋白发生聚集，形成大的蛋白质聚合物，使豆腐内部存在较大的空隙，从而使水分更易从豆腐内部析出。HU等[4]研究发现，大豆蛋白粒径较大时会导致凝胶网络结构内形成大的孔洞，进而促进水分子的释放，降低凝胶持水性。由图1可知，复水豆腐的析水率显著高于鲜豆腐(P<0.05)，这可能是由于鲜豆腐在预冷冻过程中，水分迅速冻结形成冰晶，体积变大膨胀，经冷冻干燥处理后，冰晶升华后留下大小不一的孔洞，改变了豆腐的微观结构，进而使复水豆腐孔洞的尺寸变大(如图5和图6)，从而降低了对水分子的保留率。

图1 超声制浆工艺对鲜豆腐及复水冷冻干燥豆腐
析水率的影响
Fig.1 Effects of ultrasound pulping process on the water
separating proportion of fresh tofu and rehydrated
freeze-dried tofu

2.2 超声制浆工艺对鲜豆腐及复水豆腐水分分布的影响

由于LF-NMR可测量对分子运动敏感的T2弛豫时间，因此可采用LF-NMR估量凝胶体系中被蛋白质局部固定的不同水分子组分的流动性和结构特性[18-19]。图2-a、图2-b分别为超声制浆工艺对鲜豆腐和复水豆腐T2弛豫时间分布的影响，其LF-NMR衰减曲线拟合的T2`弛豫时间均分布为3个峰，分别对应为结合水(T2b，1.11～3.02 ms)、不易流动水(T21，13.35～217 ms)和自由水(T22，132.08～709.1 ms)[20]。LI等[11]研究发现，豆腐中油脂对水分弛豫信号的影响可以忽略，因此本部分讨论不考虑豆腐中油脂存在的影响，并根据研究结果对鲜、复水豆腐中3种水分作如下归类：T22组分为远离蛋白质结构的水，这部分水存在于豆腐基质中较大孔径的孔洞之中，受蛋白质结构影响较小；T21组分受蛋白质结构影响较大，这部分水存在于豆腐基质中一些较小的孔洞中；T2b组分则被认为是一些和蛋白质高分子紧密结合的水分，甚至可被认为是蛋白质的一部分。

豆腐的三维网络结构是由大小不一的孔洞和网孔组成，当豆腐经过冷冻处理后，这些孔洞和网孔形成更不均匀的微环境。此外，冰晶的形成和大豆蛋白的冷冻变性也促进了水中更复杂和多样的松弛行为[13]。对比图3、图4中数据可知，与鲜豆腐相比，复水豆腐的T21显著增大，这可能是由于鲜豆腐在冷冻过程中会形成大量的冰晶，而这些冰晶在升华后会形成大小不一的孔洞，从而使复水豆腐内部孔洞的孔径变大，结构变得疏松。YASUI等[19]研究发现，弛豫时间越长，水分子组分与大分子的结合越松散。与鲜豆腐相比，复水豆腐的M21显著降低(P<0.05)，M22显著增高(P<0.05)，这说明冷冻干燥豆腐经复水处理后，有更多的自由水进入到豆腐内部的网络结构中。

由图3、图4可知，当超声功率为0～300 W时，鲜豆腐和复水豆腐的T21弛豫时间和M21峰面积百分数均分别随超声功率的增大而显著降低和升高(P<0.05)，这可能是由于随着超声功率的增大，蛋白-蛋白之间的交联作用增强，蛋白质网络结构中的孔隙逐渐变小(如图5、图6)，进而将部分不易流动水(T21)包埋在这种微观结构中，从而使T21降低[12]。李腾[21]通过研究高压均质处理对南北豆腐水分分布的影响发现，致密的网络结构可缩短蛋白质网络表面与水分子的距离，从而使T21降低。此外，两种豆腐的M22均随超声功率的增大而显著降低(P<0.05)，这可能是由于超声处理可促使豆腐中的自由水向不易流动水转化[22]。还有可能是随着超声功率的增大，豆浆内蛋白质逐渐解聚，颗粒变小，疏水性基团暴露并促进二硫键的形成或交换，使得豆腐的网状结构逐渐变得致密，提供了更多可用于截流自由水组分的结构[23]。当超声功率大于300 W时，两种豆腐的T21、M21和M22均分别随超声功率的增大而呈显著增高、降低和增高(P<0.05)，这可能是由于随着超声功率继续增强，豆腐内部形成较大的孔洞，从而使更多的自由水进入到网状结构内部[12]。而两种豆腐的M22均随超声功率的增大而显著升高(P<0.05)，这可能是由于超声功率过高致使豆腐微观结构逐渐变得疏松，孔径变大(如图5和图6)，从而使得自由水组分含量升高。李腾[21]通过研究豆腐T2弛豫参数与其持水性之间的皮尔森相关分析，发现T21与凝胶的持水性呈显著正相关。以上结果进一步证明，适宜的超声处理可显著改善豆腐的持水性。

图3 超声制浆工艺对豆腐T2弛豫时间的影响
Fig.3 Effect of ultrasound pulping process on T2
relaxation time of tofu

图4 超声制浆工艺对豆腐各弛豫峰峰面积百分数的
影响
Fig.4 Effect of ultrasound pulping process on fraction of
each relaxation component of tofu

2.3 超声制浆工艺对鲜豆腐及复水豆腐微观结构的影响

对比图5和图6可知，复水豆腐的孔洞尺寸显著大于鲜豆腐，这可能是由于鲜豆腐在冷冻过程中涉及了水分由液体至固体的转变，而水结冰时其体积会膨胀变大，形成冰晶并对豆腐的微观结构产生不可逆的机械破坏[24]，从而使复水豆腐微观结构中孔洞的孔径变大[25]。而液氮的迅速冷冻效应使鲜豆腐在冻结过程中形成的冰晶体分布更接近于其原有体系中的水分分布情况，冰晶体小而密集[26]，从而可使复水豆腐极大程度上保持鲜豆腐原有的色泽、口感及特性。

由图5和图6可知，当超声功率为0～300 W时，鲜豆腐及复水豆腐内部孔洞的孔径均随超声功率的增大而逐渐减小，结构逐渐变得均一、致密。这可能是由于超声处理使豆乳内蛋白质发生变性，随后的加热处理进一步促进了蛋白质四级结构解离[27]，疏水基团暴露[5]，提高了蛋白质分子间的疏水相互作用。HU等[28]研究发现超声处理豆乳中蛋白质聚集体表面疏水基团的数量从根本上决定了豆腐的结构。而RENKEMA等[29]研究发现蛋白质分子的大小和形状可影响凝胶的微观结构。因此超声处理可通过降低豆乳体系的粒径来促使豆腐形成均一、致密的结构。当超声功率大于300 W时，静电引力和疏水区域的二硫键促使变性蛋白质发生聚集，形成大的蛋白质聚集体，降低蛋白质溶解度[28]，提高豆浆体系的平均粒径，从而使鲜豆腐及复水豆腐孔洞的孔径逐渐增大。

3 结论

通过研究不同超声功率(0、100、200、300、400，500 W)对鲜豆腐及复水冷冻干燥豆腐持水性、水分分布及微观结构的影响，得到如下结果：

(1)复水豆腐的析水率显著高于鲜豆腐(P<0.05)，这可能是由于鲜豆腐在预冷冻过程中，水分迅速冻结形成冰晶，体积变大膨胀，改变了豆腐的微观结构，进而使复水豆腐孔洞的尺寸变大，从而降低了对水分子的保留率。

(2)当超声功率为0～300 W时，超声功率的逐渐增强促进了疏水性基团的暴露，豆浆内蛋白质间相互作用增强，两种豆腐微观结构孔洞的孔径逐渐变小，持水性逐渐增强，T21弛豫时间逐渐缩短，M21逐渐增大。

(3)当超声功率大于300 W时，过高的超声功率促使变性蛋白质发生聚集，形成大的蛋白质聚集体，降低蛋白质溶解度，粒径增大，从而使两种豆腐微观结构孔洞的孔径逐渐增大，持水性下降，T21弛豫时间逐渐延长，M21逐渐降低，M22逐渐增大，自由水组分含量逐渐增高。

(4)适宜的超声处理(超声功率为300 W)可改善复水冷冻干燥豆腐的微观结构，降低其孔径的尺寸大小，使其结构变得均一、致密。

本实验具体分析了超声制浆工艺对鲜、复水豆腐水分分布及微观结构的影响规律，实验结果将为生产具有良好复水特性的冷冻干燥食品提供理论基础。

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