黑曲霉酸性蛋白酶EXPA的克隆表达与酶学性质解析

王鑫1,金鹏2*,宋鹏1,董自星2*,刘晓光2,王正祥1, 2

1(工业发酵微生物教育部重点实验室(天津科技大学),天津,300457)2(天津科技大学 化工与材料学院,天津,300457)

酸性蛋白酶在食品、酿造、饲料和皮革等行业具有重要的应用价值。然而,现有的酸性蛋白酶在50 ℃以上或pH>3.0时不稳定,限制了其应用范围。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIM F0510的酸性蛋白酶基因expA在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了重组菌GS115 (pPIC-expA)。摇瓶发酵条件下,重组酶EXPA的酶活为257 380 RFU/h。生物信息学分析的结果显示,该酶属于天冬氨酸蛋白酶A1A家族。酶学性质的研究表明,该重组酶的最适反应温度和pH分别为50 ℃和3.0;分别在4050 ℃或pH 2.53.5孵育1 h后,仍能保留80%左右的活力。Zn2+Ca2+Fe2+Mn2+对其活性有一定的促进作用;而Cu2+Co2+Fe3+EDTASDS则对其活性有显著的抑制作用。此外,重组酶EXPA对大豆分离蛋白、水溶性玉米蛋白和小麦水解蛋白均具有较好的水解作用。较好的耐热性和pH稳定性为EXPA在食品、饲料等领域的应用奠定了基础。

关键词 酸性蛋白酶;黑曲霉;分子克隆;酶学特征

第一作者:硕士研究生(金鹏副教授、董自星为共同通讯作者,E-mail: jinpeng@tust.edu.cn; dzx@tust.edu.cn)。

基金项目:天津市高等学校创新团队培养计划<酶与生物催化关键技术>(TD12-5002);天津市国际交流与合作项目(14RCG HSY00181)

收稿日期:2018-07-27,改回日期:2018-08-22

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.018387

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶,是酶学研究中较早也是最深入的一种酶[1]。其产量占世界酶制剂产量的75%,而其年销售额占全球酶制剂年销售总额的65%左右[2]。根据最适作用pH的不同,可以将蛋白酶分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。其中,酸性蛋白酶(即天冬氨酸蛋白酶,EC 3.4.23.-)是指具有较低的最适反应pH(pH 1.94.0)的蛋白酶。它们的活性中心含有2个天冬氨酸残基,其特征是在低pH条件下可以将2个疏水氨基酸打断,通过内切作用将动植物蛋白水解为小肽或氨基酸[3]。因此,酸性蛋白酶在食品、酿造、饲料、皮革、胶原纤维等工业制造领域具有广泛的应用价值[4-5]

酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物。根据作用方式不同,微生物酸性蛋白酶可分为两类:一类与胃蛋白酶相似,主要来源于青霉、曲霉和根霉;另一类与凝乳酶相似,主要产酶微生物是栗疫霉和毛霉等[5]。然而,商品化的酸性蛋白酶主要来源于黑曲霉、米曲霉和宇佐美曲霉等为数不多的菌株。此外,我国目前仍然沿用较传统的固体发酵法生产酸性蛋白酶。与国际同类产品相比,无论是酶活水平还是产品质量都存在一定差距,限制了其工业应用范围[6-7]。近年来,随着分子克隆技术的快速发展,为催化性能优良的酸性蛋白酶的开发及其大规模生产提供了有效的途径。

黑曲霉是酸性蛋白酶研究的重要研究对象之一。目前,黑曲霉中已报道的酸性蛋白酶有6个:PEPAa~PEPAd[8]、PEPA[9-10]和PEPE[11],但只有PEPA的酶学性质被解析。为此,本研究拟将酸性蛋白酶基因pepAc(本研究中命名为expA)在毕赤酵母中进行克隆表达,并对其酶学性质进行系统解析,为其大规模生产及工业应用提供物质基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及培养条件

黑曲霉(Aspergillus niger)CICIM F0510[12]以及大肠杆菌(Escherichia coli)JM109由本实验室保藏;毕赤酵母表达宿主GS115和表达质粒pPIC9K购于Invitrogen公司。重组质粒pPIC-expA、重组毕赤酵母工程菌GS115 (pPIC-expA)由本研究中构建与保藏。黑曲霉和大肠杆菌分别采用PDA和LB培养基进行培养;毕赤酵母培养所用的培养基YPD、MD、BMGY和BMMY等按照Invitrogen公司的Pichia Expression Kit进行配制。

1.1.2 试剂

限制性内切酶、Pyrobest DNA Polymerase以及T4 DNA连接酶等购自宝生物工程(大连)有限公司;质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒与胶回收试剂盒等购于Axygen公司;RNA抽提试剂盒和cDNA合成试剂盒均由Roche公司提供;胰蛋白胨、酵母抽提物和无氨基酵母氮源等购自英国OXOID公司。G418以及BODIPY® FL NHS Ester (Succinimidyl Ester)等购于Thermo Fischer Scientific公司;EnzChek® Protease Assay Kit购自Molecular Probes公司;大豆分离蛋白和小麦水解蛋白购自上海源叶生物科技有限公司、陕西森弗天然制品有限公司;水溶性玉米蛋白和BCA蛋白质定量检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组菌的构建

黑曲霉CICIM F0510总RNA的提取、cDNA的制备、PCR及其产物的纯化、酶切、连接、转化、转化子的筛选以及质粒的提取与纯化等均采用实验室常规方法进行[13];使用试剂盒时按照试剂盒说明书进行。其中,PCR过程中所使用的寡核苷酸引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其核苷酸序列为:expA_1:5’-GTAGCACCCACTCCCTCCCCG-3’;expA_2:5’--3’(下划线部分为人工引入的限制性酶切位点)。

1.2.2 重组酶的分泌表达与初步纯化

按照Pichia Expression Kit提供的方法进行操作。基本实验步骤如下:将毕赤酵母重组菌GS115(pPIC-expA)在YPD平板上进行纯化,挑选单菌落接种到25 mL YPD液体培养基中,于30 ℃、200 r/min培养至对数生长期(OD600值为2.0~6.0,约18~20 h)。然后按1%(V/V)的接种量接种于50 mL BMGY液体培养基中,于30 ℃、200 r/min培养至对数生长期,离心(4 ℃,8 000 r/min)5 min收集菌体。再将菌体用50 mL BMMY培养基稀释至OD600=1.0,于30 ℃、200 r/min继续培养。每隔24 h补加无水甲醇至终浓度为0.5%(V/V)以维持诱导,并同时取样测定酶活,直至酶活不再升高。发酵结束后,离心(4 ℃,8 000 r/min,10 min)收集发酵液,即为粗酶液。

采用盐析、透析等方法对重组酶EXPA进行初步纯化,并通过酶活测定和SDS-PAGE分析蛋白的纯化情况。其中,SDS-PAGE参照文献[14]进行,采用5%的浓缩胶和12%的分离胶。此外,蛋白浓度的测定采用BCA蛋白质定量检测试剂盒进行。

1.2.3 重组酸性蛋白酶的酶学性质解析

1.2.3.1 酸性蛋白酶的酶活测定

采用EnzChek® Protease Assay Kit[15]进行酶活测定。基本步骤:将带有荧光标记的酪蛋白溶于0.2 mL的磷酸盐缓冲液中(pH 7.0),充分混匀后,吸取50 μL的底物加入4.95 mL乳酸-酸钠缓冲液(pH 3.0)。取该溶液0.1 mL于黑色96孔板中,再加入经适当稀释的酶液0.1 mL,混匀,于40 ℃避光反应1 h。利用多功能酶标仪在λ(激发)∶λ(发射)=500 nm ∶530 nm下测定荧光强度。酶活定义:1 mL酶液在40 ℃、pH 3.0的条件下,1 h内水解带有荧光标记的酪蛋白后荧光值的增加量,为1个酶活力单位(RFU/h)。

1.2.3.2 最适作用温度和热稳定性的测定

将适当稀释的酶液分别在30、35、40、45、50、55和60 ℃下进行反应,并按照1.2.3.1的方法进行酶活测定。以酶活最高者为100%,计算相对酶活,从而确定该酶的最适作用温度。

将适当稀释的酶液分别放到40、45、50、55和60 ℃下保温2 h,每隔30 min取样,在冰上放置10 min后进行酶活测定(方法同1.2.3.1)。以未进行热处理的酶液的酶活为100%,计算相对酶活,以确定重组酸性蛋白酶的热稳定性。

1.2.3.3 最适作用pH值和pH稳定性的测定

用0.1 mol/L乳酸和0.2 mol/L乳酸钠配制pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5和4.0的缓冲液,将酶液分别用这些缓冲液稀释后进行反应,然后按照1.2.3.1的方法进行酶活测定。以酶活最高者为100%,计算相对酶活,从而确定重组酶的最适作用pH值。

分别将酶液在pH为2.0、2.5、3.0、3.5和4.0的乳酸-乳酸钠缓冲液中保温1 h(温度为50 ℃),并按照1.2.3.1的方法进行酶活测定。以未进行热处理的酶活为100%计算残余酶活力,从而确定酸性蛋白酶的pH稳定性。

1.2.3.4 金属离子和相关化学试剂对酶活的影响

在酸性蛋白酶与其底物进行反应的体系中,加入不同的金属离子或化合物,使其终浓度为1 mmol/L,然后按照1.2.3.1的方法进行酶活测定。以不加金属离子的反应体系的酶活定义为100%,表示不同金属离子或化合物下的相对酶活。

1.2.3.5 重组酶对不同蛋白质的水解作用

按照文献的方法[16],采用BODIPY® FL NHS Ester将大豆分离蛋白、小麦水解蛋白和水溶性玉米蛋白进行荧光标记,并将10 μg/mL标记后的蛋白作为重组酸性蛋白酶EXPA的底物,然后分别按照1.2.3.1的方法进行酶活测定。以10 μg/mL酪蛋白为底物时测定的酶活为100%,计算其他底物的相对酶活。

1.2.4 生物信息学分析

利用美国国立生物技术信息中心的网站(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询黑曲霉和其他来源酸性蛋白酶的氨基酸序列。然后利用在线软件SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/)对它们的信号肽进行预测。再采用软件Clustal X2和Bioedit对氨基酸序列进行比对和分析,并通过软件MEGA 5.0以Neighbour-joining法构建进化树[17],分析亲缘关系远近。

2 结果

2.1 黑曲霉酸性蛋白酶基因expA的克隆与分析

提取A. niger CICIM F0510的总RNA,并反转录成cDNA。以此cDNA为模板,采用引物expA_1和expA_2对酸性蛋白酶基因expA(Gene ID: 4985680)进行PCR扩增。PCR产物经Xba I酶切后,与经过SnaB I和Avr II双酶切的pPIC9K连接。再采用Pst I酶切验证重组质粒的正确性,获得了重组质粒pPIC-expA。核苷酸序列测定的结果表明,所克隆的expA基因具有完整的开放阅读框(ORF),且其核苷酸序列与A. niger CBS 513.88基因组公布的序列完全一致。其完整ORF大小为1 356 bp,编码451个氨基酸残基。

利用软件MEGA 5.0对不同来源的酸性蛋白酶进行系统进化树的构建,其结果如图1所示。

图1 进化树描述不同来源的酸性蛋白酶的遗传距离
Fig.1 Phylogenetic tree describing the genetic distances
among acid proteases from different microorganisms
线段的长度表示用MEGA 5.0计算的距离;分支节点上的数字代表bootstrap百分比,小于50%的bootstrap值未显示;黑色的圆圈表示已报道的酸性蛋白酶;括号中标注的是GenBank登录号;AoPEPA、RoPEP6、BcPEPA和AkPEPA分别来源于A. oryzaeRhizopus oryzae NBRC 4749、Botrytis cinereaA. kawachii NBRC 4308,
其他酸性蛋白酶均来源于A. niger

由图1可知,此进化树反映了不同来源的酸性蛋白酶之间的遗传距离,亲缘关系近的遗传距离短,而且聚集在一起。这些酸性蛋白酶之间的氨基酸序列相似度为19.36%~93.57%。其中,AnEXPA与AkPEPA的相似度最高,为93.57%。

进一步采用Clustal X2等软件将上述不同来源酸性蛋白酶的氨基酸序列进行比对与分析,结果如图2所示。除了AnPEPAb和AnPEPAd,其他酸性蛋白酶均含有信号肽。与其他酸性蛋白酶一样,EXPA属于天冬氨酸蛋白酶A1A家族,且具有天冬氨酸蛋白酶家族典型的活性位点基序:Asp-Thr-Gly (I)与Gly-H-H-Gly (II)形成第1个psi loop(其中,H为疏水性氨基酸);Asp-Thr/Ser (III)与Ile-H-Gly-Asp/Gln/Asn (IV)形成第2个psi loop(图2)[4]。它们还具有高度保守的酪氨酸残基,这个Tyr残基位于β发卡的loop中,悬于2个活性位点之上[18]。通过氨基酸序列比对可知,EXPA的活性中心为Asp115、Tyr223和Asp326。

2.2 重组酸性蛋白酶的分泌表达与分离纯化

将重组质粒pPIC-expA用Nco I进行线性化后,电转化入毕赤酵母GS115中,并通过G418平板筛选获得高拷贝转化子,命名为GS115 (pPIC-expA)。然后按照标准操作手册对其进行摇瓶发酵实验,发酵96 h后,重组酶的酶活为257380 RFU/h。进一步通过盐析、透析等对EXPA的粗酶液进行了初步纯化。蛋白电泳的结果(图3)表明,EXPA的分子量大小约为46.0 kDa,与其理论分子量大小(45.9 kDa)一致;而且其纯度也已基本达到酶学特征分析的要求。

2.3 重组酶EXPA的酶学性质解析

2.3.1 重组酶EXPA的最适作用温度与热稳定性

分别在不同温度(30~65 ℃)下测定重组酶EXPA的酶活,结果如图4-a所示。EXPA的最适作用温度为50 ℃,且在50~55 ℃范围内其相对酶活仍在80%以上。热稳定性的研究(图4-b)表明:在40和45 ℃孵育2 h后,EXPA的相对酶活残留80%以上;在50和55 ℃孵育2 h后,重组酶的仍能分别保留45%和30%左右的相对酶活,具有较好的稳定性;而在60 ℃孵育2 h后,其残留酶活只有10%。

2.3.2 最适反应pH和pH稳定性

分别将EXPA的酶液在不同pH值下(pH值2.0~4.0)进行反应,测定pH值对其酶活的影响,结果如图5-a所示。EXPA的最适作用pH为3.0;pH<3.0或>3.0时,其相对酶活明显下降。pH稳定性的研究结果(图5-b)表明,重组酶EXPA在pH 2.5~3.5之间的稳定性较好,孵育1 h后,其相对酶活仍维持在80%左右。

(*)保守的氨基酸序列;(:)保守的替换;(.)半保守的替换;虚线表示空格;灰色部分标注信号肽;活性位点用方框标出;
五角星标出的是保守的Tyr残基
图2 不同来源酸性蛋白酶的氨基酸序列比对
Fig.2 Multiple sequence alignment of acid proteases from different microorganisms

M-蛋白质分子量标准;1-粗酶液;2-纯化后的EXPA
图3 SDS-PAGE分析重组酸性蛋白酶EXPA的纯化情况
Fig.3 SDS-PAGE analysis on the purification of
recombinant acid protease EXPA

图4 温度对EXPA的活性(a)和稳定性(b)的影响
Fig.4 Effects of temperature on the activity (a)
stability (b) of EXPA

图5 pH对重组酸性蛋白酶EXPA的酶活(a)和
稳定性(b)的影响
Fig.5 Effects of pH on the activity (a) and stability (b)
of recombinant acid protease EXPA

2.3.3 金属离子和化学物质对EXPA酶活的影响

在酶促反应体系中加入1 mmol/L不同的金属离子或化合物,研究其对EXPA酶活的影响,结果见表1。Zn2+、Ca2+、Fe2+和Mn2+对其活性均有轻微的促进作用,Cu2+、Co2+、Fe3+、EDTA以及SDS等会明显抑制EXPA的活性,而K+则对该重组酶的酶活没有明显影响。

2.3.4 重组酶EXPA对不同底物的水解能力

将不同来源的植物蛋白用BODIPY® FL进行荧光标记后,作为重组酸性蛋白酶EXPA的底物,研究它对这些蛋白质的水解作用。以EXPA对带有荧光标记酪蛋白的酶活为100%,计算相对酶活,结果如表2所示。EXPA对它们的水解能力大小如下:酪蛋白>大豆分离蛋白>水溶性玉米蛋白>小麦水解蛋白。

表1 金属离子及化合物对重组酶EXPA活性的影响
Table 1 Effects of metal ions and chemicals on the
activity of recombinant acid protease EXPA

金属离子或化学试剂相对酶活/%对照100.0±2.0K+100.4±0.6Cu2+90.1±2.0Fe2+105.0±2.0Ca2+108.7±2.0Co2+89.2±2.5Fe3+75.9±1.0Zn2+104.9±1.2Mn2+109.2±1.2EDTA95.3±1.5SDS59.6±0.9

表2 重组酸性蛋白酶EXPA对不同蛋白质的水解作用
Table 2 Hydrolysis of different proteins by recombinant
acid protease EXPA

底物相对酶活/%酪蛋白100.0±1.7大豆分离蛋白57.6±2.3小麦水解蛋白31.2±1.1水溶性玉米蛋白49.9±1.9

3 讨论

酸性蛋白酶是一类具有复杂理化性质的酶,不同微生物分泌的酸性蛋白酶虽具有一些共同的性质,但在最适反应温度、热稳定性、最适反应pH以及pH耐受性方面均存在一定的差异。不同的金属离子及其浓度对酸性蛋白酶的影响也不同。目前,用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶,此类酶不耐热,当温度达到50 ℃以上时很不稳定,且其最适作用pH值为3.0左右,当pH值升高时,其酶活会明显降低,从而限制了酸性蛋白酶的应用[5]。本研究通过分子克隆技术成功将黑曲霉CICIM F0510的酸性蛋白酶基因在毕赤酵母中进行了分泌表达,所获得的重组酶EXPA的最适作用温度以及pH值分别为50 ℃和3.0;在55 ℃孵育2 h后,其残留酶活仍有30%左右,而且在pH值3.5(50 ℃)孵育1 h,它仍能保持80%左右的相对酶活(图4和图5)。与AnPEPA[10]、RoPEP6[19]、AoPEPA1[20]等大多数霉菌酸性蛋白酶相比,EXPA具有较好的pH和热稳定性,这拓宽了其应用范围。此外,Ca2+和Mn2+是重组酶EXPA的激活剂,而Cu2+、Fe3+则对其酶活具有抑制作用,这与它们对酸性蛋白酶SAP6[21]和rPrA[22]酶活的影响一致。

由于饲用酶的催化反应是在畜禽消化道内进行的,故其作用条件必须与动物消化道的生理条件相适应。通常猪和家禽消化道的温度为40 ℃左右,胃和小肠的pH值分别为1.5~3.5和5.0~7.0[23]。这与重组酸性蛋白酶EXPA的理化性质相吻合。此外,EXPA还对大豆分离蛋白、水溶性玉米蛋白和小麦水解蛋白等具有较好的水解作用(表2),所以该重组酶在动物饲料方面可能具有潜在的应用价值。后续将进一步通过体外法甚至动物实验对该重组酶水解蛋白饲料的效果进行评价,挖掘其可能的应用价值。

本研究虽然成功将酸性蛋白酶EXPA在毕赤酵母中进行了克隆表达,但其表达量仍不是很高,采用国标(GB/T 23527-2009)法测得其酶活为8.76 U/mL(比酶活为17.81 U/mg,数据未显示),远低于AnPEPA和AoPEPA1的酶活(分别为370 U/mL[10]、43.1 U/mg[20])。后续将通过发酵条件优化等方法,进一步提高EXPA的表达量,以期实现其大规模生产,并为其应用奠定良好的基础。

综上所述,本文通过分子克隆与遗传重组技术成功将黑曲霉酸性蛋白酶基因expA在毕赤酵母中进行了分泌表达与酶学特性研究。重组酶良好的理化性质及其对大豆分离蛋白、玉米水溶蛋白和小麦水解蛋白的水解作用,为其在饲料等行业的应用提供了可能。

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Cloning, expression and biochemical characterization of a novel acidprotease EXPA from Aspergillus niger

WANG Xin1,JIN Peng2*,Song Peng1,Dong Zixing2*, LIU Xiaoguang2,WANG Zhengxiang1, 2

1(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education (Tianjin University of Science and Technology),Tianjin 300457,China) 2(College of Chemical Engineering and Materials Science,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

ABSTRACT Acid protease has wide applications in foods, brewing, feeds, and leather industries. However, current acid proteases are unstable when the temperature or pH values are higher than 50 ℃ or 3.0, respectively, which restricts their applications. Thus, acid protease encoding gene expA from Aspergillus niger CICIM F0510 was successfully cloned and expressed in Pichia pastoris, and the recombinant strain GS115 (pPIC-expA) was generated in this study. In shaking flask experiments, the activity of recombinant enzyme EXPA was 257 380 RFU/h. Bioinformatics analysis showed that this enzyme belonged to family A1A of aspartic proteases. The optimal temperature and pH of EXPA were 50 ℃ and 3.0, respectively. After incubating at 40-50 ℃ or pH 2.5-3.5 for 1 h, the recombinant enzyme still retained more than 80% of its maximum activity. Zn2+, Ca2+, Fe2+, and Mn2+ enhanced EXPA activity, whereas Cu2+, Co2+, Fe3+, EDTA, and SDS had significant inhibitory effects on EXPA activity. Besides, EXPA also hydrolyzed soybean protein isolates, water-soluble corn protein, and wheat protein. Good thermostability and pH stability of EXPA provide a solid foundation for its applications in food and feed industries.

Key words acid protease; Aspergillus niger; molecular cloning; enzymatic properties