豆杆，又称豆筋，豆棒，是川渝地区具有地方特色的非发酵豆制品。传统豆杆制品烹调前需浸泡4 h以上，食用不便。免泡豆杆是将传统豆杆制品进行预浸泡复水后，真空包装制备的新型豆制品，节约了消费者浸泡复水消耗的时间，深受消费者喜爱，消费市场潜力大。然而免泡豆杆中营养物质丰富，水分含量高，极易发生微生物腐败变质，尤其是残留的耐热性极强的芽孢细菌[1-2]。目前生产中主要采用传统热杀菌处理，不仅难以彻底杀灭耐热细菌，同时强度过高的杀菌条件导致褐变、弹性下降等产品劣变现象，消费者接受度大大降低。因此，采用单一的热杀菌方式难以保障免泡豆杆良好品质和较长货架期。
使用广谱高效、低毒、天然的防腐剂来延长非发酵豆制品货架期，是近年来的研究热点之一[3]。乳酸链球菌素(Nisin)是一种高效、稳定、安全的天然防腐剂，可抑制大多数革兰氏阳性细菌，并对芽孢杆菌的芽孢有强烈的抑制作用[4]。ε -聚赖氨酸能抑制细菌、真菌和耐热芽孢杆菌[5]，具有安全高效，耐高温的优点。山梨酸及其钾盐，能够抑制食品中脱氢酶活力，阻止脂肪酸氧化和脱氢，可有效抑制食品中细菌生长繁殖，且易被人体代谢分解，是目前使用广泛的一种安全、高效的防腐剂[6]。
本课题组从腐败免泡豆杆中分离获得了4株优势腐败菌，均属于耐热性较强、蛋白酶分泌能力较强的芽孢杆菌属[7]。为抑制腐败菌生长繁殖导致豆杆腐败变质，本实验选取乳酸链球菌素(Nisin)、ε -聚赖氨酸和山梨酸钾为抑菌剂，以最低抑菌浓度结合抑菌率指标，评价其对优势腐败菌的抑菌能力，并采用响应面法进行复配抑菌剂优化，并考察比较复合抑菌剂在不同应用方式与条件下的保鲜效果，以期为延长免泡豆杆货架期，维持良好品质提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
豆杆：四川山古坊食品有限公司提供。
腐败菌：解淀粉芽孢杆菌DY1a、DY1b，枯草芽孢杆菌DY2a、DY3，保存于四川农业大学食品学院。
抑菌剂：山梨酸钾，购自成都市科龙化工试剂厂；乳酸链球菌素、ε -聚赖氨酸，购自郑州博研生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
YXQ-LS-50 SI立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2FD洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；GZ-150-M霉菌培养箱，韶关市广智科技设备有限公司；QL-901涡旋振荡器，其林贝尔仪器制造公司；ZWY-211B恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；PHS-3C酸度计，上海佑科仪器仪表有限公司；Varioskan Flash全波长多功能酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司；DZ400-2C真空包装机，上海青葩包装机械有限公司；TA.XTPlus物性分析仪，英国SMS公司。
1.3 方法
1.3.1 菌悬液的制备
将腐败菌接种于LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min 振荡培养12 h，调整菌悬液细胞数量至106 CFU/mL。
1.3.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定
采用二倍稀释法，抑菌剂用无菌水溶解配制并用LB液体培养基稀释至不同质量浓度：Nisin 12.5～400 μg/mL，ε -聚赖氨酸12.5～400 μg/mL，山梨酸钾100～3 200 μg/mL，添加100 μL至96孔板，再加入100 μL腐败菌菌悬液，37 ℃培养24 h后用酶标仪测定OD600，将培养前后OD600无显著性变化的防腐剂浓度确定为最低抑菌浓度，各处理重复3次。
1.3.3 抑菌剂对腐败菌DY3抑菌率的测定
根据MIC实验结果，并参考GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[8]中的相关规定确定3种防腐剂的最大使用限量及适宜范围，以最难抑制的枯草芽孢杆菌DY3为指示菌，按1.3.2方法在96孔板中培养并测定OD600。未添加抑菌剂作为空白组。按公式(1)计算抑菌率[9]：
抑菌率
(1)
Nisin质量浓度为5、10、15、20、25、30 μg/mL，并添加50 μg/mL ε-聚赖氨酸和400 μg/mL山梨酸钾。ε-聚赖氨酸质量浓度为20、30、40、50、60、70 μg/mL，并添加20 μg/mL Nisin和400 μg/mL山梨酸钾。山梨酸钾质量浓度为250、300、350、400、450、500 μg/mL，并添加20 μg/mL Nisin和50 μg/mL ε-聚赖氨酸。
1.3.4 响应面法优化复配抑菌剂配比及验证
根据抑菌率实验结果，进行3因素3水平Box-Behnken响应面设计，实验因素及水平见表1。根据响应面法优化结果，配制复配抑菌剂，测定其24 h的抑菌率，验证复配抑菌剂的抑制效果。
表1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels used in response surface experiments
1.3.5 复配抑菌剂对免泡豆杆的防腐保鲜效果评价
(1)样品的制备与处理
为考察复配抑菌剂的添加方式及与热杀菌配合使用效果，设计6组不同实验处理：对照组：豆杆复水后真空包装贮藏；热杀菌组：豆杆复水，真空包装，100 ℃水浴杀菌20 min后冷却贮藏；抑菌剂添加组：向复水豆杆中直接添加复配抑菌剂，真空包装贮藏；抑菌剂复水组：将豆杆浸没于复配抑菌剂水溶液复水4 h，真空包装贮藏；抑菌剂添加+热杀菌组：向复水豆杆中直接添加复配抑菌剂，真空包装，100 ℃杀菌20 min冷却贮藏；抑菌剂复水+热杀菌组：将豆杆浸没于复配抑菌剂水溶液复水4 h，真空包装，100 ℃杀菌20 min冷却贮藏。以上各组处理的复水温度为20～23 ℃，复水时间4 h后，包装规格为80 g/袋，贮藏温度25 ℃。
(2)样品感官评价
参考郑丽君等[7]建立的感官评价方法，由10人组成的感官评价小组从色泽、气味、质地方面对实验豆杆样品进行感官评价。
(3)挥发性盐基氮(TVB-N)测定
按照GB 5009. 228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[10]测定。
(4)芽孢杆菌数量测定
称取25.0 g样品，无菌条件下充分研磨后转入加有225 mL质量分数0.85%无菌生理盐水的锥形瓶，200 r/min振荡30 min，静置5 min，用质量分数0.85%无菌生理盐水10倍梯度稀释，选择3个适宜稀释梯度，各取1 mL稀释液，采用倾注法，利用锰盐营养琼脂选择性培养基，37 ℃培养48 h对样品中的芽孢杆菌进行平板计数。
(5)pH值测定
称取25.0 g样品，充分研磨后转入装有225 mL蒸馏水的锥形瓶，200 r/min振荡30 min，静置10 min后过滤，用pH计测定滤液，每个条件测量3次，测量结果取平均值。
(6)质构测定
将样品切割成2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm，参考郑丽君等[2]方法并做修正。测定条件：TPA模式，P/5平底柱形探头，测前速度2.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s，测后速度5.0 mm/s，2次下压停留间隔时间5 s。选取中心位置进行测定样品硬度、弹性、咀嚼性参数[11]，每组样品重复5次。
1.4 数据处理
实验数据采用SPSS 20.0软件进行显著性检验与Duncan多重比较分析，Design-Expert 10.0.7.0进行响应面法数据分析，Origin 9.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 三种抑菌剂MIC测定结果
由表2可知，不同抑菌剂对4株优势腐败细菌的MIC值差异较大。ε -聚赖氨酸和Nisin的抑菌能力整体强于山梨酸钾。不同受试腐败菌对山梨酸钾和Nisin的敏感度不同，其中DY1b和DY3对山梨酸钾的敏感度较弱，MIC值高于其他2株腐败菌；DY3对ε -聚赖氨酸的敏感度最弱，MIC为400 μg/mL。不同腐败菌对抑菌剂敏感度可能与菌株遗传特性有关。
表2 不同防腐剂对各优势腐败菌的MIC值
Table 2 MIC value of different preservatives for each dominant spoilage organism
2.2 不同浓度抑菌剂对腐败菌DY3抑菌率
由图1可知，Nisin、ε-聚赖氨酸和山梨酸钾对枯草芽孢杆菌DY3的抑菌率均随添加浓度的增大而提高。
图1 不同浓度抑菌剂对枯草芽孢杆菌DY3的抑制效果
Fig.1 The inhibition effect of different concentrations of bacteriostatic agents on Bacillus subtilis DY3
注：不同小写字母表示不同浓度抑菌剂抑菌率有显著性差异(P<0.05)。
根据GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[8]和其附录A.2中规定同一功能的食品添加剂(包括防腐剂)在混合使用时，各自用量占其最大使用量的比例之和不应超过1，根据图1结果，综合考虑响应面优化实验的因素水平：Nisin：17.5、20、22.5 μg/mL；ε -聚赖氨酸：50、55、60 μg/mL；山梨酸钾：375、400、425 μg/mL。
2.3 复配抑菌剂响应面法优化结果及验证
响应面设计与结果见表3。利用Design-Expert 10.0.7.0软件对表3中的试验数据进行多元回归拟合，获得以抑菌率(Y)为响应值的回归方程：
Y=88.311 99+6.123 75A+1.106 25B+3.002 50C+0.552 49AB-0.325 00AC+1.645 00BC-2.699 75A2-3.254 75B2+1.812 75 C2
对回归方程进行方差分析，结果见表4。根据回归方差分析显著性检验，Nisin和山梨酸钾在实验范围内对枯草芽孢杆菌DY3的抑制效应极显著(P<0.01)， 各因子交互作用不显著，该模型P<0.000 1，极显著，且失拟项不显著(P>0.05)，模型R2=0.932 4，
说明模型的拟合程度较好，自变量与指标值之间的线性关系显著，可以用于最佳抑菌率组合比例的预测。
表3 响应面试验结果
Table 3 The experiment result of response surface
表4 响应面实验方差分析
Table 4 The variance analysis of response surface
根据回归方程求得抑菌率极大值对应的因素水平，获得3种防腐剂的最佳复配比例为：Nisin 22.50 μg/mL、ε -聚赖氨酸57.54 μg/mL、山梨酸钾425.00 μg/mL。相比于单一防腐剂对枯草芽孢杆菌DY3的抑菌质量浓度：Nisin 200 μg/mL、ε -聚赖氨酸400 μg/mL、山梨酸钾1 600 μg/mL，复配抑菌剂各防腐剂用量显著减少，且根据最佳配比条件做3次重复验证实验，最后得到实际平均抑菌率为(94.22±0.35)%，抑菌效果十分明显。最佳复配比例抑菌剂对枯草芽孢杆菌DY3的抑菌率的理论值为97.06%，实际值与理论值基本上吻合，所得到抑菌剂配比比较准确可靠。
2.4 复配防腐保鲜剂应用效果评价
2.4.1 真空免泡豆杆贮藏期间感官评价结果
由图2可知，各组样品贮藏过程中感官评分逐渐下降，经过100 ℃ 20 min热杀菌处理的3组样品感官评分整体上均高于未热杀菌处理的3组样品。贮藏至第10天，未进行热杀菌处理的3组样品感官评分均降低至临界值以下，其中对照组样品评分降低至30分，严重腐败变臭，感官无法接受，单独使用抑菌剂的两组样品评分略高于对照组，但也出现较严重的腐败现象，仅热杀菌处理组样品感官评分虽然高于单独使用抑菌剂的两组样品，但其货架期只能保持6 d，抑菌剂复配结合热杀菌处理的2组样品感官评分均高于其他处理组，分值均>75分，处于感官临界值以上，属于可接受食用范围。结果表明，抑菌剂结合热杀菌能够较好延长产品货架期，维持较好的产品感官品质。
图2 不同处理条件免泡豆杆贮藏期间感官评价
Fig.2 Sensory evaluation changes of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃
2.4.2 挥发性盐基氮(TVB-N)值
挥发性盐基氮(TVB-N)是腐败微生物降解蛋白质的重要产物，是评价高蛋白食品新鲜程度的重要指标[12]，其值越高则表明样品蛋白质降解腐败程度越高。由图3可知，各组样品贮藏期TVB-N值均呈上升趋势。贮藏至第10天，对照组样品TVB-N值最高，为12.32 mg/100 g，其次是热杀菌组样品，添加有复配抑菌剂的4组均显著低于未加抑菌剂的2个对照组；抑菌剂结合100 ℃ 20 min热杀菌处理的2组样品TVB-N值低于其他各组，其中豆杆复水后添加抑菌剂，再热杀菌处理的样品TVB-N最低，为6.86 mg/100 g，远低于24.00 mg/100 g[13]。结果表明复配抑菌剂可有效抑制样品TVB-N的增加，延长样品的货架期，并且复配抑菌剂与热杀菌结合处理的抑制效果更显著。
图3 不同处理条件免泡豆杆贮藏期间TVB-N值变化
Fig.3 Total viable basic nitrogen values of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃
注：不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理样品TVB-N值有显著性差异(P<0.05)。
2.4.3 真空免泡豆杆贮藏期间芽孢杆菌数变化
由图4可知，未热杀菌处理的3组样品芽孢杆菌总数贮藏期整体呈上升趋势，且芽孢杆菌数量均高于经热杀菌处理的3组样品，主要是由于热杀菌处理杀死部分非耐热的细菌菌体，延缓了芽孢杆菌的增殖。第0天时，未经热杀菌的3组样品贮藏初期芽孢杆菌数为6.99 lgCFU/g，贮藏第0～4天过程中芽孢杆菌数明显增加，而第4天后由于免泡豆杆中营养物质被消耗减少，生物胺等腐败代谢产物积累，芽孢杆菌数量增加较缓慢[14]，结果表明，样品仅添加复配抑菌剂而不经热杀菌处理对芽孢杆菌增殖抑制效果并不明显，这与离体条件下的抑菌效果存在较大差距，可能原因是无论采取复水后添加还是使用抑菌剂溶液复水，包装袋内的复配抑菌剂并未均匀扩散分布于豆杆内部组织，同时豆杆样品中的芽孢杆菌可能由于生物被膜的保护作用，导致抑菌剂的实际抑菌效果并不明显。复配抑菌剂结合100 ℃ 20 min杀菌的2个处理组样品贮藏第4天以前的芽孢杆菌总数显著低于其他各组，表明抑菌剂结合热杀菌对样品中芽孢杆菌抑菌效果最好；其中抑菌剂复水结合热杀菌的抑菌效果要好于抑菌剂添加结合热杀菌处理组，可能是由于样品在复配抑菌剂溶液中复水，提高了抑菌剂组分在豆杆组织中渗透分布均一性，使抑菌效果明显增强，这与王敏等[15]研究蜂胶用于非发酵豆制品保鲜的条件优化及对菌落数的影响研究结果影响一致。而贮藏后期，热杀菌处理的3组样品芽孢杆菌总数无显著性差异，逐渐趋于相同。
图4 不同处理条件免泡豆杆贮藏期间芽孢杆菌数变化
Fig.4 Total Bacillus number change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃
注：不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理样品芽孢杆菌数有显著性差异(P<0.05)。
2.4.4 真空免泡豆杆贮藏期间pH变化
pH是评判豆制品品质高低的指标之一。由图5可知，贮藏期各组样品因腐败菌繁殖而产酸[16]，导致pH值均呈下降趋势，抑菌剂结合热杀菌对pH下降有显著抑制作用，其中采用抑菌剂溶液复水结合热杀菌处理的抑制效果最好。各组样品第6天均出现上升，可能是腐败菌利用样品中的碳水化合物产酸量减少而分解蛋白质的产胺量增多有关。
图5 不同处理条件免泡豆杆贮藏期间pH值变化
Fig.5 The pH value change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃
注：不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理样品pH值有显著性差异(P<0.05)。
2.4.5 真空免泡豆杆贮藏期间质构变化
质构特性作为食品重要的物理特性，是评判产品质量的重要依据[17]。由图6和图7可知，随着贮藏时间的增加，样品硬度和咀嚼性均呈上升趋势，这与贮藏期间样品受到化学和微生物作用，导致蛋白质分子内部化学键和作用力破坏，凝胶网状结构中的水分释放，促使水分向更自由的那部分水分转化[18]，样品失水而导致硬度和咀嚼性增加有关。抑菌剂结合热杀菌处理显著延缓样品硬度和咀嚼性的增加，有利于维持相对较好的品质特性。
图6 不同处理条件免泡豆杆贮藏期间硬度变化
Fig.6 The hardness change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃
注：不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理样品硬度有显著性差异(P<0.05)。
图7 不同处理条件免泡豆杆贮藏期间咀嚼性变化
Fig.7 The chewiness change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃
注：不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理样品咀嚼性有显著性差异(P<0.05)。
由图8可知，对照组样品贮藏期弹性逐渐降低，抑菌剂结合热杀菌处理样品弹性没有降低，反而具有一定的增强趋势，表明抑菌剂结合热杀菌处理可保持并改善样品弹性品质。
图8 不同处理条件免泡豆杆贮藏期间弹性变化
Fig.8 The springiness change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃
注：不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理样品弹性有显著性差异(P<0.05)。
综上，热杀菌处理可一定程度上起到良好的保鲜效果，复配抑菌剂结合+热杀菌处理样品大部分指标(包括感官整体评分、微生物数量、TVB-N、弹性、咀嚼性)均优于单独热杀菌处理，表明复配抑菌剂与热杀菌处理相结合，可提高免泡豆杆常规热杀菌处理的保鲜效果。
3 结论
Nisin和ε-聚赖氨酸对腐败菌的抑菌性能强于山梨酸钾，枯草芽孢杆菌DY3对ε-聚赖氨酸的敏感度弱与其他腐败菌株，MIC值高于其他腐败菌株。复配抑菌剂得到最佳配比为：Nisin 22.50 μg/mL、ε-聚赖氨酸57.54 μg/mL、山梨酸钾425.00 μg/mL，对枯草芽孢杆菌DY3的抑菌率为(94.22±0.35)%。
采用复配抑菌剂溶液复水，并结合100 ℃ 20 min热杀菌对免泡豆杆的抑菌保鲜效果最好。该方法处理可有效抑制样品中芽孢杆菌生长繁殖，延缓样品酸化和挥发性盐基氮的生成，较对照样品货架期延长4 d，并在6 d内维持免泡豆杆的良好的感官和质构品质，可为免泡豆杆工业生产抑菌保鲜提供技术参考。
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